彭俊華，葛鎖華，張歡妍，于雪冰，孫露陽

2 型糖尿?。═2DM）易感者或肥胖者多有胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）水平低下、血脂水平失衡、白細(xì)胞介素（IL）-12 分泌增多、胰島素抵抗（IR）等現(xiàn)象［1-2］。微小RNA（miRNA，miR）-146是一種多功能非編碼小分子RNA，在增強機體免疫反應(yīng)、減輕炎癥反應(yīng)、改善骨髓瘤的耐藥性方面起關(guān)鍵作用［3］。研究顯示，T2DM患者外周血單核細(xì)胞、血清miR-146a 水平較正常者普遍降低［4］，miR-146a表達(dá)降低與T2DM易感有關(guān)［5］。中醫(yī)認(rèn)為“脾”是人的免疫器官，“以脾論治”和“益氣健脾”可降低血脂水平、防治T2DM。參苓白術(shù)散有“健脾益氣”的功效，能改善糖尿病患者IR及炎癥反應(yīng)［6］。有研究顯示，高脂膳食喂養(yǎng)小鼠，敲除miR-146a 基因的小鼠較野生型小鼠表現(xiàn)為體質(zhì)量與體脂增加、血糖和血脂升高、肝硬化增多，表明miR-146a 具有抗脂肪形成作用［7］。參苓白術(shù)散是否通過影響miR-146a表達(dá)、減輕炎癥反應(yīng)來防治T2DM尚鮮見報道。另有研究顯示，二甲雙胍具有降血糖、降血脂作用［8］。因此，本研究采用中藥方劑參苓白術(shù)散聯(lián)合二甲雙胍治療T2DM 肥胖患者，觀察患者血清miR-146a、GLP-1、IL-12及血脂水平的改變，以期為中西醫(yī)聯(lián)合治療T2DM肥胖者提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2018 年10 月—2019 年12 月于江蘇大學(xué)附屬金壇區(qū)人民醫(yī)院診斷為T2DM肥胖患者86例。T2DM診斷按中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會的《中國2型糖尿病防治指南（2017 年版）》標(biāo)準(zhǔn)診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）≥25.0 kg/m2；空腹血糖≥7.0 mmol/L或隨機血糖≥11.1 mmol/L；有糖尿病的臨床癥狀；三者同時存在。排除標(biāo)準(zhǔn)：惡性腫瘤、心功能受損及肝腎功受損者；有結(jié)核、急性感染及自身免疫性疾病者；對參苓白術(shù)散或二甲雙胍過敏者；治療中依從性差及中途退出者。采用隨機數(shù)字表法將患者分為試驗組（參苓白術(shù)散聯(lián)合二甲雙胍治療）和對照組（二甲雙胍治療），每組43例，2組年齡、性別、BMI及病程差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（No.KY-2018-001）。

1.2 主要儀器與試劑 miRNA 提取試劑盒（Qiagen 產(chǎn)品，Netherlands），miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）檢測試劑盒（Qiagen產(chǎn)品，德國）。血清IL-12 和GLP-1 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海江萊生物科技有限公司產(chǎn)品，中國），三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒、AU5800 全自動生化儀（貝克曼公司產(chǎn)品，美國）及ABI 7500 實時qPCR 儀（賽默飛公司產(chǎn)品，美國）。二甲雙胍（常州制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字號H20054786），參苓白術(shù)散（北京同仁堂制藥廠，國藥準(zhǔn)字號Z11020755）。

Tab.1 The baseline data of two groups in T2DM patients表1 2組T2DM患者的基線資料

1.3 治療方案 對照組：二甲雙胍口服，0.5 g/次，3次/d。試驗組：在對照組用藥基礎(chǔ)上輔以參苓白術(shù)散口服，6 g/次，3次/d。2組均持續(xù)治療6個月。

1.4 檢測方法

1.4.1 標(biāo)本采集 2 組均于用藥開始前、用藥1 周、用藥3 個月和用藥6個月時采集空腹靜脈血3.0 mL各2份，4 000 r/min離心10 min分離血清，-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 qPCR 檢測血清miR-146a 血清miRNA 提取試劑盒提取總miRNA，當(dāng)RNA 光密度（OD）值OD260/OD280 為1.8～2.0 時，用miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒將miRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。20.0 μL 反轉(zhuǎn)錄體系含RNA 1.5 μL、MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL、10.0 mmol/L dNTP 2.0 μL、RNA 酶抑制劑0.5 μL、反應(yīng)緩沖液15 μL 于37 ℃60 min、95 ℃5 min 作用后-20 ℃保存。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成上游引物：miR-146a，5'-CCUCUGAAAUUCAGUUCUUCAG-3'；U6，5'-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3'。20.0 μL 的PCR 體 系 含cDNA 9.0 μL、上游引物1.0 μL、試劑盒中通用引物1.0 μL、Universal PCR Master Mix 7.0 μL、滅菌純水2.0 μL，在ABI 7500 qPCR 儀上進(jìn)行擴增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性15 s、55 ℃退火30 s、70 ℃延伸30 s，45個循環(huán)。以U6為內(nèi)參照，2-ΔΔCt法計算miR-146a的相對表達(dá)量。

1.4.3 ELISA 檢測血清IL-12 和GLP-1 水平 -80 ℃血清于37 ℃水浴10 min，混勻，按ELISA 檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，在全自動酶免分析儀上用450 nm波長測定血清IL-12和GLP-1的水平。

1.4.4 血脂水平檢測 按試劑盒的說明書將血脂配套試劑置于貝克曼AU5800 全自動生化儀測定血清TG、TC 和LDLC水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料用例表示，組間比較用χ2檢驗；非正態(tài)分布計量資料用中位數(shù)及四分位數(shù)M（P25，P75）表示，組間比較用Wilcoxon 秩和檢驗；正態(tài)分布計量資料用±s表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，重復(fù)測量資料采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，相關(guān)分析用Pearson相關(guān)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組miR-146a、GLP-1 及IL-12 比較 時間效應(yīng)與藥物干預(yù)效應(yīng)對T2DM 患者血清miR-146a、GLP-1 及IL-12 水平的影響存在交互作用（P＜0.05）。（1）組間比較。與對照組比較，試驗組在用藥3 個月后，miR-146a 和GLP-1 水平升高，IL-12 水平降低（P＜0.05）。（2）組內(nèi)比較。隨著藥物作用時間的延長，2 組miR-146a 和GLP-1 水平均 呈 升 高 趨勢，IL-12水平呈下降趨勢（P＜0.05），見表2。

Tab.2 The changes of miR-146a,IL-12 and GLP-1 in two groups of T2DM patients表2 2組T2DM患者miR-146a、IL-12和GLP-1的變化情況 （n=43，±s）

Tab.2 The changes of miR-146a,IL-12 and GLP-1 in two groups of T2DM patients表2 2組T2DM患者miR-146a、IL-12和GLP-1的變化情況 （n=43，±s）

a與對照組比較，P＜0.05；A與用藥前比較，B與用藥1周比較，C與用藥3 個月比較，P＜0.05；miR-146a：F組間=45.338，F(xiàn)時間=292.394，F(xiàn)交互=27.823；GLP-1：F組間=201.369，F(xiàn)時間=1 367.478，F(xiàn)交互=62.224；IL-12：F組間=15.797，F(xiàn)時間=132.032，F(xiàn)交互=8.304，均P＜0.05

組別對照組試驗組miR-146a用藥前0.52±0.08 0.53±0.11用藥1周0.64±0.12A 0.65±0.14A用藥3個月0.86±0.15AB 1.14±0.20aAB用藥6個月1.06±0.22ABC 1.48±0.23aABC組別對照組試驗組GLP-1（μmol/L）用藥前6.23±0.98 6.30±0.84用藥1周7.76±1.12A 7.81±1.38A用藥3個月11.93±1.52AB 14.35±1.57aAB用藥6個月15.12±1.27ABC 20.18±1.47aABC組別對照組試驗組IL-12（ng/L）用藥前141.1±20.6 140.0±17.5用藥1周122.9±19.8A 120.7±14.9A用藥3個月102.3±23.8AB 90.7±18.4aAB用藥6個月90.8±19.7ABC 66.5±15.1aABC

2.2 2 組血清TG、TC、LDL-C 水平及BMI 的變化比較 時間效應(yīng)與干預(yù)藥物對T2DM 患者的TC 和LDL-C 存在交互作用（P＜0.05），對TG、BMI 無交互作用。（1）組間比較。與對照組比較，試驗組血清TG和TC 水平在用藥6 個月時均有降低（P＜0.05）。2組各時點LDL-C 和BMI 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。（2）組內(nèi)比較。與用藥前比較，2 組的LDL-C 水平、TG水平分別于用藥1 周、用藥3 個月時開始下降（P＜0.05）；對照組TC 水平于用藥6 個月時降低，試驗組TC 水平于用藥3 個月開始下降（P＜0.05）；試驗組BMI 水平于3 個月時開始下降（P＜0.05），對照組各時間點BMI差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

Tab.3 The changes of serum levels of TG,TC,LDL-C and BMI in two groups of T2DM patients表3 2組T2DM患者血清TG、TC、LDL-C和BMI的變化 （n=43，±s）

Tab.3 The changes of serum levels of TG,TC,LDL-C and BMI in two groups of T2DM patients表3 2組T2DM患者血清TG、TC、LDL-C和BMI的變化 （n=43，±s）

a與對照組比較，P＜0.05；A與用藥前比較，B與用藥1周比較，C與用藥3 個月比較，P＜0.05；TG：F組間=5.741，F(xiàn)時間=37.253，均P＜0.05，F(xiàn)交互=0.459，P＞0.05；TC：F組間=6.535，F(xiàn)時間=54.578，F(xiàn)交互=4.512，均P＜0.05；LDL-C：F組間=3.950，P＞0.05，F(xiàn)時間=129.470，F(xiàn)交互=8.700，均P＜0.05；BMI：F組間=0.419，F(xiàn)交互=1.074，均P＞0.05，F(xiàn)時間=18.423，P＜0.05

組別對照組試驗組TG（mmol/L）用藥前2.45±0.26 2.42±0.28用藥1周2.39±0.23 2.37±0.24用藥3個月2.27±0.21A 2.21±0.23AB用藥6個月2.19±0.22AB 2.08±0.20aABC組別對照組試驗組TC（mmol/L）用藥前5.66±0.44 5.68±0.34用藥1周5.59±0.34 5.58±0.35用藥3個月5.39±0.39 5.31±0.25AB用藥6個月5.23±0.41AB 4.88±0.36aABC組別對照組試驗組LDL-C（mmol/L）用藥前3.01±0.40 2.98±0.27用藥1周2.91±0.40A 2.89±0.26A用藥3個月2.68±0.37AB 2.54±0.28AB用藥6個月2.46±0.32ABC 2.14±0.35ABC組別對照組試驗組BMI（kg/m2）用藥前26.58±1.05 26.65±1.19用藥1周26.49±1.00 26.54±1.15用藥3個月26.32±1.11 26.01±1.03AB用藥6個月26.00±0.98 25.63±1.02ABC

2.3 T2DM 患者血清miR-146a 與GLP-1、IL-12 及血脂間的相關(guān)性 T2DM患者血清miR-146a表達(dá)水平與血清GLP-1 水平呈正相關(guān)（r=0.874，P＜0.01），與IL-12、TC、TG、LDL-C 水平呈負(fù)相關(guān)（r 分別為-0.744、-0.456、-0.397 及-0.629，P＜0.01）。血清GLP-1 水平與IL-12、TC、TG 和LDL-C 水平呈負(fù)相關(guān)（r 分別為-0.807、-0.482、-0.452 及-0.693，P＜0.01）。

3 討論

肥胖、老齡可誘發(fā)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6 等炎性因子水平增高，以及miRNA 表達(dá)的改變，產(chǎn)生IR，從而導(dǎo)致T2DM［4，9］。因此，控制機體的體質(zhì)量、調(diào)節(jié)炎性因子和miRNA 的表達(dá)是防治T2DM的重要組成部分。

miRNA是由21～25個核苷酸組成的一類非編碼小分子RNA，參與機體損傷組織的修復(fù)、基因交換、抗原遞呈、免疫反應(yīng)及腫瘤轉(zhuǎn)移等生理和病理過程［7］。miR-146a 是一種與炎癥、肥胖有關(guān)的重要miRNA。研究顯示，糖尿病患者較健康體檢者血清miR-146a水平下降，血液中腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6（TNF receptor associated factor 6，TRAF-6）、核因子-κB（NF-κB）、IL-6、IL-1β、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）水平升高［4，10］。另有研究顯示，人體中miR-146a 表達(dá)水平降低者更易患T2DM［5］。體外實驗研究顯示，人源性皮下脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-146a或miR-146a 相似物后脂肪細(xì)胞中miR-146a 表達(dá)水平均升高，而IL-8和MCP-1水平明顯降低，表明miR-146a 可抑制脂肪細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，與治療前比較，2 組血清miR-146a 表達(dá)水平在治療后各時點均呈升高趨勢，2 組血清TC、TG 和LDL-C水平在治療6個月普遍降低，試驗組BMI在治療3個月后也呈降低趨勢，表明調(diào)整miR-146a水平可能是調(diào)節(jié)T2DM肥胖患者TC、TG和LDL-C水平的一種有效方案。Demirsoy等［12］用二甲雙胍治療土耳其白種人T2DM，發(fā)現(xiàn)患者miR-146a水平降低，與本研究結(jié)果相反，這可能與研究中所選用的人種不同有關(guān)，但并不排除因藥物的生產(chǎn)廠家不同致藥物的輔助成份不同、用藥劑量不同所致。

中醫(yī)認(rèn)為“脾”是人體的氣血生化之源，其免疫功能方面包含西醫(yī)的胸腺、淋巴和脾臟，“脾虛濕困”可致胰腺功能紊亂、T2DM 形成，且脾虛濕困型T2DM 患者大多肥胖，中藥方劑參苓白術(shù)散通過益肺氣、補脾胃、化濕止泄等途徑降低T2DM肥胖患者的血糖和血脂水平。參苓白術(shù)散能降低高脂膳食所致的非酒精性脂肪肝大鼠血清TNF-α、IL-1β 水平［13］。本研究結(jié)果顯示，試驗組在用藥3 個月時血清TC、TG 和BMI 開始降低，用藥1 周時LDL-C 水平開始降低，表明用藥治療達(dá)到一定時間才有降血脂效應(yīng)，與馬定耀等［6］結(jié)論相近；進(jìn)一步分析顯示，與對照組比較，試驗組在用藥6 個月時血清TC 和TG水平明顯降低，表明參苓白術(shù)散與二甲雙胍聯(lián)合治療的降TC和TG效果更佳。相關(guān)分析顯示，T2DM的miR-146a 水平與IL-12、TC、TG、LDL-C 呈負(fù)相關(guān)，提示血液中miR-146a 增高可能會降低TC、TG 和LDL-C 水平，考慮原因可能為中藥方劑參苓白術(shù)散通過提高miR-146a 水平，抑制炎性因子IL-12 的水平，從而改善高血脂狀態(tài)，起到防治糖尿病的療效。

在高糖環(huán)境中培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，用GLP 類似物利拉魯肽處理后能增加內(nèi)皮細(xì)胞中miR-146b 表達(dá)、降低細(xì)胞中炎性因子IL-6 和TNFα表達(dá)水平，表明利拉魯肽可通過增加miR-146b表達(dá)，改善炎癥和內(nèi)皮功能［14］。有研究建議，針對達(dá)不到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)的前期人群及T2DM 患者血清GLP-1 水平降低現(xiàn)象，使用外源性GLP-1 類似物如利拉魯肽能有效治療［11］。另有研究顯示，參芪復(fù)方制劑能有效改善糖尿病鼠的血脂水平，調(diào)節(jié)GLP-1、緩解炎癥反應(yīng)［15］。炎性因子IL-12可直接介導(dǎo)胰島小體的免疫及病理反應(yīng)，進(jìn)而影響糖尿病的發(fā)展與治療已成為共識。本研究顯示，與對照組比較，試驗組在用藥3個月后，GLP-1升高，IL-12降低，提示聯(lián)合用藥對T2DM肥胖患者GLP-1和IL-12影響更大，推測參苓白術(shù)散能協(xié)同二甲雙胍降低血中炎性因子IL-12 水平，促進(jìn)腸道分泌GLP-1，提升血GLP-1 水平，改善機體胰島小體的功能，從而更好地調(diào)節(jié)血TC和TG水平。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，T2DM肥胖患者血清GLP-1 水平與IL-12、血脂（TC、TG、LDL-C）水平呈負(fù)相關(guān)，提示機體血清GLP-1 增加與血脂水平和炎性因子IL-12降低有關(guān)，這與相關(guān)研究［15］結(jié)果相近。目前，中藥治療糖尿病的新關(guān)注點是“菌群-黏膜免疫-炎癥-糖尿病”軸［16］，而本研究表明，中藥參苓白術(shù)散通過多個靶點、多種途徑作用于機體，發(fā)揮降低TC和TG水平的效應(yīng)。

綜上所述，參苓白術(shù)散能協(xié)同二甲雙胍更好地調(diào)節(jié)T2DM 肥胖患者的TC 和TG 水平，其作用機制可能是通過“miR-146a、炎癥、GLP-1”多靶點和多途徑起作用，即上調(diào)miR-146a 的表達(dá)、減輕機體的炎癥狀態(tài)如降低炎性因子IL-12水平、恢復(fù)機體GLP-1分泌。