鄧永平，車鑫，艾瑞波，劉曉蘭，辛嘉英，王曉杰

1(齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾，161006)2(黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾,161006)3(哈爾濱商業(yè)大學(xué),省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱，150076)

類胡蘿卜素具有保護(hù)視力、抗氧化、提高免疫力等多種生理功效，在食品、醫(yī)藥和飼料等領(lǐng)域有重要應(yīng)用價值[1]。類胡蘿卜素種類繁多，類胡蘿卜素?cái)?shù)據(jù)庫(http://carotenoiddb.jp)目前提供了來自生命領(lǐng)域的691種生物中發(fā)現(xiàn)的1 158種類胡蘿卜素，但是人類能夠通過飲食吸收的只有約50種，其中β-胡蘿卜素、蝦青素、葉黃素和番茄紅素是常見的重要的類胡蘿卜素[2]。植物中提取和化學(xué)合成是類胡蘿卜素的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法。但是，這兩種方法都有局限性，植物源類胡蘿卜素受原料來源、生長周期等因素的影響[3]；化學(xué)合成的類胡蘿卜素安全性和環(huán)保性受到質(zhì)疑[4]。在這種情況下，來源于微藻、霉菌、酵母菌和細(xì)菌等微生物的天然類胡蘿卜素引起了人們極大的興趣[5]。

類胡蘿卜素分子結(jié)構(gòu)中存在類異戊二烯共軛雙鍵，因此具有較強(qiáng)的抗氧化活性，能夠保護(hù)細(xì)胞和組織免受活性氧破壞，對維持機(jī)體健康和預(yù)防疾病有重要作用[6]；但是同時也導(dǎo)致其易受氧氣、光和熱等環(huán)境因素的破壞，從而影響類胡蘿卜素的營養(yǎng)價值[5, 7]。因此，對類胡蘿卜素的抗氧化性和穩(wěn)定性進(jìn)行研究是指導(dǎo)應(yīng)用的基礎(chǔ)。本文在前期研究的基礎(chǔ)上[8]對好食脈孢霉(Neurosporasitophila)類胡蘿卜素進(jìn)行初步鑒定，并研究其抗氧化性和穩(wěn)定性，以期為好食脈孢霉類胡蘿卜素的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

好食脈孢霉(N.sitophila)，分離自發(fā)酵豆制品，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號CGMCC No.1836。

1.2 試劑和儀器

中性氧化鋁(100目)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；全反式β-胡蘿卜素，純度≥96%(HPLC)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、乙腈等試劑均為國產(chǎn)分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

賽默飛超高效液相色譜/四極桿-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo UltiMate 3000 UPLC/Q-Exactive Orbitrap MS)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；CF15RX Himac冷凍離心機(jī)，日立(中國)有限公司；TU-1901紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；層析柱(Φ2.6 cm×30 cm)，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 固態(tài)發(fā)酵制備類胡蘿卜素

固態(tài)發(fā)酵：250 mL三角瓶中加入5 g干醋糟、0.1 g干豆渣，干醋糟質(zhì)量與水的體積比為1∶3，添加0.8 mL番茄汁溶液(番茄洗凈榨汁，用蒸餾水配制體積分?jǐn)?shù)為5%的溶液)，體積計(jì)入培養(yǎng)基的加水量中。培養(yǎng)基初始pH值為5.5，接入好食脈孢霉孢子106個/g干基，在28 ℃培養(yǎng)120 h。

固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后在低于45 ℃的環(huán)境中干燥發(fā)酵產(chǎn)物至恒重。

1.3.2 類胡蘿卜素的提取和定量

依據(jù)參考文獻(xiàn)[8]制備好食脈孢霉類胡蘿卜素丙酮提取液，采用分光光度法測量類胡蘿卜素含量[8]。具體方法：稱取1 g干燥的發(fā)酵產(chǎn)物，加入10 mL濃度為1 mol/L的 HCl，常溫振蕩1 h(150 r/min)，取出沸水浴5 min，迅速冰浴冷卻，4 ℃、7 000 r/min離心10 min除去HCl，加入適量蒸餾水洗滌并離心，棄去上清液。加入20 mL丙酮提取沉淀中的類胡蘿卜素，4 ℃、7 000 r/min離心10 min，收集上清液，用丙酮重復(fù)提取，直至上清液無色，在455 nm處測吸光值。根據(jù)公式(1)計(jì)算類胡蘿卜素含量：

(1)

式中：B，每克發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素的質(zhì)量，μg/g；Aλmax，455 nm處的吸光值；D，樣品稀釋倍數(shù)；V，丙酮體積，mL；0.16，類胡蘿卜素的摩爾消光系數(shù)；m，樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 類胡蘿卜素的分離和初步鑒定

利用氧化鋁柱層析對好食脈孢霉類胡蘿卜素的丙酮提取液進(jìn)行初步純化。稱取約120 g氧化鋁(200～300目)，采用濕法裝柱，柱床高度26 cm，樣品質(zhì)量濃度5.67 mg/mL，上樣量為10 mL，經(jīng)過V(丙酮)∶V(石油醚)=4∶6的混合溶液洗脫，利用部分收集器定時收集流出液，離線測定455 nm處吸光值。

利用Thermo Ultimate 3000 UPLC/Q-Exactive Orbitrap MS對經(jīng)氧化鋁柱層析純化的類胡蘿卜素進(jìn)行初步鑒定。色譜柱：Thermo GOLD HYPERSIL (2.1 mm×50 mm, 1.9 μm)。液相色譜條件：D為100%乙腈，等度洗脫，流速0.3 mL/min；柱溫22 ℃，上樣量5 μL。電噴霧離子源正離子模式掃描。

1.3.4 類胡蘿卜素的抗氧化活性測定

用無水乙醇配制好食脈孢霉類胡蘿卜素、α-生育酚、丁基羥基茴香醚(butyl hydroxylanisole, BHA)、特丁基對苯二酚(tert-butyl hydroquinone, TBHQ)和β-胡蘿卜素溶液，質(zhì)量濃度均為1、2、3、4、5、6 μg/mL，以α-生育酚、BHA、TBHQ和β-胡蘿卜素為參照物，通過測定DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和總還原力評價好食脈孢霉類胡蘿卜素的抗氧化活性。

1.3.4.1 DPPH自由基清除率測定方法

將2 mL樣品溶液和2 mL DPPH溶液混合，避光反應(yīng)30 min，測517 nm處吸光值(Ai)；將2 mL樣品和2 mL無水乙醇混合，避光反應(yīng)30 min，測517 nm處吸光值(Aj)；將2 mL DPPH溶液和2 mL無水乙醇混合，避光反應(yīng)30 min，測517 nm處吸光值(A0)。DPPH自由基清除率的計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

1.3.4.2 羥自由基清除率測定方法

取2 mL樣品溶液，依次加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4和2 mmol/L的H2O2，靜置10 min后加入2 mL 6 mmol/L水楊酸，反應(yīng)30 min后在510 nm處測得吸光值A(chǔ)i；分別用蒸餾水代替水楊酸和樣品，在510 nm處測得吸光值A(chǔ)j和A0。羥自由基清除率的計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

1.3.4.3 總還原力測定方法

取2 mL樣品溶液，分別加入2 mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.6、0.2 mol/L)、2 mL的鐵氰化鉀溶液(10 g/L)，50 ℃保溫20 min后加入2 mL三氯乙酸溶液(100 g/L)，4 000 r/min離心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL蒸餾水和0.4 mL FeCl3溶液(1 g/L)，50 ℃保溫10 min，測定700 nm處的吸光值。以蒸餾水代替樣品作為對照。

1.3.5 類胡蘿卜素的穩(wěn)定性

1.3.5.1 光照對類胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響

取類胡蘿卜素丙酮提取液10 mL，置于黑暗、自然光、日光燈 (功率40 W，距離20 cm)環(huán)境中，25 ℃放置3、12、24、36、48、60、72 h 后取樣，測定455 nm處吸光值，以黑暗保存3 h為對照計(jì)算類胡蘿卜素的相對含量。

1.3.5.2 溫度對類胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響

取類胡蘿卜素丙酮提取液10 mL，分別于4、25、50、80 ℃條件下避光保存0、4、8和20 h，測定455 nm處吸光值，以每個溫度下0 h為對照計(jì)算類胡蘿卜素的相對含量。

1.3.5.3 金屬離子對類胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響

將類胡蘿卜素丙酮提取液分別與等體積KCl、NaCl、FeCl3、MgCl2、CaCl2、BaCl2、CuSO4溶液混合，使各金屬離子在混合體系中的終濃度為50 mmol/L，用丙酮代替金屬離子溶液作為對照，在25 ℃分別避光保存0、3、6、12 和24 h，測定455 nm處吸光值。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 11.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用Duncan法進(jìn)行多重比較。同一組柱狀圖上標(biāo)記不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 類胡蘿卜素的初步鑒定

利用氧化鋁柱層析純化了好食脈孢霉類胡蘿卜素，對純化產(chǎn)物進(jìn)行了液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS)鑒定，結(jié)果見圖1和圖2。

a-好食脈孢霉類胡蘿卜素HPLC圖譜；b-全反式β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜圖1 HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram

如圖1-a所示，好食脈孢霉類胡蘿卜素HPLC圖譜在3.57 min出現(xiàn)了較大洗脫峰，與圖1-b中全反式β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間3.54 min基本一致，初步判斷好食脈孢霉類胡蘿卜素中含有全反式β-胡蘿卜素。推測4.71 min出現(xiàn)的洗脫峰可能是β-胡蘿卜素的同分異構(gòu)體[2]。

如圖2所示，類胡蘿卜素質(zhì)譜圖譜中質(zhì)荷比為536.43的離子峰與全反式β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品幾乎一致，結(jié)合圖1結(jié)果可確定全反式β-胡蘿卜素是好食脈孢霉類胡蘿卜素中主要成分之一。β-胡蘿卜素具有高VA活性，是生理功能最突出的天然類胡蘿卜素之一，應(yīng)用及其廣泛[9]。因此，好食脈孢霉發(fā)酵醋糟產(chǎn)類胡蘿卜素具有廣闊的開發(fā)前景。

a-好食脈孢霉類胡蘿卜素質(zhì)譜圖；b-全反式β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖圖2 質(zhì)譜圖譜Fig.2 LC-MS chromatogram

2.2 好食脈孢霉類胡蘿卜素的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除率

DPPH自由基法廣泛用于評估化合物的抗氧化活性[10]。好食脈孢霉類胡蘿卜素、α-生育酚、BHA、TBHQ和β-胡蘿卜素的DPPH自由基清除率見圖3。

圖3 類胡蘿卜素和抗氧化劑的DPPH自由基清除作用Fig.3 Scavenging effect of carotenoids and antioxidants on DPPH free radical注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

如圖3所示，隨著類胡蘿卜素及各種抗氧化劑濃度的增大，DPPH自由基清除率逐漸增強(qiáng)；類胡蘿卜素質(zhì)量濃度在1～6 μg/mL時的,DPPH自由基清除率顯著高于α-生育酚、BHA和β-胡蘿卜素(P<0.05)；在質(zhì)量濃度為1、2 μg/mL時DPPH自由基清除率顯著高于TBHQ(P<0.05)，但是質(zhì)量濃度增加至3 μg/mL后的DPPH自由基清除率顯著低于TBHQ(P<0.05)。在質(zhì)量濃度為6 μg/mL時類胡蘿卜素、α-生育酚、BHA、TBHQ和β-胡蘿卜素的DPPH自由基清除率分別為60.21%、26.8%、43.45%、77.81%和7.19%。

研究表明，多種抗氧化劑聯(lián)合使用時，可能因?yàn)樾迯?fù)再生、偶聯(lián)氧化等協(xié)同作用，而使抗氧化效果較使用同等劑量的單一抗氧化劑效果明顯[11-12]。在圖4中可知,好食脈孢霉類胡蘿卜素的DPPH自由基清除率顯著高于β-胡蘿卜素，這是因?yàn)轭惡}卜素提取物中含β-胡蘿卜素及其合成過程的中間產(chǎn)物，多種成分協(xié)同釋氫中和自由基而使DPPH自由基清除率效果高于β-胡蘿卜素單獨(dú)作用效果[13]。

2.2.2 羥自由基清除率

好食脈孢霉類胡蘿卜素、α-生育酚、BHA、TBHQ和β-胡蘿卜素的羥自由基清除率見圖4。

圖4 類胡蘿卜素和抗氧化劑的羥自由基清除作用Fig.4 Scavenging effect of carotenoids and antioxidants on ·OH

如圖4所示，在質(zhì)量濃度為1 μg/mL時，類胡蘿卜素的羥自由基清除率顯著低于BHA(P<0.05)；當(dāng)質(zhì)量濃度為4 μg/mL時顯著高于β-胡蘿卜素(P<0.05)；當(dāng)質(zhì)量濃度為5、6 μg/mL時，類胡蘿卜素的羥自由基清除率顯著高于α-生育酚、BHA、TBHQ和β-胡蘿卜素(P<0.05)?？寡趸瘎┑目寡趸饔镁哂懈叨鹊臐舛纫蕾囆?，多種抗氧化物質(zhì)只有在適宜濃度下才最有利于發(fā)揮協(xié)同抗氧化的作用[12, 14]。好食脈孢霉類胡蘿卜素是一種含β-胡蘿卜素的多種類胡蘿卜素混合物，因此，表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，在粗糙脈孢霉類胡蘿卜素的抗氧化性研究中也出現(xiàn)相似的結(jié)果[15]。

2.2.3 總還原力

好食脈孢霉類胡蘿卜素、α-生育酚、BHA、TBHQ和β-胡蘿卜素的總還原力見圖5。

圖5 類胡蘿卜素和抗氧化劑的總還原力Fig.5 The total reducing ability of carotenoids and antioxidants

如圖5所示，類胡蘿卜素的總還原力顯著高于α-生育酚(P<0.05)；當(dāng)質(zhì)量濃度為5、 6 μg/mL時，類胡蘿卜素的總還原力顯著高于β-胡蘿卜素(P<0.05)。與合成抗氧化劑BHA和TBHQ相比，當(dāng)質(zhì)量濃度為3、4、 5 μg/mL時，類胡蘿卜素的總還原力顯著低于BHA(P<0.05)，6 μg/mL時類胡蘿卜素的總還原力顯著低于TBHQ(P<0.05)。

通過比較好食脈孢霉類胡蘿卜素與4種商品抗氧化劑的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和總還原力，可以確定好食脈孢霉類胡蘿卜素具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

2.3 類胡蘿卜素的穩(wěn)定性

2.3.1 光照對類胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響

光照易引起類胡蘿卜素形成順反雙鍵，使電磁波譜向藍(lán)端漂移2～10 nm；此外，光照還可能加速類胡蘿卜素的氧化，使呈色基團(tuán)降解，失去顏色[16]。光照對好食脈孢霉類胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響見圖6。

圖6 光照對類胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of light on the stability of carotenoids

由圖6可知，在避光保存條件下，類胡蘿卜素含量隨時間延長緩慢下降，在保存至72 h時，類胡蘿卜素含量較保存3 h時下降了約26%。在光照條件下，類胡蘿卜素含量隨光照時間延長迅速下降。日光燈對類胡蘿卜素的破壞效果要高于自然光，在保存至72 h時，類胡蘿卜素含量較保存3 h時下降了約48%。這與韓永斌等[17]的研究結(jié)果一致。由此可知，類胡蘿卜素宜在避光條件下保存。

2.3.2 溫度對類胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響

高溫易使類胡蘿卜素因發(fā)生環(huán)氧化而失去其穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)或形成同分異構(gòu)體[18-19]。溫度對好食脈孢霉類胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響結(jié)果見圖7。

圖7 溫度對類胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of temperature on the stability of carotenoids

如圖7所示，隨著溫度的升高和保存時間的延長，類胡蘿卜素的相對含量呈逐漸下降趨勢。在4、25、50和80 ℃保存20 h時類胡蘿卜素相對含量分別為98.91%、94.13%、81.30%和47.95%。綜上所述，好食脈孢霉類胡蘿卜素在溫度低于50 ℃時較穩(wěn)定，該溫度下的穩(wěn)定性較柚皮類胡蘿卜素強(qiáng)，但較蛹蟲草類胡蘿卜素的溫度穩(wěn)定性弱[20-21]。

2.3.3 金屬離子對類胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響

研究了K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Cu2+、Fe3+對好食脈孢霉類胡蘿卜素穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖8。

圖8 金屬離子對類胡蘿卜素含量的影響Fig.8 Effects of metal ion on the stability of carotenoids

如圖8所示，不同金屬離子對類胡蘿卜素具有不同的影響，隨著共存時間的延長，類胡蘿卜素的相對含量均呈現(xiàn)下降的趨勢。與Ca2+共存24 h時類胡蘿卜素相對含量下降近50%；與Ba2+共存24 h時類胡蘿卜素相對含量已經(jīng)下降至20%；Fe3+與類胡蘿卜素共存時產(chǎn)生絮狀沉淀，無法測定吸光值，所以未在圖8中列出結(jié)果。蛹蟲草類胡蘿卜素和紅球菌(Rhodococcussp.)B7740的β-胡蘿卜素對Fe3+也極其敏感[21-22]，可能是因?yàn)樵贔e3+等金屬離子的作用下使類胡蘿卜素異構(gòu)化及氧化分解所致[23]。上述研究結(jié)果說明，好食脈孢霉類胡蘿卜素保存及應(yīng)用過程中不宜與以上金屬離子(特別是Fe3+)共存。

3 結(jié)論

本文對來自好食脈孢霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的類胡蘿卜素進(jìn)行了初步鑒定，并研究了其抗氧化活性和穩(wěn)定性。結(jié)果顯示β-胡蘿卜素是好食脈孢霉類胡蘿卜素的主要成分之一；與α-生育酚、BHA和β-胡蘿卜素相比，該類胡蘿卜素表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性；類胡蘿卜素宜在避光、溫度低于50 ℃條件下保存，金屬離子特別是Fe3+對類胡蘿卜素具有一定破壞作用，因此，在應(yīng)用中應(yīng)采用微膠囊化、微乳液等技術(shù)保護(hù)類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)和生理活性。通過本文的研究，有望為好食脈孢霉類胡蘿卜素在食品或飼料工業(yè)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，為β-胡蘿卜素提供新的來源。