混合鹽堿脅迫對(duì)黃芩幼苗生理特性的影響研究

李小玲，王 妍，華智銳

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

黃芩(Sctellariabaicalensis)屬唇形科(Lamiaceae)黃芩屬(Scutellaria)多年生草本藥用植物，根可入藥，有止血安胎和清熱解毒等功效。近年研究表明,黃芩兼有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫力以及抑制艾滋病毒HIV22RT的作用[1]。黃芩是我國(guó)常用的大宗中藥材[2],在我國(guó)主要分布于山東、山西、陜西、甘肅四大產(chǎn)區(qū)，具有較強(qiáng)的耐寒、耐旱、耐鹽堿特性且主要在旱地栽培。

土壤鹽漬化是全球性問(wèn)題，全世界鹽堿地約占全球總面積的1/4，世界上遭受著鹽堿侵害的國(guó)家高達(dá)100多個(gè)。我國(guó)鹽堿地分布廣泛，主要在沿海地區(qū)及西北地區(qū)[3]。由于生態(tài)環(huán)境不斷惡化，近年來(lái)土壤鹽漬化面積逐年增加，且通常為復(fù)合鹽堿地，即鹽化和堿化相伴存在[4,5]。在輕度鹽堿脅迫的土地中有些作物的生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)受到抑制，產(chǎn)量有所下降；而除少數(shù)草類外，多數(shù)農(nóng)作物在重度鹽堿脅迫土地上均不能生長(zhǎng)，可見(jiàn)作物產(chǎn)量的形成受到了鹽堿脅迫的嚴(yán)重制約[6]。

研究表明，自然界中鹽堿地會(huì)傷害植物組織，過(guò)多鹽積累會(huì)導(dǎo)致植物代謝紊亂，引起植物生理干旱，進(jìn)而影響植物的營(yíng)養(yǎng)狀況[7,8]。對(duì)于大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，高濃度的鹽堿環(huán)境會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)不良[9]，尤其鹽堿和干旱環(huán)境對(duì)植物的影響最大，特別是鹽堿脅迫會(huì)造成70%的農(nóng)作物產(chǎn)量下降[10]。韓亞琦等[11]研究發(fā)現(xiàn)，榭櫟在鹽環(huán)境下其生長(zhǎng)指標(biāo)會(huì)受到顯著抑制；盛彥敏等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在不同程度的鹽堿環(huán)境中向日葵的根系活力、葉面積等指標(biāo)都會(huì)下降，并且隨著鹽濃度的升高鹽脅迫作用增強(qiáng)；潘羿壅[13]對(duì)巨菌草的研究表明，高濃度的鹽堿脅迫會(huì)使其各項(xiàng)生理指標(biāo)發(fā)生顯著變化；土壤鹽漬化已成為影響全球可利用耕地、作物產(chǎn)量和品質(zhì)提高的主要非生物因子之一[14-15]。關(guān)于耐鹽植物如何適應(yīng)鹽堿環(huán)境已成為國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者們研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

近年來(lái)，由于受自然條件及氣候差異的影響，土壤鹽漬化現(xiàn)象日益突出，黃芩的生長(zhǎng)環(huán)境已受到非生物因子的嚴(yán)重影響，導(dǎo)致其生物學(xué)和藥學(xué)品質(zhì)受到嚴(yán)重侵害，限制了黃芩產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)鹽害或堿害對(duì)植物的影響研究主要集中在單一鹽或單一堿上，而對(duì)于混合鹽堿脅迫研究較少，且集中在糧食作物、牧草、蔬菜及果樹(shù)等方面[16-18]，鑒于此，本試驗(yàn)以黃芩為材料，開(kāi)展了混合鹽堿脅迫對(duì)黃芩生理特征的影響研究，旨在為鹽堿地區(qū)黃芩的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培以及逆境生理機(jī)制和抗性育種研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

供試一年生黃芩幼苗于2019年4月購(gòu)自商洛市商山中藥材種植基地；NaCl、Na2SO4、NaHCO3和Na2CO3為分析純?cè)噭?含量≥99.5%)，購(gòu)自陜西晶博生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

將一年生黃芩幼苗移栽至直徑10 cm×高度15 cm的塑料花盆中進(jìn)行培養(yǎng)，在緩苗期間定時(shí)澆水和松土使土壤保持濕潤(rùn)，以恢復(fù)至正常生理狀態(tài)，澆水量視降雨情況而定，且各處理澆水量一致。每盆3～5株，每個(gè)處理3盆；1周后隨機(jī)選取各處理的幼苗用于試驗(yàn)。

根據(jù)自然環(huán)境中主要鹽堿成分組成的特點(diǎn)，本試驗(yàn)選擇中性鹽NaCl、Na2SO4和堿性鹽Na2CO3、NaHCO3，分別按不同的比例混合，分成4組：A、B、C、D(表1)。將各組組內(nèi)設(shè)置4個(gè)鹽濃度梯度：50、100、150、200 mmol/L，且每個(gè)處理組采用相同測(cè)定的pH值，以蒸餾水處理為對(duì)照(CK)[19]。各溶液的pH值采用雷磁PHS-3E型pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

表1 各處理組NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO3配比及pH值

采用灌根的方式每?jī)商鞂?duì)黃芩幼苗澆灌一次，每次灌根于19:00～21:00進(jìn)行，澆灌500 mL相應(yīng)的鹽堿混合處理液，確保處理液完全加入且不溢出[20]。每種處理重復(fù)3次，每次重復(fù)3株苗。處理1周后采集各處理黃芩幼苗的第3～4片功能葉進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 生理指標(biāo)的測(cè)定

丙二醛(MDA)和葉綠素含量的測(cè)定參照張志良等[21]的硫代巴比妥酸(TBA)檢測(cè)法和丙酮-碳酸鈣法；過(guò)氧化物酶(POD)活性和超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定參照李合生[22]的愈創(chuàng)木酚法和氮藍(lán)四唑法；參照高俊風(fēng)[23]的紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)活性；質(zhì)膜透性的測(cè)定參照張以順等[24]的相對(duì)電導(dǎo)率法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)并作圖，用SPSS statistics 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，以Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。3次重復(fù)測(cè)得的各項(xiàng)生理指標(biāo)數(shù)據(jù)，取其平均值繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合鹽堿脅迫對(duì)黃芩幼苗MDA含量的影響

由圖1可知，在各種混合鹽堿脅迫濃度下，A組處理含量均與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，且增幅最大，分別為20.77%、24.64%、31.33%、35.11%；在100 mmol/L和150 mmol/L鹽堿脅迫下，A、C、D組均與對(duì)照差異顯著；在大于50 mmol/L鹽堿脅迫下，B組均與對(duì)照差異不顯著。表明A組處理的黃芩幼苗膜脂化程度明顯高于B組，對(duì)黃芩幼苗的損傷較大。從相同鹽堿處理不同濃度來(lái)看，隨著混合鹽堿脅迫濃度的增加，MDA含量整體呈上升的趨勢(shì)，均在200 mmol/L鹽堿脅迫下MDA含量達(dá)到最高值，與對(duì)照相比分別增加了35.11%、9.44%、15.54%、19.83%，說(shuō)明200 mmol/L鹽堿脅迫對(duì)MDA含量影響顯著。

圖1 混合鹽堿脅迫對(duì)黃芩幼苗MDA含量的影響

2.2 混合鹽堿脅迫對(duì)黃芩幼苗葉綠素含量的影響

由圖2可知，在50 mmol/L鹽堿脅迫下，各組處理黃芩幼苗葉綠素含量均與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，且在100 mmol/L鹽堿脅迫下，C、D組和對(duì)照組之間差異不顯著；在150 mmol/L鹽堿脅迫下，A、B、D組與對(duì)照組之間差異不顯著；在200 mmol/L鹽堿脅迫下，A、B、C、D組與對(duì)照之間差異顯著。在各種濃度處理下，A組葉綠素含量始終高于其它處理，反映出中性鹽(A組)對(duì)黃芩幼苗葉綠素含量影響顯著。從相同鹽堿處理不同濃度來(lái)看，隨著混合鹽堿脅迫濃度的增加，葉綠素的含量整體上呈現(xiàn)出先升后降趨勢(shì)，即呈現(xiàn)“低促高抑”。在50 mmol/L處理時(shí)與對(duì)照相比達(dá)到最大增幅，分別為14.82%、8.26%、1.50%和10.69%。在100 mmol/L鹽堿脅迫下，葉綠素含量降低，但大于對(duì)照組；當(dāng)鹽堿脅迫濃度大于100 mmol/L時(shí)，葉綠素含量低于對(duì)照組，說(shuō)明50 mmol/L鹽堿脅迫對(duì)葉綠素含量影響顯著。

圖2 混合鹽堿脅迫對(duì)黃芩幼苗葉綠素含量的影響

2.3 混合鹽堿脅迫對(duì)黃芩幼苗SOD活性的影響

由圖3可知，經(jīng)不同濃度的混合鹽堿脅迫處理后，黃芩幼苗的SOD活性與對(duì)照組差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。在50、100和150 mmol/L鹽堿脅迫下，A組處理中SOD保護(hù)酶活性與對(duì)照相比增幅分別為17.92%、20.94%和32.33%；而在200 mmol/L鹽堿脅迫下，SOD活性與對(duì)照組差異不大，并在D組處理下SOD活性低于對(duì)照組，說(shuō)明高濃度的堿性鹽脅迫顯著降低了SOD保護(hù)酶的活性。從相同鹽堿處理不同濃度來(lái)看，A、B、C 3組SOD活性隨著濃度增加呈現(xiàn)先增后降趨勢(shì)，均在150 mmol/L鹽堿脅迫下SOD活性與對(duì)照相比達(dá)到最大增幅，分別為32.33%、21.11%和25.13%；而當(dāng)鹽堿脅迫濃度大于150 mmol/L時(shí)，SOD活性逐漸降低。說(shuō)明高濃度的鹽堿脅迫抑制了保護(hù)酶的活性，且在中性鹽脅迫(A處理)下表現(xiàn)突出。

圖3 混合鹽堿脅迫對(duì)黃芩幼苗SOD活性的影響

2.4 混合鹽堿脅迫對(duì)黃芩幼苗POD活性的影響

由圖4可知，從相同鹽堿脅迫濃度分析，在50 mmol/L和100 mmol/L鹽堿脅迫下，A、B組與對(duì)照組之間POD活性差異顯著(P<0.05)，且均在A組處理下與對(duì)照相比達(dá)到最大增幅，分別為60.71%和89.29%。在150 mmol/L鹽堿脅迫下，4組處理與對(duì)照組之間均達(dá)到顯著差異，并在A組處理下達(dá)到最大增幅，為137.24%。在200 mmol/L鹽堿脅迫下，A、B組與對(duì)照組之間POD活性差異顯著，在B組處理下達(dá)到最大增幅，為79.85%。表明中性鹽(A組)誘導(dǎo)了黃芩POD 活性的提高，并隨處理濃度升高呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)。A、B、C、D 4組均在150 mmol/L鹽堿脅迫下，POD活性達(dá)到最大值，與對(duì)照相比增幅分別為137.24%、120.15%、38.27%和34.69%。表明相同鹽堿處理時(shí)，150 mmol/L濃度的脅迫對(duì)POD活性影響顯著。

圖4 混合鹽堿脅迫對(duì)黃芩幼苗POD活性的影響

2.5 混合鹽堿脅迫對(duì)黃芩幼苗CAT活性的影響

由圖5可知，經(jīng)混合鹽堿脅迫后，各組處理CAT活性與對(duì)照組相比，達(dá)到顯著差異(P<0.05)。在各相同濃度鹽堿脅迫下，CAT活性在各類型處理間呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)，且均在A組處理下與對(duì)照相比達(dá)到最大增幅，分別為118.66%、108.06%、86.81%、98.68%，表明中性鹽(A組)誘導(dǎo)了黃芩 CAT 活性的提高，并隨處理濃度增大呈先增后減的變化趨勢(shì)。在50 mmol/L鹽堿脅迫時(shí)與對(duì)照相比CAT增幅最大，分別為118.66%、102.29%、86.81%和39.01%，表明50 mmol/L鹽堿脅迫對(duì)CAT活性影響顯著。

圖5 混合鹽堿脅迫對(duì)黃芩幼苗CAT活性的影響

2.6 混合鹽堿脅迫對(duì)黃芩幼苗相對(duì)電導(dǎo)率的影響

從圖6可看出，混合鹽堿脅迫處理黃芩后，黃芩幼苗的相對(duì)電導(dǎo)率與對(duì)照組相比差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。在4種鹽堿脅迫濃度下，均在A組處理時(shí)增幅最大，分別為17.53%、21.80%、61.07%、62.96%，表明中性鹽(A組)脅迫對(duì)黃芩幼苗的傷害較大，造成嚴(yán)重的內(nèi)含物外滲。從相同鹽堿處理不同濃度來(lái)看，黃芩幼苗葉片的相對(duì)電導(dǎo)率呈現(xiàn)出逐漸升高趨勢(shì)，A、B、C、D 4組處理均在200 mmol/L鹽堿脅迫濃度下與對(duì)照相比達(dá)到最大增幅，分別為62.96%、52.50%、16.42%、34.78%，反映出200 mmol/L鹽堿脅迫對(duì)黃芩幼苗相對(duì)電導(dǎo)率的影響最為顯著。

圖6 混合鹽堿脅迫對(duì)黃芩幼苗相對(duì)電導(dǎo)率的影響

3 討論

當(dāng)植物遇到逆境脅迫和植株衰老的情況下，植物細(xì)胞膜系統(tǒng)均會(huì)受到損傷，導(dǎo)致發(fā)生膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，從而形成主要產(chǎn)物之一丙二醛(MDA)，通常膜損傷程度的大小可以通過(guò)其含量的多少來(lái)反映。郝鳳等[25]研究表明，紫花苜蓿葉片中MDA含量與鹽濃度成呈相關(guān)；張恩平等[26]發(fā)現(xiàn)黃瓜幼苗子葉MDA含量經(jīng)NaCl處理后明顯增加；王志強(qiáng)等[27]通過(guò)試驗(yàn)得出隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，不同脅迫濃度下酸棗幼苗體內(nèi)丙二醛含量呈逐漸升高趨勢(shì)。本研究表明，隨著鹽堿脅迫濃度的增加，MDA含量也不斷升高，這與前人的研究結(jié)論一致，說(shuō)明在鹽堿脅迫條件下，黃芩幼苗細(xì)胞膜系統(tǒng)受到了不同程度的損傷，在200 mmol/L鹽堿脅迫時(shí)影響顯著，且中性鹽A組處理對(duì)黃芩幼苗的損傷較大。

葉綠素作為一種色素，對(duì)光合作用有著非常重要的意義，而光合作用作為植物生命的基礎(chǔ)，是有機(jī)物及植物合成能量的根本來(lái)源。所有能進(jìn)行光合作用的生物體中都能產(chǎn)生葉綠素，葉綠素能使光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，其含量的多少?zèng)Q定了植物光合作用的強(qiáng)弱。本研究發(fā)現(xiàn)，在初始脅迫時(shí)，植物體內(nèi)會(huì)積累可溶性糖、可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，有利于葉綠素的合成。因此，在50 mmol/L脅迫濃度下，葉綠素含量相比于對(duì)照會(huì)有一個(gè)微上升，但隨著脅迫濃度增加，黃芩葉綠素含量逐漸降低，這與陳菲[28]研究鹽堿脅迫對(duì)文冠果幼苗的影響所得結(jié)果一致。在本實(shí)驗(yàn)各種濃度處理下，A組葉綠素含量始終高于其它處理，反映出中性鹽(A組)對(duì)黃芩幼苗葉綠素含量影響顯著。

植物在不利于其生長(zhǎng)的鹽堿環(huán)境和衰老的情況下，為維持自身的正常生理活動(dòng)，植物會(huì)采取提高抗氧化酶(SOD、POD、CAT等)的活性，來(lái)降低體內(nèi)的活性氧數(shù)量，這是植物的應(yīng)激反應(yīng)策略[29]?？寡趸富钚猿蔀槟婢趁{迫下監(jiān)測(cè)植物的重要指標(biāo)。陳菲[28]研究發(fā)現(xiàn)在不同鹽堿脅迫下，文冠果幼苗中SOD、POD、CAT活性隨脅迫濃度增加均不同程度地呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。在低鹽濃度下植物可以通過(guò)提高保護(hù)酶活性來(lái)增強(qiáng)耐鹽性，從而減輕鹽堿對(duì)植株的傷害，但這種能力是有限的，當(dāng)鹽堿含量值高出一定程度后，酶活性降低。在本實(shí)驗(yàn)中，SOD、POD、CAT活性隨鹽堿濃度的增加表現(xiàn)為先升后降趨勢(shì)，且均在中性鹽(A組)誘導(dǎo)了黃芩保護(hù)酶活性提高，影響效果最顯著。SOD、POD活性均在150 mmol/L處理下最大，而CAT不同，它在50 mmol/L脅迫下影響顯著。

植物遇到逆境脅迫后，膜脂結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞，進(jìn)而使膜脂通透性增大，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)各種水溶性物質(zhì)大量外滲，通常表現(xiàn)為外滲的越多，電導(dǎo)率就越大，所以可以采取電導(dǎo)儀測(cè)定植物葉片外滲電導(dǎo)率從而得知細(xì)胞膜受到傷害的程度。本研究發(fā)現(xiàn)，伴隨混合鹽堿脅迫濃度的升高，相對(duì)電導(dǎo)率呈現(xiàn)逐漸增大趨勢(shì)，即在200 mmol/L鹽堿脅迫時(shí)影響顯著，且在中性鹽(A組)脅迫下對(duì)黃芩幼苗的傷害較大，造成嚴(yán)重的內(nèi)含物外滲，其影響效果最顯著。

本研究發(fā)現(xiàn)，中性鹽A組脅迫對(duì)黃芩幼苗生理特性影響顯著，表明黃芩適合微堿性環(huán)境，對(duì)pH值耐受性強(qiáng)，它對(duì)中性鹽的脅迫反應(yīng)比較敏感，而對(duì)堿性鹽比較遲鈍。本研究未涉及更高濃度的混合鹽堿脅迫對(duì)黃芩幼苗的影響，當(dāng)脅迫濃度超過(guò)一定的限度時(shí)其發(fā)揮的作用未知。因此，更高混合鹽堿脅迫濃度對(duì)黃芩幼苗的影響還有待進(jìn)一步研究。