喬延召，劉 凱，李清華，黃建豪，衛(wèi)恒習(xí)，張守全

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院/國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642； 2 汕尾寶山豬場有限公司，廣東 汕尾 516600)

精卵發(fā)生特異堿性螺旋環(huán)螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Spermatogenesis and oogenesis specific basic helixloop-helix transcription factor,Sohlh1)是一種主要在睪丸和卵巢中表達(dá)的組織特異性基因，能夠調(diào)控精子和卵子的發(fā)生[1]。公鼠睪丸中Sohlh1的mRNA最早可在胚胎發(fā)育12.5 d 時檢測到，在胚胎發(fā)育15.5 d 時通過免疫組化檢測到了SOHLH1 蛋白，免疫熒光試驗進(jìn)一步證實SOHLH1 蛋白在精原細(xì)胞中的特異性表達(dá)[1]。母鼠卵巢中Sohlh1的mRNA最早可在胚胎發(fā)育13.5 d 時卵細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂Ⅰ期檢測到，蛋白則在胚胎發(fā)育15.5 d 時檢測到，在卵母細(xì)胞中SOHLH1 蛋白同時存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中[2]。研究表明，Sohlh1可能被視為原發(fā)性卵巢功能不全的調(diào)控基因[3]，非梗阻性無精子癥也與Sohlh1基因的突變有關(guān)[4]。Sohlh1在生殖發(fā)育中更多的調(diào)控機制有待于進(jìn)一步研究，以往的研究顯示Sohoh1作為生殖細(xì)胞特異表達(dá)基因，其啟動子被廣泛應(yīng)用于生殖細(xì)胞特異表達(dá)啟動子，敲除此基因則被廣泛應(yīng)用到生殖發(fā)育障礙動物模型中。

作為一種理想的基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9技術(shù)在模式動物制備[5-6]、遺傳疾病治療[7-9]、癌癥研究[10-11]等多個領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。但CRISPR/Cas9 系統(tǒng)存在脫靶問題[12]，效率受影響，Slaymaker等[13]把3 個帶正電荷的氨基酸突變?yōu)榉菢O性的氨基酸，大大降低了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的“脫靶”切割，使其效率顯著提高。除基因編輯技術(shù)外，慢病毒轉(zhuǎn)基因法以其穩(wěn)定、高效整合的優(yōu)勢，也常常被應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和動物生產(chǎn)中。

四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)因高效、可控和低滲漏等優(yōu)點深受研究者喜愛。四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)中的Tet-on系統(tǒng)又稱四環(huán)素開啟系統(tǒng)，指只有在誘導(dǎo)劑四環(huán)素或其衍生物強力霉素存在的條件下，rtTA 蛋白才能結(jié)合到Tet 應(yīng)答元件(Tet-responsive element,TRE)序列上產(chǎn)生激活作用，使插入的目的基因進(jìn)行表達(dá)[14-18]。這種安全可調(diào)控的特點極大地方便了目的基因多方面的研究[19]。利用Tet-on 系統(tǒng)能夠?qū)δ康幕驎r空表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的特點，本研究將CRISPR/Cas9 系統(tǒng)與Tet-on 系統(tǒng)相結(jié)合，通過條件性地對Sohlh1基因進(jìn)行敲除，達(dá)到構(gòu)建可誘導(dǎo)型Sohlh1基因敲除細(xì)胞系的目的，以此細(xì)胞系建立的克隆豬生殖模型，將有助于Sohlh1基因功能、生殖細(xì)胞發(fā)育以及人類生殖障礙等問題的研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗動物組織 仔豬睪丸組織和30 d 胎齡豬胎兒采自廣東溫氏集團(tuán)水臺原種豬場。

1.1.2 質(zhì)粒和細(xì)胞株 pLV-sgRNA(#50662)質(zhì)粒、pGL3-GFP 質(zhì)粒購于Addgene 公司；低脫靶優(yōu)化慢病毒載體PCW-eSpCas9(1.1)(含Tet-on 系統(tǒng))、穩(wěn)轉(zhuǎn)Cas9 蛋白豬胎兒成纖維細(xì)胞(Porcine fetal fibroblast,PFF)系、慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G 由國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心保存；293FT 細(xì)胞株購于ATCC 公司。

1.1.3 主要試劑 pMD?18-T Vector Cloning Kit 購自TaKaRa 公司；感受態(tài)細(xì)胞Escherichia coliStbl3 和DH5α、TransScript II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(AT311)、質(zhì)粒提取試劑盒購自全式金生物公司；SpeⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、NheⅠ等限制性內(nèi)切酶購于Thermo 公司；ClonExpress? MultiS One Step Cloning Kit 購自南京諾唯贊公司；GML-PC 慢病毒濃縮試劑盒、HGTrans293?transfection reagent、LipofectamineTM2000、Attractene Transfection Reagent 購自上海吉滿生物公司；滅稻瘟菌素、嘌呤霉素購自Sigma 公司；動物組織總RNA 提取試劑盒、細(xì)胞基因組提取試劑盒購自天根生化公司；凝膠回收試劑盒購自Magen公司；全蛋白提取試劑盒購自凱基公司。

1.2 方法

1.2.1 PFF 細(xì)胞的獲取 取純種杜洛克公豬30 d胎齡的胎兒，用含有雙抗的PBS 緩沖液清洗，75%(φ)乙醇溶液消毒全身，在超凈臺內(nèi)去除頭、尾、四肢、心臟及其他臟器，雙抗液再次清洗后，于培養(yǎng)皿中用眼科剪將胚胎充分剪碎，使組織塊直徑小于1 mm；隨后加入37 ℃預(yù)熱的DMEM/F12 培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移混合液至卡式瓶，混合均勻并放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 h后再加入適量含20%(φ)FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)液，24～48 h 后觀察組織塊旁細(xì)胞生長狀況。待長出的 PFF 細(xì)胞達(dá)到足夠密度時，進(jìn)行細(xì)胞凍存。

1.2.2 PCW-eSpCas9(1.1)慢病毒載體侵染PFF 細(xì)胞及檢測 復(fù)蘇保存的PFF 細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度(細(xì)胞生長面積/孔板面積)達(dá)約80%時，用PCW-eSpCas9(1.1)慢病毒載體濃縮液侵染并放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h 后換液為新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。病毒侵染2 d 后換用含有1 μg/mL 嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每天換液，篩選大約2 周，待細(xì)胞穩(wěn)定生長，一部分進(jìn)行凍存；另外一部分加入強力霉素(Dox)進(jìn)行誘導(dǎo)，最后收集誘導(dǎo)組、未誘導(dǎo)組細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR 和Western-blot 檢測。

1.2.3 pLV-sgRNA 載體的改造及驗證 以pLVsgRNA(#50662)質(zhì)粒和pGL3-GFP 質(zhì)粒為模板，融合PCR 得到2A-GFP 片段。再用SpeⅠ和EcoRⅠ雙酶切pLV-sgRNA 質(zhì)粒，得其線性化片段。隨后將2A-GFP 片段與pLV-sgRNA 線性化片段進(jìn)行連接(步驟見One Step Cloning Kit 連接試劑盒說明書)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Stbl3，挑取單菌落至含有氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h，菌液PCR 鑒定，反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，32 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將陽性質(zhì)粒送生工測序。最后根據(jù)LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染手冊將測序正確的改造載體轉(zhuǎn)入293FT 細(xì)胞進(jìn)行熒光檢測。

1.2.4 豬Sohlh1基因的擴增及靶位點預(yù)測 依據(jù)動物組織總RNA 提取試劑盒說明書抽提仔豬睪丸組織RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫記錄的豬Sohlh1基因序列，使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計Sohlh1擴增引物(Sohlh1-F：ATGGCGTCCGGGGCTCCCGAG；Sohlh1-R：TCAGTAGGCAAAGAAGTCAG)，以cDNA 為模板，進(jìn)行Sohlh1基因的PCR 擴增，膠回收DNA 片段進(jìn)行T-A 克隆、連接pMD?18-T 載體、轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、菌液PCR 鑒定，選取陽性菌測序，將結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對。最后把測序所得豬Sohlh1基因CDs 區(qū)輸入sgRNA Designer 軟件(http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)，根據(jù)評分和所在外顯子區(qū)域選出合適的靶基因位點。

1.2.5 pLV-sgRNA-2A-GFP 特異性載體的構(gòu)建及慢病毒包裝 以PCR 擴增的人U6 啟動子片段和含有靶位點的sgRNA 片段為模板，融合PCR 得到U6-sgRNA 瞬時表達(dá)載體，用無血清培養(yǎng)基稀釋后，加入轉(zhuǎn)染試劑Attractene Transfection Reagent，形成核酸?轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物。將復(fù)合物轉(zhuǎn)染已篩選并驗證表達(dá)Cas9 蛋白的PFF 細(xì)胞，于48～72 h 收集細(xì)胞進(jìn)行基因組提取及PCR 擴增，引物為F-S3gS4g、R-S5gS6g(表1)，隨后對敲除基因片段進(jìn)行分子克隆操作(同“1.2.4”)，測序鑒定，進(jìn)行敲除活性分析。根據(jù)Sohlh1基因靶位點敲除分析結(jié)果，選取目標(biāo)靶點構(gòu)建pLV-sgRNA-2A-GFP 特異性載體：用XhoⅠ和NheⅠ酶切已構(gòu)建好的pLV-sgRNA-2AGFP 質(zhì)粒，得其線性化載體并與U6-sgRNA 瞬時表達(dá)載體進(jìn)行連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Stabl3 感受態(tài)細(xì)胞，分子克隆步驟同“1.2.4”，陽性質(zhì)粒送生工測序比對。特異性載體的慢病毒包裝檢測：用Opti-DMEM稀釋混合好的DNA(穿梭質(zhì)粒、psPAX2 和pMD2.G質(zhì)量比為2∶2∶1)，加入轉(zhuǎn)染試劑HG-Trans293TM transfection reagent，然后轉(zhuǎn)入293FT 細(xì)胞中，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在48 和72 h 后收集病毒上清液，用GML-PC 慢病毒濃縮試劑盒進(jìn)行濃縮。用1 mL 濃縮液和1 μL 終濃度為10 μg/mL 的Polybrene共同侵染293FT 細(xì)胞，48 h 后顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況。

表 1 Sohlh1 基因敲除鑒定引物Table 1 Primers for Sohlh1 gene knockout identification

1.2.6 篩選細(xì)胞系陽性比例鑒定 用上述pLV

sgRNA-2A-GFP 特異性慢病毒載體侵染穩(wěn)轉(zhuǎn)PCWeSpCas9(1.1)基因PFF細(xì)胞(圖1)，3～4 d 后換用含3μg/mL 的滅稻瘟菌素、15%(φ)血清的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)。每2～3 d 用含有抗生素的新鮮培養(yǎng)基換液并隨時觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況，一段時間以后待大部分細(xì)胞都有熒光表達(dá)時，停止藥物篩選。培養(yǎng)藥物篩選的PFF 陽性細(xì)胞至80%的細(xì)胞匯合度，更換含有Dox 的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，3 d 后收集細(xì)胞，抽提基因組，進(jìn)行PCR 擴增，引物為F-S3gS4g、R-S3gS4g(表1)，分子克隆步驟同“1.2.4”，最后將陽性菌送生工測序并統(tǒng)計樣品敲除效率。

圖1 sgRNA 與Sohlh1 基因靶向結(jié)合示意圖Fig.1 Schematic diagram of targeted binding of sgRNA and Sohlh1 gene

圖2 優(yōu)化后的低脫靶慢病毒載體PCW-eSp Cas9(1.1)結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of optimized low miss lentivirus vector PCW-eSp Cas9(1.1)

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)PCW-eSpCas9(1.1 )基因細(xì)胞系的檢測

慢病毒包裝質(zhì)粒PCW-eSpCas9(1.1)(圖2)侵染PFF細(xì)胞，嘌呤霉素篩選得到細(xì)胞克隆團(tuán)(圖3)。Dox 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)PCW-eSpCas9(1.1)基因PFF細(xì)胞系后進(jìn)行RT-PCR 檢測，結(jié)果顯示eSpCas9(1.1)基因只在誘導(dǎo)后的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄(圖4)。Western-blot 檢測結(jié)果顯示Dox 誘導(dǎo)組細(xì)胞能夠表達(dá)eSp Cas9(1.1)蛋白，未誘導(dǎo)組細(xì)胞不表達(dá)該蛋白(圖5)。綜合以上結(jié)果，可以得出eSpCas9(1.1)基因已整合到PFF細(xì)胞基因組上并穩(wěn)定表達(dá)。

2.2 pLV-sgRNA 載體的改造結(jié)果

融合PCR 得到的2A-GFP片段與酶切p LVsgRNA 質(zhì)粒后得到的片段(圖6)進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，陽性菌測序正確。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h 熒光顯微鏡觀察到帶綠色熒光的細(xì)胞(圖7)，表明pLV-sgRNA 載體成功地改造為pLV-sgRNA-2A-GFP 載體。

圖3 嘌呤霉素篩選的PCW-eSp Cas9(1.1)基因陽性PFF細(xì)胞克隆團(tuán)Fig.3 PCW-eSpCas9(1.1)gene positive PFF cell clones screened by purinomycin

圖4 RT-PCR 檢測表達(dá)eSp Cas9(1.1)基因細(xì)胞系Fig.4 Detection of cell line expressing eSpCas9(1.1)gene by RT-PCR

圖5 Western-blot 檢測表達(dá)eSpCas9(1.1)蛋白細(xì)胞系Fig.5 Detection of cell line expr essing eSp Cas9(1.1)protein by Western-blot

圖6 融合PCR 擴增得到2A-GFP 片段(A)和雙酶切p LV-sgRNA 載體得到的線性化片段(B)Fig.6 2A-GFPfragment obtained by fusion PCR (A)and the linearized fragment obtained by doubleenzyme digestion of p LV-sgRNA vector (B)

圖7 熒光顯微鏡檢測p LV-sgRNA-2A-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的293FT細(xì)胞Fig.7 Detection of 293FT cells transfected with the p LVsgRNA-2A-GFP plasmid by fluorescence microscopy

2.3 豬Sohlh1基因測序及靶位點的選擇

Lasergene軟件比對PCR 擴增后測序所得豬Sohlh1基因與NCBI 數(shù)據(jù)庫所報道的豬Sohlh1基因，結(jié)果表明兩者序列基本一致，僅在起始密碼子下游894 bp處有1個堿基不同(圖8)，但是所編碼的均為谷氨酸，對Sohlh1功能無影響。再通過軟件預(yù)測Sohlh1基因CDs區(qū)全部的sgRNA 位點，分析各位點的評分及所在的外顯子區(qū)域，從中選擇符合條件的4個靶位點(表2)。

圖8 PCR 擴增豬Sohlh1 基因與NCBI 數(shù)據(jù)庫對比Fig.8 Comparison of pig Sohlh1 gene amplified by PCR with NCBIdatabase

2.4 p LV-sgRNA-2A-GFP特異性載體的構(gòu)建及慢病毒包裝檢測

PCR 擴增出U6啟動子與含有靶位點的sgRNA片段(圖9A)，融合PCR 得到U6-sgRNA 瞬時表達(dá)載體(圖9B)。為驗證敲除效果，使用U6-sgRNA 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)Cas9基因PFF細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48～72 h 抽提基因組進(jìn)行PCR 擴增，得到1 593 bp的敲除基因片段，經(jīng)克隆、測序得到各靶位點的敲除情況(圖10)。試驗送樣72個，有效結(jié)果中3、4、6號位點突變的樣品數(shù)分別為17、16及14個，3、4號位點同時突變的為8個，5號位點均無突變，分析測序結(jié)果知3、4、6號靶位點有敲除活性，同時3、4號位點可形成同時斷裂的切割，利于提高突變幾率(圖10)。XhoI與NheI雙酶切pLV-sgRNA-2A-GFP質(zhì)粒，產(chǎn)物大小為7807 bp(圖9C)，與帶有3、4號靶位點的U6-sgRNA 載體連接，陽性菌測序正確。將pLV-sgRNA-2A-GFP特異性載體進(jìn)行慢病毒包裝，其濃縮液侵染293FT細(xì)胞，48 h 后觀察到293FT細(xì)胞的熒光表達(dá)，表明pLV-sgRNA-2A-GFP特異性載體慢病毒包裝成功(圖11)。

表 2 Sohlh1基因靶點的預(yù)測與評分Table 2 Prediction and scoring of Sohlh1 gene targets

圖9 PCR 檢測p LV-sgRNA-2A-GFP 特異性載體的構(gòu)建Fig.9 Construction of p LV-sgRNA-2A-GFP specific vector and PCR examination

圖10 不同靶位點敲除的序列分析Fig.10 Sequence analysis of different target knockout

圖11 特異性載體慢病毒濃縮液侵染293FT細(xì)胞熒光顯微鏡觀察Fig.11 Fluorescence microscopy observation of 293FT cells infected by sp ecific vector lentivir us concentrate

2.5 慢病毒侵染PFF 細(xì)胞及陽性細(xì)胞篩選結(jié)果

穩(wěn)轉(zhuǎn)PCW-eSp Cas9(1.1)基因PFF細(xì)胞進(jìn)行pLV-sgRNA-2A-GFP特異性慢病毒載體侵染，滅稻瘟菌素篩選3 d 左右細(xì)胞大量死亡。圖12為藥物篩選7、14、28 d 熒光顯微鏡觀察結(jié)果，可以看到28 d所篩選的細(xì)胞系有約90%以上的細(xì)胞表達(dá)了綠色熒光蛋白，表明此時pLV-sgRNA-2A-GFP特異性慢病毒載體侵染PFF細(xì)胞系篩選成功。在篩選成功的PFF細(xì)胞系中加入Dox 誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h，PCR 擴增Sohlh1基因含有3、4號靶位點的片段，經(jīng)分子克隆與測序，結(jié)果顯示測序的20個菌液中，3號位點有突變的樣品數(shù)為14個，突變率為70%，4號位點有突變的樣品數(shù)為7個，突變率為35%，而3、4號位點同時發(fā)生移碼突變的樣品數(shù)為4個，突變率為20%，最終測得樣品突變總數(shù)為17個，有敲除的樣品比例達(dá)到85%。

圖12 藥物篩選不同天數(shù)熒光顯微鏡觀察Fig.12 Fluorescence microscopy observation on different days of drug screening

3 討論與結(jié)論

生殖細(xì)胞特異性基因由于只在生殖細(xì)胞中表達(dá)，對于發(fā)育生物學(xué)研究顯得十分重要?；蚯贸囼炞C明Sohlh1基因在生殖細(xì)胞成熟過程中起著重要的作用[1-2]，成年Sohlh1(?/?)雌鼠卵巢的臨床表型與人類卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)患者相似，而且雄性性腺機能衰退[20]等也與Sohlh1基因的突變有關(guān)。本研究選擇Sohlh1為靶基因，通過軟件預(yù)測Sohlh1基因CDs區(qū)全部的sgRNA 位點，構(gòu)建U6-sgRNA 瞬時表達(dá)元件進(jìn)行敲除效果的驗證，測序得到各靶位點的敲除情況，成功地篩選到有敲除活性的靶位點，為研究敲除后Sohlh1基因的功能打下了基礎(chǔ)。

本研究使用的Tet-on 系統(tǒng)，它的調(diào)控元件為反式應(yīng)答轉(zhuǎn)錄激活因子(Reverse tTA，rtTA)，在不加入誘導(dǎo)劑Dox 時，rtTA 不與表達(dá)目的基因的Tet 應(yīng)答元件(TRE)結(jié)合，無法啟動目的基因表達(dá)，當(dāng)加入Dox 誘導(dǎo)后，rtTA 結(jié)構(gòu)改變，能夠結(jié)合到TRE上，激活插入的目的基因表達(dá)。本研究利用已經(jīng)優(yōu)化好的低脫靶率慢病毒載體PCW-eSpCas9(1.1)(含Tet-on 系統(tǒng))，通過Tet-on 系統(tǒng)與CRISPR/Cas9系統(tǒng)的緊密結(jié)合，使用構(gòu)建好的p LV-sgRNA-2AGFP特異性慢病毒載體侵染含有上述系統(tǒng)的PFF細(xì)胞，由Tet-on 系統(tǒng)調(diào)控Cas9基因的表達(dá)，在試驗中加入Dox 誘導(dǎo)表達(dá)Cas9蛋白對Sohlh1基因進(jìn)行切割，造成Sohlh1基因突變，測序結(jié)果顯示有敲除樣品的比例高達(dá)85%，成功地構(gòu)建了可誘導(dǎo)型豬Sohlh1基因敲除細(xì)胞系。

豬在生理結(jié)構(gòu)上與人類極為相似，包括胃腸道、腎臟、外神經(jīng)、皮膚、內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等[21]，因此，豬可作為一種重要的大動物模型應(yīng)用于預(yù)防和治療藥物的臨床前試驗[22]、人類疾病發(fā)病機制及功能基因組學(xué)研究[23-24]。但豬制備生殖疾病模型鮮有報道。本研究構(gòu)建的敲除Sohlh1基因細(xì)胞系可用于后期條件性生殖細(xì)胞敲除豬模型的制備，為后期研究Sohlh1基因的功能和解決人類生殖疾病相關(guān)問題創(chuàng)造條件。

本研究通過改造和優(yōu)化的慢病毒載體介導(dǎo)，利用Tet-on 系統(tǒng)和CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功制備了可誘導(dǎo)型Sohlh1基因敲除PFF細(xì)胞系,為研究Sohlh1基因的功能以及制備條件性敲除Sohlh1基因生殖模型豬儲備了試驗材料。