甜蕎長(zhǎng)花柱長(zhǎng)雄蕊突變體lpls大小孢子發(fā)生和雌雄配子體的發(fā)育

王 旋 劉志雄

（長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，荊州 434025）

甜蕎（Fagopyrum esculentumMoench）是蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum）非禾谷類兼食、藥、觀賞和土壤修復(fù)等多用途的經(jīng)濟(jì)作物，其籽粒富含賴氨酸、蘆丁和抗氧化活性物等，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功效，是一種值得加快開發(fā)的植物［1～3］。甜蕎還具有生育期短、耐瘠薄、耐澇抗寒、耐旱等優(yōu)點(diǎn)，在亞洲、歐洲、北美等地區(qū)栽培歷史悠久，目前已被作為一種集營(yíng)養(yǎng)保健、醫(yī)藥、蜜源和觀賞等為一體的多用途作物而受到國(guó)際廣泛重視［4～6］。然而，甜蕎自然群體內(nèi)長(zhǎng)花柱短雄蕊（pin）型和短花柱長(zhǎng)雄蕊（thrum）型植株按1∶1 分離，異型花間僅等高的花藥和柱頭間授粉才能正常結(jié)實(shí)，自花和同型花間授粉不親和，自然結(jié)實(shí)率和產(chǎn)量低［4］。尋找或創(chuàng)制雌雄蕊等長(zhǎng)、親和性好的的甜蕎新種質(zhì)，對(duì)實(shí)現(xiàn)甜蕎不同單株間自由授粉和增產(chǎn)，加快其開發(fā)，均具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

筆者在前期育種工作中，在甜蕎品種‘北早生’群體中發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)花柱長(zhǎng)雄蕊（long pistil and long stamens，lpls）突變體單株基礎(chǔ)上，通過隔離傳粉和單粒傳粉獲得了遺傳性狀穩(wěn)定、親和性好的lpls突變體株系。人工雜交和限制傳粉顯示：lpls突變體同型花間能正常授粉結(jié)實(shí)，同時(shí)其與一些甜蕎品種pin 型和thrum 型花交雜都表現(xiàn)出很好的親和性，使其成為甜蕎雜交育種的優(yōu)秀種質(zhì)資源。育種實(shí)踐證明，弄清作物自身花器官的形態(tài)特征和發(fā)育規(guī)律是開展雜交育種的前提和基礎(chǔ)。本研究以甜蕎lpls突變體為試驗(yàn)材料、通過石蠟切片技術(shù)，系統(tǒng)研究其花發(fā)育過程中大小孢子的發(fā)生與雌雄配子體的發(fā)育過程，為甜蕎自交親和性種質(zhì)的創(chuàng)制和雜交育種提供珍貴的育種材料與積累資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2019 年9 月初，挑選顆粒飽滿的甜蕎突變體lpls株系的籽粒播種于長(zhǎng)江大學(xué)作物遺傳育種研究所實(shí)驗(yàn)基地的塑膠花盆（21 cm×14 cm×20 cm），常規(guī)肥水管理。待花序分化和發(fā)育開始，每隔2 d取植株上發(fā)育分化最快的花序，立即FAA 固定液（甲醛∶冰乙酸∶70%乙醇=1∶1∶18）固定，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

多數(shù)甜蕎長(zhǎng)花柱長(zhǎng)雄蕊突變體lpls的主莖上第3片真葉開始發(fā)育時(shí)能看見花序分化，從植株主莖出現(xiàn)第3 片真葉開始，隨機(jī)選取60 個(gè)植株掛牌標(biāo)記，從中隨機(jī)選取10株掛牌植株摘除頂端花序，立即FAA 固定液固定。余下50 株掛牌標(biāo)記植株從主莖第4 片真葉發(fā)育開始，主莖上每新增1 片真葉，從中隨機(jī)選取10 株掛牌植株剝?nèi)サ? 片真葉葉腋中的花序FAA 固定液固定，直至第4 片真葉葉腋花序中的第1 朵花開放。待所有掛牌植株開花后，分別從不同發(fā)育時(shí)期的10 個(gè)花序中隨機(jī)選取3 個(gè)花序投入一個(gè)新的小瓶，用新的FAA 固定液固定，抽氣后用50%乙醇潤(rùn)洗3 次，后依次經(jīng)70%、85%、95%、100%乙醇梯度脫水，每級(jí)2 h；再經(jīng)1/2 乙醇+1/2 二甲苯、100%二甲苯透明，每級(jí)2 h；38℃條件下在純二甲苯石蠟飽和溶液中浸沒15 h，之后在68℃下用液體純蠟置換二甲苯石蠟溶液，浸蠟12 h，每4 h 換1 次新蠟，石蠟包埋成型。用Leica RM2235石蠟切片機(jī)連續(xù)切片。切片厚度8 μm。用1%番紅-0.1%固綠對(duì)染。加拿大中性樹膠封片后在CAIKON RCK-40C顯微鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜蕎長(zhǎng)花柱長(zhǎng)雄蕊突變體lpls 花的形態(tài)與發(fā)育

甜蕎長(zhǎng)花柱長(zhǎng)雄蕊突變體lpls播種4 d后種子萌發(fā)，幼苗2 d 后子葉完全展開進(jìn)入苗期，苗期約2 d 后主莖第1 片真葉開始發(fā)育，之后約每隔2 d，主莖上增加1 片真葉。多數(shù)植株主莖上第3 片真葉開始發(fā)育時(shí)能明顯看見花序分化，且通常主莖上第4 片真葉葉腋花序上發(fā)育最快的花芽最先開放，偶見第3 片真葉葉腋的花序與第4 片真葉葉腋的花序同時(shí)開花。

甜蕎長(zhǎng)花柱長(zhǎng)雄蕊突變體lpls的柱頭和花藥基本等高，其柱頭和花藥的相對(duì)位置與pin 型花和thrum 型花明顯不同。3 種花型的花被片、密腺的數(shù)量、形態(tài)和著生方式無(wú)明顯差異。

2.2 甜蕎lpls的小孢子發(fā)生和雄配子體的發(fā)育

甜蕎lpls花序隨主莖上第3 片真葉發(fā)育分化，可以看見托葉鞘中花序基部的花芽原基開始分化，出現(xiàn)半球形的花芽原基（圖版Ⅱ：1），隨后，花芽原基的兩側(cè)的細(xì)胞分裂加快，逐漸形成兩個(gè)突起，發(fā)育為雄蕊原基（圖版Ⅱ：2）；雄蕊原基頂端著生一個(gè)近方形的花藥，近方形的幼嫩的花藥外面由一層表皮細(xì)胞包裹，花藥四個(gè)角隅處表皮下的細(xì)胞分裂較快，每個(gè)角隅的表皮下分化出孢原細(xì)胞，隨后孢原細(xì)胞平周分裂為外層的周緣細(xì)胞和內(nèi)層的造孢細(xì)胞，但同一花藥每個(gè)角隅的孢原細(xì)胞分裂不同步（圖版Ⅱ：3）。隨著花粉囊壁的發(fā)育，周緣細(xì)胞經(jīng)平周分裂形成3 層細(xì)胞，緊接表皮層的外層藥室內(nèi)壁、中層和內(nèi)層多核絨氈層，同時(shí)造孢細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育為小孢子母細(xì)胞（圖版Ⅱ：4）。當(dāng)lpls主莖上第4 片真葉開始發(fā)育時(shí)，可見第4 片真葉腋花序上花芽雄蕊花藥中的小孢子母細(xì)胞通過減數(shù)分裂形成四分體，同時(shí)藥室內(nèi)壁中中層和絨氈層細(xì)胞開始解體，僅留完整的藥室內(nèi)壁細(xì)胞（圖版Ⅱ：5），甜蕎lpls突變體植株的小孢子四分體的排列方式為四面體型，小孢子四分體中偶見雙核小孢子（圖版Ⅱ：6）；在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂形成四分體的過程中，中層逐漸消失，多核絨氈層開始解體為小孢子的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)，絨氈層細(xì)胞間出現(xiàn)明顯間隙（圖版Ⅱ：6）；在花序上發(fā)育較快的花芽中，可見雄蕊花藥中小孢子四分體的胼胝質(zhì)溶解釋放小出孢子，此時(shí)的小孢子為不規(guī)則的三角形（圖版Ⅱ：7）。待主莖上第5 片真葉開始發(fā)育時(shí)，可見第4片真葉葉腋花序上花芽雄蕊花藥中的小孢子變大變圓細(xì)胞質(zhì)液泡化（圖版Ⅱ：8）；在花序上發(fā)育較快的花芽中，小孢子細(xì)胞核被中央大液泡擠到細(xì)胞一側(cè)，形成單核靠邊期小孢子（圖版Ⅱ：9）。當(dāng)主莖上第6片真葉開始發(fā)育時(shí)，第4 片真葉葉腋花序上花芽雄蕊花藥中少數(shù)單核靠邊期小孢子的細(xì)胞核進(jìn)行有絲分裂形成二細(xì)胞型花粉（圖版Ⅱ：10）。當(dāng)主莖上第7片真葉開始發(fā)育時(shí)，第4片真葉腋花序上花芽雄蕊花藥中少數(shù)小孢子細(xì)胞核再進(jìn)行一次有絲分裂，形成三細(xì)胞型花粉粒（圖版Ⅱ：11），在成熟的花粉囊中，可見花粉著色變深，細(xì)胞變大變圓，二細(xì)胞型花粉粒和三細(xì)胞型花粉粒同時(shí)存在，但多數(shù)為二細(xì)胞型花粉粒（圖版Ⅱ：12～13）。

2.3 甜蕎lpls的大孢子發(fā)生和雌配子體的發(fā)育

當(dāng)甜蕎lpls主莖上第3 片真葉開始發(fā)育時(shí)，可觀察到花序上花芽中出現(xiàn)雌蕊原基（圖版II：2），隨著雌蕊子房的發(fā)育，子房胎座上產(chǎn)生突起的珠心（圖版Ⅲ：1）。隨后，珠心表皮下分化出一個(gè)細(xì)胞體積較大、細(xì)胞質(zhì)濃、細(xì)胞核大、生理活性旺盛的孢原細(xì)胞（圖版Ⅲ：2）。孢原細(xì)胞經(jīng)平周分裂后形成一個(gè)周緣細(xì)胞和一個(gè)造孢細(xì)胞（圖版Ⅲ：3）。當(dāng)lpls主莖上第4 片真葉開始發(fā)育時(shí)，可見第4 片真葉腋花序上花芽中內(nèi)珠被開始發(fā)育，造孢細(xì)胞發(fā)育分化成大孢子母細(xì)胞，大孢子母細(xì)胞體積較周圍細(xì)胞明顯變大，并與周圍細(xì)胞有一定間隙（圖版Ⅲ：4）。待主莖第5 片真葉開始發(fā)育時(shí)，可見第4 片真葉葉腋花序上花芽中的大孢子母細(xì)胞開始減數(shù)分裂，外珠被開始分化（圖版Ⅲ：5）；隨著大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的進(jìn)行，內(nèi)珠被和外珠被逐漸向珠孔端延伸，同時(shí)內(nèi)珠被延伸至直立胚珠的1/2處（圖版Ⅲ：6）。隨著主莖上第6片真葉開始發(fā)育，第4 片真葉葉腋花序上花芽中的大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂發(fā)育形成直線型四分體（圖版Ⅲ：7）；當(dāng)主莖第7 片真葉開始發(fā)育時(shí)，第4 片真葉葉腋花序上花芽中四分體合點(diǎn)端的一個(gè)細(xì)胞發(fā)育為功能大孢子，珠孔端的3個(gè)細(xì)胞退化，此時(shí)內(nèi)、外珠被逐漸包裹胚珠（圖版Ⅲ：8）；隨后，功能大孢子進(jìn)行第一次有絲分裂形成二核胚囊，此時(shí)，內(nèi)珠被延伸至珠孔端（圖版Ⅲ：9）；發(fā)育最快的花芽中二核胚囊再次進(jìn)行2 次有絲分裂形成8 個(gè)游離的核，珠孔端和合點(diǎn)端各有1個(gè)核逐漸向中間靠攏形成中央細(xì)胞，珠孔端的卵細(xì)胞和緊鄰的2個(gè)助細(xì)胞排成三角型，形成卵器，合點(diǎn)端的3 個(gè)細(xì)胞成為反足細(xì)胞，此時(shí)外珠被延伸至珠孔端，胚囊發(fā)育成熟（圖版Ⅲ：10）。

3 討論

甜蕎為蓼科蕎麥屬具異型花的特殊的異花傳粉植物，其pin 型和thrum 型植株因雌雄蕊異位的特點(diǎn)導(dǎo)致自花、同型花間授粉不親和［6］。本實(shí)驗(yàn)室篩選純化甜蕎長(zhǎng)花柱長(zhǎng)雄蕊突變體lpls具有與同型花、pin 型和thrum 型花間授粉均能正常結(jié)實(shí)的特性，成為開展甜蕎雜交育種的珍貴材料。本研究觀察到甜蕎長(zhǎng)花柱長(zhǎng)雄蕊突變體lpls子房3 心皮合生1室、基底胎座、直立胚珠，雙珠被、厚珠心，大孢子四分體直線型排列，合點(diǎn)端為功能大孢子，典型的蓼型胚囊；花粉囊4 室，小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂中胞質(zhì)分裂為同時(shí)型，四面體型小孢子四分體，偶見四分體中出現(xiàn)雙核小孢子，成熟花粉多為2 細(xì)胞型，少量3 細(xì)胞型。甜蕎lpls的胚胎學(xué)特征與同屬花藥與柱頭等高的自花授粉植物苦蕎高度相似［7～8］。但苦蕎成熟花粉全為2 細(xì)胞型，甜蕎lpls突變體中成熟花粉粒多為2細(xì)胞型，同時(shí)存在少量的3細(xì)胞型花粉粒?？嗍w與甜蕎lpls花藥具4個(gè)小孢子囊、雙珠被、厚珠心、功能大孢子位于合點(diǎn)端、胚囊發(fā)育為蓼型，是相對(duì)原始的性狀［8～9］。表明蕎麥屬植物胚胎發(fā)育具有一定的保守性，但直立胚珠是相對(duì)進(jìn)化的特征。但目前報(bào)道的石竹目（Caryophyllales）其他科植物的胚胎學(xué)特征則相對(duì)原始，但也會(huì)出現(xiàn)一些衍生性狀。如核心石竹目商 陸 科（Phytolaccaceae）美 洲 商 陸（Phytolacca AmericanaL.）及藜科（Chenopodiacea）中華北駝絨藜［Ceratoides arborescens（Losinsk.）Tsien.et C.G.Ma］都具花藥4 室、胚珠倒生、雙珠被、厚珠心、合點(diǎn)端為功能大孢子、蓼型胚囊等典型原始胚胎學(xué)特征［9-11］；而藜科另一園藝作物甜菜（Beta vulgarisL.）具有較多的原始胚胎學(xué)特征，但出現(xiàn)了曲生胚珠和3 細(xì)胞型花粉的衍生性狀［12～13］。同時(shí)也支持了蓼科蕎麥屬植物具基底胎座、單個(gè)直立胚珠的胚胎學(xué)特征是該目的衍生類群［14～16］。另一非核心石竹目植物檉柳（Tamarix chinensisLour.）具雙珠被、厚珠心、倒生胚珠等原始特征的同時(shí)，其同時(shí)還具胚珠多數(shù)、貝母型胚囊等衍生性狀［17］。進(jìn)一步說(shuō)明石竹目植物演化的復(fù)雜性［7，15，18］。

隨著主莖上第3片真葉的發(fā)育，花序上發(fā)育較快的花芽雄蕊花藥中小孢子母細(xì)胞開始減數(shù)分裂形成四分體，而雌蕊胚珠中僅可觀察到造孢細(xì)胞。隨著主莖上第4片真葉的發(fā)育，當(dāng)花藥中小孢子四分體形成時(shí)，雌蕊胚珠中才出現(xiàn)大孢子母細(xì)胞，同時(shí)內(nèi)珠被開始發(fā)育；隨著小孢子四分體解體形成三角形小孢子，雌蕊胚囊仍停留在大孢子母細(xì)胞時(shí)期。隨著主莖第5 片真葉的發(fā)育，當(dāng)4 片真葉葉腋花序上花芽花藥中單核靠邊期小孢子出現(xiàn)時(shí)，大孢子母細(xì)胞開始減數(shù)分裂，此時(shí)胚珠外珠被開始發(fā)育。隨著主莖第6 片真葉的發(fā)育，當(dāng)4 片真葉葉腋花序上花芽花藥中出現(xiàn)2細(xì)胞型花粉粒時(shí)，胚囊中可觀察到直線型大孢四分體。隨著主莖上第7片真葉的發(fā)育，2細(xì)胞型花粉形成，雌蕊胚囊中形成功能大孢子，隨著主莖第7 片真葉的發(fā)育，當(dāng)4片真葉葉腋花序上花芽花藥花粉發(fā)育成熟，細(xì)胞型花粉粒和三細(xì)胞型花粉粒同時(shí)存在，可見胚珠中功能大孢子迅速經(jīng)過3次有絲分裂形成8核7細(xì)胞成熟胚囊。從甜蕎lpls主莖上葉齡與大、小孢子發(fā)生和雌、雄配子體發(fā)育的進(jìn)程來(lái)看，小孢子發(fā)生過程相對(duì)較快，但雄配子體的發(fā)育相對(duì)較慢；而大孢子發(fā)生過程相對(duì)較慢，但雌配子體的發(fā)育較快。在荊州地區(qū)秋播的甜蕎生育期內(nèi)，約2 d 主莖上新增1片真葉，但主莖上真葉的發(fā)育和溫度有明顯的相關(guān)性，當(dāng)日平均氣溫過低時(shí)，真葉發(fā)育會(huì)變緩甚至停止。本文為利用甜蕎lpls突變株系開展雜交育種工作積累了一定的參考資料。但甜蕎lpls雌雄蕊發(fā)育的進(jìn)度與生育期內(nèi)日平均氣溫的相關(guān)性仍有待進(jìn)一步研究。