圓頭精子癥患者精子形態(tài)觀察及全外顯子測序分析

王紅梅，李文悌，莊春波，張世杰，李興武

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科 鄭州 450052

男性原因引起的不孕不育占整個不孕不育的近50%。圓頭精子癥(globozoospermia)是一種嚴重且罕見的精子畸形[1-2]，在男性不育癥中占比不足0.1%，主要表現(xiàn)為精子頭部呈正圓形，頂體缺陷或缺失，伴隨尾部異常[3-4]，由于其頂體酶減少或缺失從而使得精子不能順利穿過卵子透明帶，不能與卵子結(jié)合而引起不育。圓頭精子癥產(chǎn)生的確切原因與機制還不十分明確，有報道[5-7]其與多種基因異常有關(guān)，如精子發(fā)生相關(guān)基因16 (spermato-genesis associated 16，SPATA16)、編碼跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白的基因DPY19L2等。本研究對1例圓頭精子癥患者的精液進行常規(guī)分析和形態(tài)學(xué)觀察，并利用全外顯子測序技術(shù)探討其基因變異情況。

1 對象與方法

1.1研究對象男性，34歲，婚后8 a(未采取避孕措施5 a)未育，體格健壯。泌尿外科常規(guī)體檢：第二性征明顯,無過敏史,無心、肺、肝等實質(zhì)臟器疾患,無吸煙、酗酒等不良習(xí)慣；B超示睪丸、輸精管、附睪、精索靜脈均正常；傳染病四項均陰性，促卵泡生成素(FSH)、泌乳素(PRL)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、黃體酮(PROG)、睪酮(TESTO)均正常，遺傳核型為46,XY，精漿生化檢測(酸性磷酸酶、中性α-糖苷酶、果糖、乳酸脫氫酶X)均正常，精子頂體酶活性降低，為45.7 μIU/106個精子(參考值≥64.9 μIU/106個精子)。禁欲5 d后手淫取精液于專用無菌大試管中，立即送實驗室進行精子質(zhì)量分析和形態(tài)學(xué)分析。同時選取健康有生育能力的志愿者的精液一并做形態(tài)學(xué)分析。本研究已通過鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研和臨床試驗倫理委員會審查，倫理審查編號：2019-KY-131。

1.2精液常規(guī)分析及精子形態(tài)學(xué)分析按第5版《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》，分別取患者和志愿者精液2 μL滴于進口專用計數(shù)池，置于西班牙SCA精子質(zhì)量分析系統(tǒng)進行精子質(zhì)量分析。分別將患者精液及志愿者精液2 μL滴于GoldCyto Spermblue精子形態(tài)染色分析玻片上，用加樣槍尖順時針、逆時針適當攪動，使標本與染液充分混合，加一次性蓋片，56 ℃加熱5 min，置OlympusCX31顯微鏡(×100)下觀察并計數(shù)異常形態(tài)精子數(shù)，計算精子頭部畸形率及圓頭精子率。

1.3全外顯子測序取患者靜脈血3 mL，EDTA-K2抗凝，送上海明碼生物科技有限責任公司進行基因全外顯子測序。測序流程如下：提取外周全血基因組DNA，依次進行末端補平、3’端腺苷化、接頭連接、片段選擇及擴增，完成 DNA 文庫構(gòu)建。然后使用安捷倫全外顯子組目標區(qū)域捕獲探針進行雜交，使用磁珠捕獲雜交的目的片段并分離純化。PCR擴增捕獲的DNA 片段并純化PCR產(chǎn)物，然后進行捕獲文庫質(zhì)檢。調(diào)整待測DNA文庫濃度，按照Illumina的標準流程進行高通量測序。最后對測序數(shù)據(jù)進行分析，使用ClinVar、OMIM 和HGMD數(shù)據(jù)庫篩選可疑的致病變異。

1.4實時熒光定量PCR檢測DPY19L2基因拷貝數(shù)變異分別取患者及健康對照者靜脈血3 mL，EDTA-K2抗凝。采用Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒提取患者血液基因組DNA，采用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ reagent (TaKaRa公司) 試劑盒檢測DPY19L2基因拷貝數(shù)相對水平。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計PCR引物，DPY19L2上游引物5’-TAGCCAAGGGAAGCCGTGAT-3’，下游引物5’-AGCCATGTGCGGGATGTAAT-3’, 由上海生工生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20 μL，含上、下游引物各0.8 μL、10 μL TB Green、2 μL DNA模板、0.4 μL ROX以及6 μL無核酸酶水。PCR反應(yīng)在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行，反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，擴增40個循環(huán)。以健康男性基因組DNA為對照，采用2-ΔCt(ΔCt=Ct患者-Ct對照)法計算患者DPY19L2基因拷貝數(shù)相對水平?；颊吆徒】祵φ諛颖靖髯?個復(fù)孔。

1.5Sanger測序檢測單核苷酸變異取患者靜脈血3 mL,抗凝，提取基因組DNA。根據(jù)DNAH1基因NM_015512.4:c.871+3G>A和ZMYND10基因NM_015896.2:c.833G>C 變異位點設(shè)計特異性引物。DNAH1上游引物5’-GCTTTCTTCCAGGTATTT GACAA-3’，下游引物5’-TGTCTACCAGCTGAGAG GTCTTG-3’；ZMYND10上游引物5’-AAAAGAG CACTGGGGTTGAG-3’，下游引物5’-GCTGGCT CACTTGAAGAGAATT-3’。使用 PCR 擴增試劑盒(TaKaRa公司)對靶序列進行擴增，反應(yīng)體系20 μL，含上、下游引物各0.8 μL，10 μL TB green，2 μL DNA模板，0.4 μL ROX以及6 μL無核酸酶水。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴增40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物送上海生工生物科技有限公司進行Sanger測序，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的參考序列進行比對。

2 結(jié)果

2.1精液常規(guī)分析及精子形態(tài)分析結(jié)果精液pH 7.5，精子活動率56.0%，前向運動(PR)：22.4%，非前向運動(NP)：33.6%，無運動(IM)：44.0%。精子密度32.7×106個/mL。 精子形態(tài)分析結(jié)果：精子頭部畸形率100%，均為圓頭精子，缺乏頂體(圖1)。

圖1 患者(左)和健康對照(右)的精子形態(tài)

2.2全外顯子測序結(jié)果分析及驗證該患者DPY19L2基因區(qū)域測序深度降低，提示DPY19L2基因純合缺失，并攜帶DNAH1(c.871+3G>A)和ZMYND10 (c.833G>C，p.Arg278Pro)基因雜合突變。與健康對照相比，該患者DPY19L2基因拷貝數(shù)相對水平明顯降低，僅為正常水平的30%[(0.293±0.109)vs(1.001±0.025)]，提示存在DPY19L2基因純合缺失。此外，對單核苷酸變異的驗證結(jié)果顯示，該患者確攜帶DNAH1基因c.871+3G>A雜合突變和ZMYND10 基因c.833G>C雜合突變(圖2)。

A：患者DNAH1基因存在c.871+3G>A雜合突變；B：DNAH1正?；蛐?；C：患者ZMYND10基因存在c.833G>C雜合突變；D：ZMYND10正?；蛐?/p>

3 討論

雖然圓頭精子癥在不育男性中的發(fā)病率低于0.1%，但臨床上并不十分罕見，根據(jù)嚴重程度可分為兩種類型：Ⅰ型，精子頭部完全不存在頂體和頂體酶；Ⅱ型，精子保留殘余頂體或存在其他形態(tài)類異常。安娜等[8]曾在透射電鏡下觀察圓頭精子的超微結(jié)構(gòu)，顯示精子質(zhì)膜破損，頂體缺失，細胞核內(nèi)含有空泡，線粒體空泡化且排列雜亂，堆疊在一起，微管的9+2結(jié)構(gòu)不明顯，精子頸部或尾部卷曲。用超高倍精子放大系統(tǒng)或傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡雖然無法觀察精子內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)，卻能較清晰地觀察精子的外部形態(tài)，染色后能清晰地觀察到精子頂體、胞核，以及空泡等，圓頭精子卻看不到頂體。由于頂體內(nèi)含有精子與卵母細胞受精所需要的酶類，因此在女性體內(nèi)缺乏頂體的異常精子不能順利穿過卵子的透明帶，就無法使卵母細胞受精，患者表現(xiàn)為不育[9]。

關(guān)于圓頭精子癥導(dǎo)致男性不育的確切機制目前尚不明確，文獻[10]報道顯示超過 80%的圓頭精子癥的發(fā)生是由于DPY19L2基因缺失導(dǎo)致。Alvarez等[11]的研究顯示，DPY19基因家族包括4個基因：DPY19L1、DPY19L2、DPY19L3和DPY19L4。DPY19L2基因的突變導(dǎo)致功能性DPY19L2蛋白的喪失，可導(dǎo)致精子生成障礙9型[MIM：613958]，從而導(dǎo)致精子頭部延長和頂體發(fā)育障礙。但是，圓頭精子癥患者除不育之外，并未發(fā)現(xiàn)其他特殊癥狀和體征，染色體和Y染色體微缺失均未見異常。本研究未檢測到明確的導(dǎo)致圓頭精子癥的致病基因或變異，也未發(fā)現(xiàn)與其表型相關(guān)的點變異及小片段插入缺失變異，卻發(fā)現(xiàn)DPY19L2基因部分區(qū)域測序深度降低，提示DPY19L2基因純合缺失。該大片段缺失變異曾在多例圓頭精子癥患者中被檢測發(fā)現(xiàn)。Koscinski等[10]對4例圓頭精子癥患者的檢測發(fā)現(xiàn)DPY19L2基因有約200 kb的純合缺失。另有研究[12]發(fā)現(xiàn)，54名圓頭精子癥患者中多名患者受累于該基因的純合缺失。該患者精液常規(guī)分析均在正常值范圍內(nèi)。

該研究結(jié)果同時顯示全外顯子測序檢測到DNAH1基因、ZMYND10基因存在變異，其基因變異信息分別為NM_015512.4:c.871+3G>A和NM_015896.2:c.833G>C(p.Arg278Pro)，均屬于雜合子突變，分別可能引起精子生成障礙18型[13][MIM:617576]和原發(fā)性纖毛運動障礙22型[14][MIM:615444]，表現(xiàn)為精子鞭毛的多種形態(tài)學(xué)缺陷和男性不育，然而這兩個基因變異目前尚不能判定與圓頭精子癥有關(guān)，有待進一步研究。

總之，圓頭精子癥基因缺陷表現(xiàn)多樣，DPY19L2基因純合缺失可能是本例圓頭精子癥的發(fā)病原因。