二十二碳六烯酸微藻油乳狀液穩(wěn)定性的影響因素

杜 健，梁井瑞，韓宗正，任建威，趙 媛，李 偉，王 劍，馮曉慧

（棗莊學院食品科學與制藥工程學院，山東 棗莊 277160）

二十二碳六烯酸（docosahexenoic acid，DHA）是一種人體必需的多不飽和脂肪酸，具有益智健腦、調節(jié)免疫功能等作用，常作為嬰幼兒配方奶粉和食品添加劑[1-3]。與魚油DHA相比，來源于微藻的DHA因結構簡單、易吸收等優(yōu)點被廣泛利用[2,4-5]，但易氧化變質的特點嚴重限制了其在食品生產中的應用[6-8]。常用的解決方法是通過噴霧干燥等手段，利用一些壁材將DHA微藻油以微膠囊包埋的形式添加在產品中，以提高其氧化穩(wěn)定性[9-11]。

DHA微藻油微膠囊產品品質不僅取決于其制備工藝，還與乳狀液的穩(wěn)定性緊密相關[12-13]。DHA乳狀液是典型的水包油（O/W）型，屬于熱力學不穩(wěn)定體系[14]。乳狀液穩(wěn)定性與乳狀液特性（如界面張力、油-水界面膜、液滴大小和連續(xù)相黏度等）密切相關[15]。在乳狀液制備過程中，加入乳化劑能夠促進O/W型乳狀液的形成。在生產中，常通過不同種類乳化劑復配方式提高乳狀液的制備效率。乳化劑復配通常選擇高或低親水親油平衡（hydrophile-lipophile balance，HLB）值乳化劑結合方式，此外，乳化劑類型和比例對乳狀液狀態(tài)有顯著影響[16]。

以辛烯基琥珀酸酯化淀粉（octenyl succinic anhydride modified starch，OSAS）為壁材通過微膠囊化制成的產品安全性高、抗氧化性好，已經在歐美和亞太的很多國家中廣泛應用[17-18]。OSAS分子中存在羧基（—COOH）[19]，在溶液中可以解離形成羧酸根離子。在乳狀液制備過程中，其可被視作陰離子表面活性劑。因此，以OSAS為壁材制備乳狀液，其水溶液能夠形成羧酸離子，導致溶液的pH值與離子種類及濃度均有密切的關聯(lián)。

本實驗以DHA微藻油為原料，以OSAS和麥芽糊精為壁材，研究在微膠囊化過程中，乳化劑種類、pH值和金屬離子對乳狀液穩(wěn)定性的影響及相應機制。以期獲得高穩(wěn)定性的DHA微藻油乳狀液，從而為獲得高質量的微膠囊產品并促進其在食品領域高效應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DHA微藻油由江蘇天凱生物科技有限公司提供。

OSAS、麥芽糊精（均為食品級） 河南鄭州成果添加劑有限公司；十二烷基硫酸鈉 上海緒雅實業(yè)有限公司；重鉻酸鉀、乙醚（均為分析純） 上海凌峰化學試劑有限公司；乙醇（分析純） 上海九億化學試劑有限公司；石油醚（沸程30～60 ℃） 北京長?；S；氨水（分析純） 上?；瘜W試劑有限公司；吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫-80、司盤60、司盤80、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、氯化鋁、三氯化鐵（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；單甘酯、蔗糖酯（均為分析純） 成都西亞試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DJM50L實驗型膠體磨 上海東華高壓均質機廠；HP-60-60型高壓均質機 上?？茖W技術大學機電廠；YC-015實驗型噴霧干燥器 上海雅程儀器設備有限公司；Lambda 25紫外-可見分光光度計 美國珀金埃爾默儀器有限公司；DDS-11C電導率儀 上海精科有限公司；DM1000顯微鏡 德國Leica公司；BZY-1型全自動表面張力儀 上海衡平儀器儀表廠；Mastersizer 2000粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；DelsaNano C Zeta電位儀 美國Beckman Coulter公司。

1.3 方法

1.3.1 乳狀液制備

將壁材（m（OSAS）∶m（麥芽糊精）＝2∶3）與水混合，40 ℃水浴攪拌10 min。加入體積分數20%的DHA微藻油，加入不同配比的乳化劑（研究金屬離子對乳狀液穩(wěn)定性的影響時加入不同價態(tài)金屬離子），設定總固形物質量分數為25%左右（研究pH值對乳狀液穩(wěn)定性的影響時調節(jié)pH值至4～9），在40 ℃水浴中繼續(xù)攪拌5 min后取出。立即將預乳液倒入膠體磨中研磨2 min后取出，倒入高壓均質機中進行兩步均質，壓力分別為30 MPa和5 MPa，均質完成后得到乳狀液。

1.3.2 乳狀液穩(wěn)定性的測定

1.3.2.1 透射光濁度法測定乳狀液穩(wěn)定性

在時間/外力作用下，乳狀液液滴體積發(fā)生變化，光的透過率也會隨之發(fā)生變化，可以此來衡量乳狀液的穩(wěn)定性。采用0.2 mol/L的重鉻酸鉀溶液作為參照，利用紫外-可見分光光度計在固定波長處，選取已制備的乳狀液，測定其透光率t的變化來確定乳狀液的穩(wěn)定性，則乳狀液穩(wěn)定性指數（emulsion stability index，ESIt）如公式（1）所示。ESIt越低，乳狀液穩(wěn)定性越強。

式中：t0為初始透光率；t為結束時的透光率。

1.3.2.2 電導率法測定乳狀液穩(wěn)定性

在25 ℃下，利用電導率儀測定乳狀液始末的電導率κ。則ESIκ如公式（2）所示。ESIκ越低，乳狀液穩(wěn)定性越強。

式中：κ0為初始電導率；κ為結束時的電導率。

1.3.3 界面膜強度的測定

通過單滴破裂率衡量界面膜強度[20]。在水平的油-水界面上，滴入50 滴乳狀液液滴。在85 ℃恒溫水浴中，用微量注射器滴1 滴破乳劑溶液，通過公式（3）計算單滴破裂率，以此表征界面膜強度。

式中：Nt為時間60 s內液滴破裂數。

1.3.4 表面張力的測定

量取10 mL乳狀液，在室溫條件下，放置于表面張力儀的玻璃皿中，儀器自動讀取數值即為乳狀液表面張力。

1.3.5 粒徑和Zeta電位的測定

將制備所得的乳狀液稀釋1 000 倍，測定粒徑和Zeta電位。室溫下采用粒度儀進行粒徑測定，設定相關參數如下：折射指數為1.47，分散劑的折射指數為1.333，吸光度為0.001。采用Zeta電位儀測定Zeta電位，測定溫度為25 ℃，上樣體積為1 mL。

1.3.6 微膠囊的制備

利用噴霧干燥方式制備DHA微藻油微膠囊產品，設定過程中進風溫度180 ℃、出風溫度（80±5）℃、風機頻率65 Hz，將制備完成的乳狀液霧化干燥，得到微膠囊產品。

1.3.7 油脂過氧化值的測定

準確稱取10 g微膠囊樣品置于500 mL具塞三角瓶中，加入50 mL蒸餾水，攪拌溶解；加入50 mL無水乙醇、30 mL乙醚以及30 mL石油醚，振蕩2 min，轉入分液漏斗，靜置分層；取下層液體，用20 mL石油醚萃取2 次，合并濾液，轉移至已恒質量的250 mL圓底燒瓶中；使用旋轉蒸發(fā)儀45 ℃下蒸干，所得即為微膠囊中的油脂。

參考GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》。將上述破壁提取的油脂置于250 mL碘瓶中，加入30 mL三氯甲烷-冰醋酸（2∶3，V/V）混合液，使得樣品完全溶解；加入1 mL飽和碘化鉀溶液，緊密塞好瓶蓋并輕輕振搖0.5 min，然后在暗處放置3 min；取出后加入100 mL水，搖勻，立即用硫代硫酸鈉標準滴定溶液（1 mol/L）滴定，至淡黃色時，加1 mL淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍色消失；在同樣條件下用水和硫代硫酸鈉標準滴定溶液做空白實驗，樣品過氧化值（peroxide value，POV）按式（4）計算。

式中：V1為樣品消耗硫代硫酸鈉標準滴定溶液體積/mL；V2為試劑空白消耗硫代硫酸鈉標準滴定溶液體積/m L；c為硫代硫酸鈉標準滴定溶液的濃度/（mol/L）；0.126 9為與1.00 mL硫代硫酸鈉標準滴定溶液（c（Na2S2O3）＝1.000 mol/L）相當的碘的質量/g；100為換算系數。

1.4 數據處理與分析

采用Microsoft Excel 2013軟件處理分析數據，采用Origin 8.6軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 乳化劑對乳狀液穩(wěn)定性的影響

2.1.1 HLB值的影響

選擇司盤80（HLB值＝4.3）和吐溫60（HLB值＝14.9）兩種乳化劑進行復配，按不同體積比混合，計算HLB值，因HLB值過高或過低均不易形成穩(wěn)定乳狀液，故控制所得乳狀液的HLB值在8～14之間。復配比例及混合后的HLB值如表1所示。

表1 乳化劑復配條件及其HLB值Table 1 Condition of mixed emulsifiers of Span 80 and Tween 60 and their HLB values

將上述復配的乳化劑添加到水相使其充分溶脹，制備乳狀液，采用透射光濁度法、電導率法分別衡量乳狀液的穩(wěn)定性，乳狀液體系的穩(wěn)定性與HLB值的關系如圖1所示。

HLB值是選擇乳化劑的重要標準，能夠反映乳化劑分子中親水基團與親油基團之間的相對含量。HLB值較高和較低的乳化劑混合使用能夠通過界面的定向吸附有效地防止乳狀液的絮凝，從而增加乳狀液的穩(wěn)定性。

未添加任何乳化劑的乳狀液ESIt為24.6%，同司盤80與吐溫60復配后HLB值約為8.0時的乳化劑基本相同（圖1）。采用ESIt和ESIκ兩種方式衡量乳狀液的穩(wěn)定性，結果表明，HLB值對乳狀液的穩(wěn)定性有明顯的影響。隨著HLB值的提高，乳狀液的穩(wěn)定性呈現先升高后降低的趨勢。當司盤80與吐溫60復配后的乳化劑HLB值為11.19時，乳狀液ESIt低至6.44%，ESIκ為9.40%，乳化劑的乳化效果最好，體系最穩(wěn)定。

圖1 不同HLB值乳化劑復配對乳狀液穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of 12 mixed emulsifiers of Span 80 and Tween 60 on emulsion stability

2.1.2 乳化劑類型和比例的影響

以2.1.1節(jié)結果為基礎，選擇日常生產中比較常用的高HLB值乳化劑（吐溫20、吐溫40、吐溫60和吐溫-80）和低HLB值乳化劑（司盤60、司盤80、單甘酯和蔗糖酯）進行兩兩復配，選出HLB值為11.19的組合，每種乳化劑的配比如表2所示。制備乳狀液，測定其穩(wěn)定性參數值，結果如圖2所示。

表2 HLB值為11.19時乳化劑復配體積比Table 2 Different combinations of emulsifiers with HLB value of 11.19

圖2 HLB值為11.9條件下不同乳化劑復配類型對乳狀液穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of emulsifier combinations with HLB value of 11.19 on emulsion stability

對照結果顯示，未添加任何乳化劑乳狀液的ESIt為24.6%。由圖2可以看出，與未添加乳化劑的體系相比，ESIt和ESIκ都較低，添加復配乳化劑的乳狀液穩(wěn)定性明顯提高。此外，雖然各乳化劑復配后得到相同的HLB值（11.19），但是其對乳狀液穩(wěn)定性的影響明顯不同。以透射光濁度法為衡量標準，吐溫20與蔗糖酯復配后的乳狀液ESIt（14.1%）約是吐溫20與單甘酯復配后乳狀液ESIt（4.3%）的3 倍?？梢姡啾扔谌榛瘎┑腍LB值，乳化劑的類型對乳狀液穩(wěn)定性的影響更明顯。

由圖2可知，不管選用何種類型的高HLB值乳化劑（吐溫20、吐溫40、吐溫60和吐溫-80），復配后所得乳狀液ESIt和ESIκ的分布范圍較為廣泛，證明高HLB值乳化劑的類型對乳狀液穩(wěn)定性影響較小。而與單甘酯復配的乳化劑體系的ESIt均低于6%，ESIκ均低于7%，證明單甘酯的乳化效果最佳，其中吐溫20與單甘酯復配后，ESIt為4.3%，所制備得到的乳狀液最為穩(wěn)定。

為探究產生這種現象的機理，選擇吐溫20與4 種低HLB值乳化劑復配，及吐溫40與單甘酯復配進行乳狀液的制備，測定乳狀液的表面張力和界面膜強度（以單滴破裂率表征），結果如圖3所示。

圖3 乳化劑復配類型對乳狀液穩(wěn)定性、表面張力和單滴破裂率的影響Fig.3 Effect of selected emulsifier combinations on emulsion stability,surface tension and breaking rate of single droplets

由圖3可知，不同的乳化劑復配類型下，表面張力和界面膜強度均明顯不同。乳狀液的穩(wěn)定性與表面張力隨復配類型的變化趨勢有所不同，證明乳狀液穩(wěn)定性與表面張力的相關性較低，表明表面張力對乳狀液穩(wěn)定性的影響程度較小，這可能是表面張力的改變與聚合物在液-液界面上的聚集速度與時間無關所致[21]。乳狀液穩(wěn)定性和界面膜強度（單滴破裂率）緊密相關。乳狀液中的液滴可能因頻繁相互碰撞而破裂，因此，液滴的機械強度是影響乳狀液穩(wěn)定性的決定因素[22-23]。乳化劑的結構和性質明顯影響液滴的界面膜強度。由圖3可知，吐溫20與單甘酯復配后制備所得的乳狀液單滴破裂率最低，表明液滴界面膜強度較高。這可能由于單甘酯的長鏈結構有助于其與吐溫20之間通過側向相互作用形成較為緊密的分子復合物，促進其吸附于界面層，并形成較為緊密的排列，因此制備所得的乳狀液界面膜強度和穩(wěn)定性較高[24]。

2.1.3 乳化劑添加量的影響

乳化劑添加量與其吸附量密切相關，從而能夠影響乳狀液穩(wěn)定性。以不同添加量（占乳狀液總體積的比例）的吐溫20與單甘酯復配乳化劑為研究對象，對制備所得乳狀液穩(wěn)定性和界面膜強度的影響結果分別見圖4、5。

圖4 乳化劑添加量對乳狀液穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of emulsifier concentration on emulsion stability

圖5 乳化劑添加量對單滴破裂率的影響Fig.5 Effect of emulsifier concentration on breaking rate of single droplets

由圖4可知，乳狀液的穩(wěn)定性隨著乳化劑添加量的增加而得到明顯提高。這是因為乳化劑添加量較低時，在界面上吸附的分子較少，膜中分子排列松散，界面膜的強度較低（單滴破裂率較高）[25]。如圖5所示，乳化劑添加量0.2%時的單滴破裂率為48.0%，因此會形成不穩(wěn)定的乳狀液；當乳化劑添加量增加至1.2%后，體系的ESI逐漸穩(wěn)定；繼續(xù)添加乳化劑對乳狀液穩(wěn)定性基本沒有影響。這是由于當乳化劑添加量增加到一定程度后，乳化劑分子定向吸附于界面上，在界面上的吸附量達到飽和，且形成緊密排列的高強度界面膜（如圖5所示，乳化劑添加量為1.2%時，單滴破裂率為31.3%），因此，乳狀液穩(wěn)定性較高[25]。但是，乳化劑添加量過高會導致乳狀液黏度提高，成本增加。合適的乳化劑添加量對于DHA微膠囊的生產有重要意義[26]。綜合以上分析，可選擇1.2%作為后續(xù)研究中乳化劑的添加量。

2.2 乳狀液pH值和金屬離子對乳狀液穩(wěn)定性的影響

2.2.1 乳狀液pH值對乳液穩(wěn)定性的影響

乳狀液制備過程中，水相溶解混勻過程中調節(jié)體系的pH值至4～9。測定乳狀液的穩(wěn)定性，結果見圖6。

圖6 pH值對乳狀液穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of pH on emulsion stability

由圖6可見，隨著pH值不斷增加，體系的ESI不斷下降，乳狀液的穩(wěn)定性越來越高。當pH值大于7時，乳狀液的穩(wěn)定性基本保持不變。為探究造成這種現象的原因，在乳狀液制備過程中，調節(jié)體系的pH值至4～8，測定體系中pH值變化對乳狀液Zeta電位和粒徑的影響，結果分別如圖7、8所示。

圖7 不同pH值條件下乳狀液Zeta電位Fig.7 Effect of pH on zeta potential of emulsions

圖8 不同pH值條件下乳狀液粒徑分布Fig.8 Effect of pH on particle size distribution of emulsions

由圖7可見，當乳狀液的pH值為4時，Zeta電位為4.3 mV，體系帶正電。因OSAS含有的羧基陰離子可以使油滴表面帶負電荷，所以在pH值為4時，油滴之間容易因靜電引力發(fā)生聚集，造成油滴粒徑較大。由圖8可知，在pH值為4時粒徑分布于10～100 μm之間的油滴最多。隨著pH值的增大，Zeta電位降低，當pH值為5時，Zeta電位為-5.1 mV，體系開始帶負電荷。OSAS產生的來自于羧基的陰離子可以使油滴表面帶負電荷，通過增加排斥作用減少油滴聚結[27]，粒徑明顯降低。由圖8可見，pH值為5時，粒徑分布于10～100 μm之間的油滴數量明顯降低，在1～10 μm之間的油滴數量提高。當pH值大于7時，乳狀液體系的Zeta電位分別為-21.12 mV（pH 7）和-24.01 mV（pH 8），體系帶負電荷較多；體系中粒徑分布于1～10 μm之間的油滴數量明顯提高，證明其乳狀液內的油滴粒子較少發(fā)生聚集，乳狀液的穩(wěn)定性較高。由此可見，pH值改變造成的乳狀液穩(wěn)定性變化是由體系電荷變化所引起的油滴聚結或分散所致。

2.2.2 金屬離子對乳狀液穩(wěn)定性的影響

在乳狀液制備過程中加入的金屬離子可能影響乳狀液穩(wěn)定性。選擇不同價態(tài)的金屬離子添加至乳狀液中（離子添加量為所占乳狀液質量的比例），探究金屬離子添加對乳狀液穩(wěn)定性的影響，結果如圖9所示。

圖9 金屬離子對乳狀液穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effects of metal ions on emulsion stability

由圖9可見，除Fe3+外，一價（Na+、K+）、二價（Ca2+、Mg2+）以及三價（Al3+）金屬離子對乳狀液穩(wěn)定性的影響趨勢基本一致。隨著離子添加量的增加，ESIt呈現先降低后升高的趨勢，表明低濃度的金屬離子能夠促進乳狀液穩(wěn)定性提高。這是由于在乳狀液中，顆粒之間存在著一定的能壘，能壘與電解質濃度相關[28]。一定量的金屬離子可以加深能壘，防止乳狀液發(fā)生絮凝，從而形成開放的網狀結構，減少分層沉降[29]。當金屬離子達到一定量后，離子濃度的增加會造成乳狀液穩(wěn)定性逐漸降低。較高的金屬離子添加量會減少乳液體系的電動電荷，降低顆粒/液滴間的表面電勢，導致絮凝和聚結，所以當離子添加量達到一定后，ESI均上升，乳狀液的穩(wěn)定性下降。

此外，與低價金屬離子相比，高價離子造成乳狀液穩(wěn)定性降低的臨界濃度較低，表明高價離子更容易破壞乳狀液。其主要原因是高價金屬離子可以通過破壞界面膜、減少靜電斥力、增強疏水性、壓縮油-水基團擴散雙電層等方式破壞DHA乳狀液體系，造成其穩(wěn)定性下降[30-31]。

與其他離子均不同，即使Fe3+添加量較低，仍能夠明顯降低乳狀液的穩(wěn)定性。這是由于Fe3+不僅能夠通過破壞界面膜等機制作用于乳狀液，而且能夠通過促進DHA氧化破壞乳狀液的穩(wěn)定性[32]。

圖10 Fe3+對DHA微藻油的氧化作用Fig.10 Oxidation effect of Fe3+ on DHA-rich microalgal oil

由圖10可見，乳狀液制備過程中加入0.1%的Fe3+，制得的微膠囊在放置1 5 d 后，D H A 微藻油的P O V為4.66 g/100 g，比不加任何金屬離子的乳狀液POV（2.89 g/100 g）高61%，說明Fe3+對DHA微藻油有較強的氧化作用。當Fe3+的添加量提升至5%以上時，乳狀液的界面膜、油-水基團擴散雙電層被破壞，加之DHA油脂被氧化溢出，導致OSAS包裹的DHA油脂顆粒之間發(fā)生溶脹，水合作用不斷加強。乳狀液可能會遭到徹底破壞，宏觀表現為不溶性懸濁狀態(tài)（圖11）。

圖11 加入高濃度Fe3+后乳狀液狀態(tài)Fig.11 Appearance of emulsion added with high concentration of Fe3+

3 結 論

乳狀液的穩(wěn)定性對于DHA微藻油微膠囊產品的品質和貨架期有很大影響。對乳狀液穩(wěn)定性影響因素進行深入研究有助于提高DHA微膠囊的品質，促進其在食品領域的廣泛應用。本實驗研究了微藻油DHA乳狀液制備過程中的影響因素，并對其機制進行了分析。結果發(fā)現，乳狀液制備過程中，乳化劑的添加能夠有效促進乳狀液穩(wěn)定性的提高。相比于復配乳化劑的HLB值，乳化劑的類型對穩(wěn)定性的影響更為明顯，這與在乳狀液制備過程中不同的乳化劑形成不同強度的界面膜有關。復配乳化劑添加量越多，形成的界面膜強度越高，乳狀液穩(wěn)定性越強。乳狀液的pH值和金屬離子均能明顯影響其穩(wěn)定性。提高乳狀液的pH值能夠促進乳狀液通過靜電斥力等作用避免顆粒之間的碰撞，從而形成粒徑較小的乳狀液，促進其穩(wěn)定性的提高。隨著金屬離子添加量提高，乳狀液穩(wěn)定性呈現先提高后降低的趨勢；而且高價離子對乳狀液的穩(wěn)定性影響更為明顯。Fe3+能夠氧化DHA微藻油，明顯降低乳狀液的穩(wěn)定性。本研究對于有針對性地提高DHA微藻油乳狀液穩(wěn)定性和開發(fā)高質量微膠囊具有一定的指導意義。