外源24-表油菜素內(nèi)酯調(diào)控仔姜活性氧及酚類代謝減輕冷害

游玉明，湯 潔，張美霞，王大平，陸紅佳

（1.經(jīng)濟(jì)植物生物技術(shù)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402160；2.重慶文理學(xué)院園林與生命科學(xué)學(xué)院，重慶 402160）

生姜（Zingiber officinaleRoscoe）富含精油、姜辣素及維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是世界范圍內(nèi)廣泛食用的蔬菜和調(diào)味料之一。新鮮仔姜因姜香濃郁、脆嫩爽口、辛辣適宜而受到了消費(fèi)者的青睞。然而仔姜外皮幼嫩、水分含量高、纖維素含量低，且采收后葉鞘及莖基部分受到機(jī)械損傷，常溫貯藏5～7 d即發(fā)生失水萎蔫，受微生物浸染出現(xiàn)腐爛，從而失去商品價(jià)值[1-2]。低溫能有效緩解仔姜的采后腐爛和變質(zhì)，但其對(duì)低溫敏感，當(dāng)貯藏溫度低于10 ℃時(shí)，即出現(xiàn)水漬狀斑塊，并發(fā)生硬度降低及褐變等冷害癥狀[3-4]，限制了低溫貯藏技術(shù)在仔姜保鮮中的應(yīng)用。因此，研究減輕仔姜冷害發(fā)生的控制措施對(duì)延長(zhǎng)其保鮮期具有重要意義。

24-表油菜素內(nèi)酯（24-epibrassionolide，EBR）是一種重要的甾醇類植物激素，具有高效安全的生物效應(yīng)，不僅在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用，且能提高植物在低溫、鹽、干旱及微生物浸染等生物或非生物脅迫下的抗逆性[5]。因此，EBR在果蔬采后病害的防控方面也有廣泛的應(yīng)用。EBR處理可提高獼猴桃[6]、蜜橘[7]、西蘭花[8]等的貯藏品質(zhì)和耐貯性，并通過(guò)提高抗病相關(guān)酶活性，增強(qiáng)葡萄的抗病性[9]。在果蔬采后冷害防控方面，Gao Hui等研究發(fā)現(xiàn)茄和桃果實(shí)分別采用10 μmol/L和15 μmol/L EBR浸泡10 min后，可顯著抑制冷害的發(fā)生，維持細(xì)胞功能的完整性，抑制多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）及過(guò)氧化物酶等酚類代謝相關(guān)酶的活性，保持較高的酚類物質(zhì)含量[10-11]。外源EBR處理也能通過(guò)調(diào)節(jié)杏果實(shí)的活性氧代謝（表現(xiàn)為?、H2O2的積累減少，保持較高的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）等活性氧代謝相關(guān)酶活性）從而顯著降低果實(shí)冷害發(fā)病率和冷害指數(shù)[12]。Li Taotao等[13]研究則表明，40 μmol/L EBR處理可以增強(qiáng)香蕉果實(shí)的防御能力，促進(jìn)能量的合成和利用，并通過(guò)促進(jìn)蛋白質(zhì)生物合成和抑制蛋白質(zhì)降解來(lái)維持蛋白質(zhì)功能，從而提高果實(shí)的耐冷性。但外源EBR處理對(duì)仔姜冷害的防控效果及可能機(jī)制還鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以鮮食生姜品種‘竹根姜’為實(shí)驗(yàn)材料，研究外源EBR處理對(duì)仔姜冷害的防控效果，并從活性氧及酚類代謝方面探討其可能的作用機(jī)制，以期為外源EBR在仔姜保鮮中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮‘竹根姜’采自重慶市永川區(qū)五間鎮(zhèn)生姜種植基地。選取成熟度一致、大小均勻、無(wú)病蟲(chóng)害的根莖作為供試材料。

EBR（純度＞90%） 上海源葉生物科技有限公司；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；福林-酚北京索萊寶科技有限公司；茚三酮、磺基水楊酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

752分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；S p e c t r a M a x M 4 酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；TA.XT plus質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；CM-5色差計(jì) 日本柯尼卡美能達(dá)公司；BS224S電子分析天平 德國(guó)賽多利斯公司；FE38電導(dǎo)率儀 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；3-18K冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

挑選好的‘竹根姜’根莖采用體積分?jǐn)?shù)1%的次氯酸鈉溶液消毒2 min，再以自來(lái)水洗凈，室溫自然瀝干。將清洗消毒后的仔姜隨機(jī)分成4 組，分別采用0（對(duì)照）、5、10 μmol/L及20 μmol/L的EBR溶液浸泡30 min，取出自然晾干后裝入厚0.03 mm的聚乙烯袋，每袋5 個(gè)，置于4 ℃、相對(duì)濕度85%～90%的冷庫(kù)中貯藏25 d。每個(gè)處理80 個(gè)仔姜，重復(fù)3 次。每5 d取10 個(gè)樣品測(cè)定冷害指數(shù)，篩選出對(duì)仔姜冷害抑制的最佳濃度。

在篩選出最佳濃度的基礎(chǔ)上，將仔姜隨機(jī)分為對(duì)照組和處理組，按上述方法進(jìn)行浸泡處理，貯藏25 d。每5 d定時(shí)取樣測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量等變化。同時(shí)取仔姜根莖中部立即用液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中，用于測(cè)定相關(guān)酶活力。

1.3.2 冷害指數(shù)的測(cè)定

冷害指數(shù)的測(cè)定參考Hao Jiashi等[14]的方法，并略作修改。根據(jù)仔姜根莖水漬狀斑塊面積大小分級(jí)：1級(jí)，無(wú)冷害發(fā)生；2級(jí)，冷害面積比例≤25%；3級(jí)，冷害面積比例25%～50%；4級(jí)，冷害面積比例50%～80%；5級(jí)，冷害面積比例≥80%。冷害指數(shù)按公式（1）計(jì)算。

1.3.3 硬度及色澤的測(cè)定

選取仔姜根莖中部，將其制備成均勻的姜塊，采用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定其硬度，選用直徑為5 mm探頭，刺入速率為1.8 mm/s，壓縮比為50%[15]。

色澤測(cè)定采用Chen Aiqiang等[16]的方法。選仔姜根莖中部附近表皮，測(cè)定其貯藏前的色澤（L0*、a0*、b0*值）和貯藏后的色澤（L*、a*、b*值），并按式（2）計(jì)算色差ΔE。

1.3.4 相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛含量的測(cè)定

相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定參考凌晨等[17]的方法。用直徑為10 mm的打孔器取樣，稱取厚約3 mm的薄片2 g，用濾紙吸出多余水分后放入具塞刻度試管中，加入20 mL去離子水，在室溫下放置30 min，測(cè)電導(dǎo)率（κ1/（μS/cm））。然后煮沸15 min，冷卻至室溫后測(cè)電導(dǎo)率（κ2/（μS/cm））。相對(duì)電導(dǎo)率按公式（3）計(jì)算。

丙二醛含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[18]，分別測(cè)定上清液在450、532 nm和600 nm波長(zhǎng)處的吸光度，含量單位為μmol/g，結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3.5 H2O2含量的測(cè)定

H2O2含量的測(cè)定采用硫酸鈦法[11]。稱取5 g混勻后的樣品，經(jīng)預(yù)冷的丙酮充分研磨，在4 ℃、5 000×g條件下離心15 min，取上清液1 mL，加入0.1 mL 5 g/100 mL的硫酸鈦和0.2 mL濃氨水反應(yīng)后，再在4 ℃、5 000×g條件下離心10 min，沉淀經(jīng)丙酮洗滌，最后在沉淀中加入3 mL 2 mol/L的濃硫酸溶液，于410 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，單位為μmol/g，結(jié)果以鮮質(zhì)量表示。

1.3.6 總酚含量的測(cè)定

總酚含量的測(cè)定參照高林等[19]的方法，具體采用Folin-Ciocalteu比色法。取2 g樣品，加入6 mL無(wú)水甲醇，超聲波提取，在4 ℃、10 000×g條件下離心10 min，取上清液定容至10 mL。取上述提取液0.4 mL，加入體積分?jǐn)?shù)10%的Folin-Ciocalteu試劑2 mL，避光反應(yīng)1 h，再加入1.8 mL 7.5 g/100 mL Na2CO3溶液，避光反應(yīng)15 min，于765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果以每克鮮樣中含有的沒(méi)食子酸質(zhì)量表示，單位為mg/g。

1.3.7 相關(guān)酶活力的測(cè)定

SOD、CAT及APX活力測(cè)定采用曹建康等[20]的方法，并略作修改。稱取5 g仔姜組織，加入5 mL預(yù)冷的50 mmol/L的磷酸鈉緩沖液（pH 7.8，含1 mmol/L乙二胺四乙酸、5 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮），冰浴研磨勻漿后，于4 ℃、12 000×g離心30 min，收集上清液用于SOD、CAT和APX活力測(cè)定。SOD活力采用氮藍(lán)四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）光化還原法，以每克鮮組織抑制NBT光還原反應(yīng)50%為一個(gè)酶活力單位（U）；CAT和APX活力分別以每克鮮組織每分鐘在240 nm和290 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.01為一個(gè)酶活力單位（U）。

PPO和苯丙氨酸解氨酶（phenylalamine ammonia lyase，PAL）活力測(cè)定參考Kavitha等[21]的方法。分別以每克鮮組織每分鐘在420 nm和290 nm處吸光度增加0.01為一個(gè)PPO和PAL活力單位（U）。

以上酶活力單位均為U/（g·min）

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過(guò)Duncan’s法進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著；利用Origin 8.1軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EBR處理濃度的篩選結(jié)果

如圖1A所示，各處理組仔姜的冷害指數(shù)隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，其冷害癥狀表現(xiàn)出時(shí)間累積效應(yīng)，但不同濃度EBR處理對(duì)冷藏仔姜冷害指數(shù)的影響不同。其中采用10 μmol/L EBR處理的仔姜在整個(gè)冷藏期的同一監(jiān)測(cè)點(diǎn)，其冷害指數(shù)均低于其他組。在冷藏至第5天時(shí)，仔姜表皮出現(xiàn)水漬狀凹陷及黃褐色小斑點(diǎn)，并隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸擴(kuò)大，冷藏15 d后，5、10 μmol/L和20 μmol/L EBR處理組仔姜的冷害指數(shù)分別為15.6%、9.4%和21.3%，對(duì)照組仔姜的冷害指數(shù)則達(dá)到了31.0%，顯著高于各EBR處理組（P＜0.05），到冷藏結(jié)束時(shí)，各處理組間的表型差異最為明顯（圖1B），對(duì)照組仔姜的冷害指數(shù)仍顯著高于各EBR處理組（P＜0.05），5、20 μmol/L EBR處理組仔姜的冷害指數(shù)分別為57.1%和69.2%，而10 μmol/L EBR處理組仔姜的冷害指數(shù)最低，僅為對(duì)照組的51.8%，說(shuō)明EBR處理能顯著緩解仔姜冷藏期間冷害的發(fā)生（P＜0.05），延長(zhǎng)其保藏期，其處理的適宜處理濃度為10 μmol/L。因此，本實(shí)驗(yàn)選用濃度為10 μmol/L的EBR進(jìn)一步探討其緩解仔姜冷害的可能機(jī)制。

圖1 EBR處理對(duì)仔姜冷害的影響Fig.1 Effect of EBR treatment on CI of baby ginger rhizome

2.2 EBR處理對(duì)仔姜硬度及色澤的影響

由圖2A可知，隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組和對(duì)照組硬度不斷降低，冷藏至第10天時(shí)，兩者之間出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），10 d后處理組的硬度均極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），冷藏至25 d時(shí)，處理組硬度比對(duì)照組高38.6%。表明EBR處理可有效減緩仔姜冷藏期間硬度的下降，防止仔姜組織軟化。

從圖2B可看出，總色差ΔE隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，冷藏前10 d其上升速率較慢，而后快速增加。其中EBR處理組ΔE變化較小，冷藏至25 d時(shí)，僅為對(duì)照組的48.1%，兩者之間達(dá)到了極顯著差異（P＜0.01）。說(shuō)明EBR處理能有效抑制仔姜冷藏過(guò)程中色澤的變化，從而較好地保持了仔姜色澤。

圖2 EBR處理對(duì)仔姜硬度（A）及色澤（B）的影響Fig.2 Effect of EBR treatment on firmness (A) and color (B) of baby ginger rhizome

2.3 EBR處理對(duì)仔姜活性氧及酚類代謝的影響

2.3.1 EBR處理對(duì)仔姜相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛含量的影響

圖3 EBR處理對(duì)仔姜相對(duì)電導(dǎo)率（A）及丙二醛含量（B）的影響Fig.3 Effect of EBR treatment on relative electric conductivity (A)and MDA content (B) in baby ginger rhizome

由圖3A、B可以看出，在仔姜冷藏期間，相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。EBR處理有效抑制了仔姜相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛含量的上升，冷藏至第10天時(shí)，EBR處理組丙二醛含量極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），冷藏至25 d時(shí)，EBR處理組相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛含量分別比對(duì)照組低24.6%和10.5%（P＜0.05）。說(shuō)明EBR處理能保護(hù)仔姜冷藏期間細(xì)胞膜的完整性，減輕低溫脅迫對(duì)細(xì)胞膜的損傷，抑制膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛的積累。

2.3.2 EBR處理對(duì)仔姜H2O2含量及SOD、CAT、APX活力的影響

圖4 EBR處理對(duì)仔姜H2O2含量（A）及SOD（B）、CAT（C）、APX（D）活力的影響Fig.4 Effect of EBR treatment on H2O2 content (A), SOD (B), CAT (C)and APX (D) activity in baby ginger rhizome

由圖4A可知，仔姜在冷藏期間，H2O2含量不斷增加。在整個(gè)冷藏過(guò)程中，EBR處理組H2O2含量始終低于對(duì)照組，冷藏至第25天時(shí)，EBR處理組H2O2含量比對(duì)照組低24.8%（P＜0.01）。

由圖4B可知，仔姜在冷藏過(guò)程中，對(duì)照組和EBR處理組SOD活力均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但EBR處理組上升速率高于對(duì)照組，除冷藏第5、15天外，EBR處理組SOD活力均顯著高于對(duì)照組，冷藏至25 d時(shí)，EBR處理組SOD活力為2.90 U/（g·min），比對(duì)照組高9.0%（P＜0.01）。可見(jiàn)，EBR處理提高了冷藏期間仔姜的SOD活力。

由圖4C可知，仔姜在冷藏過(guò)程中，其CAT活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，對(duì)照組仔姜的CAT活力在冷藏至5 d時(shí)出現(xiàn)了峰值（56.73 U/（g·min）），隨后開(kāi)始下降，在冷藏至25 d時(shí)，CAT活力下降至28.11 U/（g·min）；EBR處理組也在冷藏至5 d時(shí)達(dá)到峰值（63.11 U/（g·min）），其峰值比對(duì)照組仔姜高11.2%，冷藏至25 d時(shí)，其CAT活力為38.14 U/（g·min），比對(duì)照組高35.7%（P＜0.01）。說(shuō)明EBR處理減緩了仔姜冷藏期間CAT活力的下降。

由圖4D可見(jiàn)，仔姜在冷藏過(guò)程中，其APX活力的變化趨勢(shì)與CAT活力的變化趨勢(shì)基本一致。但在冷藏至第10天時(shí)，EBR處理組和對(duì)照組的APX活力均達(dá)到峰值，其中對(duì)照組為76.92 U/（g·min），EBR處理組為82.15 U/（g·min），比對(duì)照組高6.8%，隨后開(kāi)始下降，冷藏至25 d時(shí)，EBR處理組APX活力為61.72 U/（g·min），比對(duì)照組高33.2%（P＜0.01）。說(shuō)明EBR處理提高了仔姜冷藏期間APX的活力。

2.3.3 EBR處理對(duì)仔姜總酚含量及PAL、PPO活力的影響

圖5 EBR處理對(duì)仔姜總酚含量（A）和PAL（B）、PPO（C）活力的影響Fig.5 Effect of EBR treatment on total phenol content (A), and PAL (B)and PPO (C) activity in baby ginger rhizome

由圖5A可知，仔姜在冷藏過(guò)程中，總酚含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，且在冷藏至第5天時(shí)EBR處理組和對(duì)照組均出現(xiàn)峰值，其中對(duì)照組總酚含量為0.20 mg/g，EBR處理組則為0.23 mg/g，比對(duì)照組高15.0%，冷藏至25 d時(shí)，EBR處理組總酚含量為0.18 mg/g，比對(duì)照組高38.5%（P＜0.01），與對(duì)照組第10天時(shí)總酚含量相當(dāng)。由此可見(jiàn)，EBR處理可以維持仔姜冷藏過(guò)程中較高的酚類物質(zhì)含量。

由圖5B可知，仔姜冷藏期間，對(duì)照組及EBR處理組PAL活力總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，EBR處理提高了仔姜PAL的活力，冷藏至25 d時(shí)，EBR處理組PAL的活力為55.47 U/（g·min），比對(duì)照組高24.8%（P＜0.01）。說(shuō)明EBR處理可有效激活PAL活力，促進(jìn)酚類物質(zhì)的合成。

由圖5C可知，仔姜冷藏期間，其PPO活力的變化趨勢(shì)與PAL活力的變化趨勢(shì)基本一致。但EBR處理抑制了仔姜PPO的活力，尤其是在冷藏后期，兩者之間達(dá)到極顯著差異（P＜0.01），冷藏至25 d時(shí)，EBR處理組PPO活力為3.01 U/（g·min），比對(duì)照組低17.3%（P＜0.01）?？梢?jiàn)，EBR處理可明顯抑制PPO活力，緩解酚類物質(zhì)氧化。

2.4 相關(guān)性分析結(jié)果

表1 仔姜冷害指數(shù)與主要生理品質(zhì)指標(biāo)間的皮爾遜相關(guān)性分析Table 1 Pearson correlation analysis between CI and main physiological indicators of baby ginger rhizome

從表1可以看出，冷害指數(shù)與相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量和H2O2含量、SOD活力呈極顯著正相關(guān)（r分別為0.890、0.788、0.958、0.787，P＜0.01），與CAT和APX活力呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），說(shuō)明隨著冷害癥狀的發(fā)生，仔姜細(xì)胞膜的完整性被破壞，膜通透性增加，膜脂過(guò)氧化物丙二醛、H2O2的積累增多，從而激發(fā)SOD活力的增加，但會(huì)引起CAT和APX活力的降低。冷害指數(shù)與總酚含量呈負(fù)相關(guān)，但兩者間的相關(guān)性不顯著（P＞0.05），這可能是隨著冷害的發(fā)生，植物組織產(chǎn)生防御反應(yīng)，激發(fā)了PAL活力的上升，促進(jìn)了酚類的合成，但細(xì)胞間區(qū)室化被破壞，PPO游離出來(lái)，導(dǎo)致了酚類物質(zhì)的大量消耗，從而引起褐變，表現(xiàn)為ΔE與冷害指數(shù)之間呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

3 討 論

仔姜在低溫下極易發(fā)生冷害現(xiàn)象，隨著冷害的發(fā)生，其色澤和硬度產(chǎn)生相應(yīng)變化，表現(xiàn)為冷害指數(shù)與硬度呈極顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.897），而與ΔE呈極顯著正相關(guān)（r＝0.918），這嚴(yán)重影響了其貨架期和品質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外源EBR處理緩解了仔姜冷害的發(fā)生，顯著降低了仔姜的冷害指數(shù)，保持了良好的色澤及硬度，其中以10 μmol/L EBR處理效果最為明顯。

研究表明，活性氧代謝失衡是導(dǎo)致植物在低溫脅迫下發(fā)生冷害的主要原因之一[22-23]。在正常狀態(tài)下，植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)植物受到低溫脅迫時(shí)，這種平衡遭到破壞，導(dǎo)致大量活性氧自由基產(chǎn)生，使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化作用，破壞細(xì)胞膜的完整性，使過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛積累，電解質(zhì)外滲，最終導(dǎo)致果蔬品質(zhì)劣變[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，隨著冷害的產(chǎn)生，仔姜H2O2及丙二醛的含量不斷增加，細(xì)胞膜透性增強(qiáng)，相對(duì)電導(dǎo)率逐漸上升，三者與冷害指數(shù)之間均表現(xiàn)為極顯著正相關(guān)。因此，通過(guò)適當(dāng)?shù)牟珊筇幚碚{(diào)節(jié)果蔬在低溫脅迫下的活性氧代謝失衡，是提高果蔬抗冷性、延長(zhǎng)其貨架期的有效手段之一。研究表明，多種外源化學(xué)成分或物理方式處理可通過(guò)調(diào)節(jié)果蔬活性氧代謝來(lái)達(dá)到延長(zhǎng)果蔬貨架期的目的。如赤霉素[25]和精氨酸[26]等化學(xué)保鮮劑可分別通過(guò)抑制香椿和石榴冷藏過(guò)程中丙二醛及H2O2含量的上升，減少膜脂過(guò)氧化作用，增強(qiáng)其抗冷性，減輕冷害癥狀。冷激及熱處理等物理方式也可通過(guò)改善冷藏過(guò)程中茄子[27]、哈密瓜[28]等活性氧代謝紊亂，從而減輕果蔬的冷害。Yao Yaming等[29]研究表明，黃花菜經(jīng)0.5 mg/L EBR處理可顯著減少?和H2O2的積累，維持細(xì)胞膜的完整性，從而延緩其衰老進(jìn)程，保持較好的貯藏品質(zhì)。本研究也發(fā)現(xiàn)，采用EBR處理顯著降低了仔姜在冷藏過(guò)程丙二醛及H2O2的含量，抑制其細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)的外滲，保持了細(xì)胞的完整性。為清除產(chǎn)生的過(guò)量活性氧自由基，植物體內(nèi)擁有復(fù)雜而完善的抗氧化防御系統(tǒng)，其中SOD、CAT及APX等主要酶類在活性氧清除系統(tǒng)中發(fā)揮了重要作用，SOD可催化?歧化生產(chǎn)H2O2，生成的H2O2再被CAT、APX分解成無(wú)毒的H2O和O2，它們之間的相互協(xié)同以減輕活性氧自由基對(duì)細(xì)胞膜的傷害，從而抑制活性氧自由基誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，冷害誘導(dǎo)了仔姜SOD、CAT及APX活力的改變，其冷害指數(shù)與SOD、CAT及APX活力均顯著相關(guān)，而EBR處理有效提高了仔姜SOD、CAT及APX活力。Wang Xiaolu等[6]研究也表明，EBR處理可通過(guò)上調(diào)獼猴桃SOD及APX等抗氧化酶活力，減小氧化損傷。以上結(jié)果說(shuō)明，激活仔姜活性氧代謝相關(guān)酶活力，減少機(jī)體活力氧自由基的積累，可能是EBR提高其耐冷力的潛在機(jī)理之一。

酚類物質(zhì)作為植物體內(nèi)的重要次生代謝產(chǎn)物，它不僅是植物體內(nèi)重要的非酶抗氧化劑，還是酶促褐變反應(yīng)的必要底物。很多冷敏性果蔬在低溫脅迫下都伴隨著酚類物質(zhì)含量的增加，而適當(dāng)?shù)牟珊筇幚砜梢酝ㄟ^(guò)積累更多的酚類物質(zhì)，減小氧化損傷，從而緩解果蔬冷害癥狀[31-32]。酚類物質(zhì)的代謝與PAL和PPO等酶密切相關(guān)，PAL是酚類生物合成的關(guān)鍵酶和限速酶，可催化苯丙氨酸脫氨轉(zhuǎn)化成肉桂酸；PPO作為植物體內(nèi)廣泛存在的酶類，在有氧的情況下將酚類物質(zhì)催化轉(zhuǎn)變成紅褐色，再與氨基酸縮合生成黑褐色物質(zhì)[33]。正常狀態(tài)下，酚類物質(zhì)與這些酶的區(qū)域化分布抑制了酶促褐變，但在低溫脅迫下植物細(xì)胞膜透性增加，細(xì)胞區(qū)域化逐漸喪失，使得酚類物質(zhì)與酶接觸，最終導(dǎo)致酚類物質(zhì)的減少，組織褐變[34]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，冷害導(dǎo)致了仔姜PAL和PPO活力的上升，表現(xiàn)為冷害指數(shù)與PAL和PPO活力呈極顯著正相關(guān)，而EBR處理后仔姜PAL活力增加，促進(jìn)了酚類物質(zhì)的合成；同時(shí)，顯著抑制了PPO的活力，減少了酚類物質(zhì)的消耗。說(shuō)明EBR可通過(guò)調(diào)節(jié)酚類物質(zhì)代謝相關(guān)酶類，保持較高的酚類物質(zhì)含量，從而減輕仔姜冷害癥狀。但Gao Hui等[35]研究則表明，EBR處理抑制了藕片PAL的活性，其對(duì)酚類物質(zhì)的累積則主要通過(guò)抑制PPO的活性實(shí)現(xiàn)，這可能與樣品及貯藏方式的不同有關(guān)[35]。

綜上所述，10 μmol/L的外源EBR處理能有效緩解仔姜低溫貯藏期間的冷害發(fā)生，并抑制了H2O2和丙二醛的積累，維持膜結(jié)構(gòu)的完整性，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)活性氧和酚類代謝相關(guān)酶活性、維持較強(qiáng)的抗氧化能力，進(jìn)而減輕氧化損傷有關(guān)。