張慧，劉芳，楊瑞利，唐慶娟

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，食品科學(xué)與人類健康實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266000）

卡拉膠即角叉菜膠（Carrageenan），是從石花菜、鹿角菜、麒麟菜等紅藻中萃取的天然多糖類植物膠體[1]。因其具有良好的凝膠、增稠及蛋白反應(yīng)性等理化性質(zhì)，常在醫(yī)藥和食品等行業(yè)被用作乳化劑、增稠劑、穩(wěn)定劑等。例如在醫(yī)藥行業(yè)中，卡拉膠可被用于魚肝油乳化劑以及緩釋膠囊等的制作[2]；在食品行業(yè)中卡拉膠作為一種天然高品質(zhì)的食品添加劑，被廣泛應(yīng)用于乳制品、果汁飲料、冰淇淋、糖制品、肉制品、白酒和啤酒等的生產(chǎn)[3]。此外，由于卡拉膠及其衍生物具有很多生理活性如抗凝血、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等，也常被應(yīng)用于藥理學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中[4-6]。

然而，近年來一些研究發(fā)現(xiàn)，卡拉膠具有一定的生物毒性，特別是易引發(fā)宿主腸道黏膜免疫功能的損傷，從而導(dǎo)致腸道炎癥[7]。Tobacman等人從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、腸道菌群實(shí)驗(yàn)等多個(gè)角度對(duì)卡拉膠的致炎作用及機(jī)理進(jìn)行了總結(jié)，并提出美國(guó)日益增多的腸道炎癥和腸癌等疾病可能與食品中添加的卡拉膠有關(guān)[8]。然而，也有研究證明，卡拉膠在宿主體內(nèi)并不會(huì)引起明顯的腸道炎癥[9]。因此，基于諸多研究結(jié)果的不一致和不可重復(fù)，人們對(duì)于卡拉膠的食用安全性一直存在爭(zhēng)議與質(zhì)疑。

有研究人員指出，卡拉膠食用安全性存在爭(zhēng)議，可能是由于實(shí)驗(yàn)過程中采用不同品質(zhì)的卡拉膠，或?qū)ζ涮卣魇栌阼b定等原因?qū)е碌?，又或者是在下結(jié)論時(shí)未考慮到其物理與化學(xué)性質(zhì)[10,11]。因此，本研究擬采用市售食品級(jí)κ-卡拉膠作為受試物進(jìn)行食用安全性探究，并首先對(duì)其特征如分子量分布及亞型進(jìn)行確定，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。值得注意的是，無論是在食品還是醫(yī)學(xué)行業(yè)，對(duì)任意一種活性物質(zhì)進(jìn)行安全性研究，若拋開劑量來談毒性是不科學(xué)的。因此本研究擬將幾種具有代表性的人群卡拉膠攝入量換算成小鼠有效劑量，按照0.05%、0.5%、1%、2.5%、5%的比例摻入小鼠日糧中來探究食品級(jí)κ-卡拉膠能否誘發(fā)機(jī)體結(jié)腸炎癥。本研究成果將為卡拉膠生產(chǎn)和消費(fèi)提供有效指導(dǎo)和科學(xué)依據(jù)，希望能夠消除生產(chǎn)者和消費(fèi)者關(guān)于卡拉膠添加的恐慌和疑慮。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠，6周齡，體重17～19 g，濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司（許可證號(hào)SCXK（魯）2014 0007）；AIN-93M標(biāo)準(zhǔn)純化飼料（飼料代碼LAD3001M）及其受試物添加飼料，南通特洛菲科技有限公司；食品級(jí)κ-卡拉膠（品牌綠力），石家莊春信生物科技有限公司（生產(chǎn)許可證SC20135068100171）；溴化鉀（KBr，光譜純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；便隱血（FOB）檢測(cè)試劑盒（膠體金法），艾博生物醫(yī)藥有限公司；卡爾文ELISA試劑盒，上海艾萊薩生物科技有限公司；TLR4抗體（批號(hào)GB12186）及HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（批號(hào)GB23301），武漢賽維爾生物科技有限公司；TNF-α抗體（批號(hào)abs131997），愛必信生物科技有限公司；組化試劑盒DAB顯色劑（批號(hào)G1211），武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

高效凝膠排阻色譜儀（型號(hào)ELEOS System），美國(guó)Wyatt Technology公司；傅立葉變換紅外光譜儀（型號(hào)Nicolet iS10），美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；電動(dòng)熒光顯微鏡（型號(hào)NIKON/Ni-E），日本尼康公司；酶標(biāo)儀（型號(hào)SPARK 10M），瑞士TECAN。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 受試物及其特征確定

1.2.1.1 卡拉膠特征鑒定

食品級(jí)κ-卡拉膠，呈類白色粉末狀。藻源：印尼、菲律賓等地麒麟菜；提取工藝：堿提醇沉法；有效物質(zhì)含量為95%，純度可達(dá)99%。

卡拉膠分子量及其分子量分布采用高效凝膠排阻色譜測(cè)定（HPSEC），配備有多角度激光散射儀和示差檢測(cè)器。色譜柱為Shodex OH-PAX（柱型SB-806），流動(dòng)相為0.2 M氯化鈉溶液（內(nèi)含0.003 M疊氮鈉），流速0.5 mL/min，柱溫40 ℃；將樣品用流動(dòng)相稀釋為0.52 mg/mL并過0.2 μm濾膜，取制備好的卡拉膠溶液0.8 mL注入凝膠色譜儀。

卡拉膠亞型通過傅立葉變換紅外光譜儀測(cè)定（FI-IR）。采用KBr壓片法制備樣品，壓片壓力值約14 MPa，保持1 min，待樣品壓成完整透明薄片即可置于紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)定；背景采集后完成后開始采集樣品信息。

1.2.1.2 卡拉膠劑量確定

按照FAD所推薦的人和小鼠之間的有效劑量換算公式，將幾種典型人群卡拉膠攝入量換算成小鼠劑量，如正常成年人日常攝食卡拉膠量（以正常攝入奶制品、調(diào)味料及火腿等卡拉膠加工食品為主）、南弗羅里達(dá)州成年人一天最高攝食卡拉膠量（較多攝入奶油、奶酪、肉制品及奶制品等卡拉膠加工食品）、以及誘發(fā)成年人結(jié)腸炎的最低卡拉膠攝食量（實(shí)驗(yàn)預(yù)估劑量）等，以探究這幾種典型的、具有代表性的卡拉膠劑量是否具有誘發(fā)消費(fèi)者結(jié)腸炎的可能性。具體見表1。

表1 卡拉膠在人和小鼠飲食中的比例換算[12]Table 1 Conversion of carrageenan proportion in the diet of humans and mice

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行（編號(hào)SPXY2019042001）。將72只C57BL/6J雄性小鼠分為6組，每組12只，分別為對(duì)照組（NC），飼喂AIN-93M標(biāo)準(zhǔn)純化飼料；不同劑量卡拉膠組（0.05% CGN、0.5% CGN、1%CGN、2.5% CGN、5% CGN），將卡拉膠摻入對(duì)照飼料中飼喂。小鼠暫養(yǎng)2周后進(jìn)行受試物處理，6周后處死。飼養(yǎng)溫度23～25 ℃，相對(duì)濕度40%～55%，通風(fēng)良好，每日光照和黑暗各12 h，自由飲水和進(jìn)食。

1.2.3 臟器指數(shù)

小鼠處死后立即分離出完整結(jié)腸，平鋪于錫箔紙上測(cè)定長(zhǎng)度，并比較統(tǒng)計(jì)各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度；分離免疫臟器包括脾臟和胸腺，于4位電子天平上稱重，并計(jì)算統(tǒng)計(jì)小鼠免疫臟器指數(shù)。臟器指數(shù)計(jì)算公式如下：

1.2.4 炎癥介質(zhì)蛋白表達(dá)

ELISA測(cè)定小鼠結(jié)腸中炎癥介質(zhì)的蛋白表達(dá)。小鼠處死后取結(jié)腸約1 cm，用生理鹽水將其制備成10%組織勻漿并離心取上清液，ELISA試劑盒測(cè)定上清液中髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）酶活及前列腺素E2（Prostaglandin，PGE2）的蛋白表達(dá)量，檢測(cè)時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光值。

1.2.5 炎癥因子蛋白表達(dá)

免疫組化法（IHC）測(cè)定小鼠結(jié)腸中卡拉膠受體及炎癥因子的蛋白分泌量。取結(jié)腸約1 cm，立即放入4%多聚甲醛組織固定液中進(jìn)行固定，以便后續(xù)制作切片。組織進(jìn)行石蠟包埋并切成4 μm切片，使用Toll樣受體4（Toll-like receptor，TLR4）和腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體進(jìn)行孵育2 h，之后以HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG進(jìn)行孵育并顯色。使用電動(dòng)熒光顯微鏡觀察切片，每組隨機(jī)選定3個(gè)切片，每個(gè)切片隨機(jī)選取3個(gè)200×視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件分析圖像，根據(jù)以下公式計(jì)算并統(tǒng)計(jì)各組平均積分光密度（Average Integral Optical Densities，AIOD）。AIOD計(jì)算公式如下：

1.2.6 組織病理學(xué)

將石蠟包埋組織切成4 μm切片，進(jìn)行蘇木精和伊紅（Hematoxylin-eosin staining，HE）染色，使用電動(dòng)熒光顯微鏡觀察結(jié)腸炎癥情況，包括腸壁形態(tài)，腸粘膜結(jié)構(gòu)，炎癥浸潤(rùn)情況等。采用Image J軟件測(cè)定小鼠結(jié)腸隱窩深度，各組隨機(jī)選定5個(gè)切片，每個(gè)切片隨機(jī)選取8～10個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)各組隱窩深度平均值。

1.2.7 小鼠攝入的實(shí)際卡拉膠量

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)各組小鼠的每日攝食量并計(jì)算每日卡拉膠攝入量，按照FDA推薦的人與小鼠有效劑量換算公式將小鼠對(duì)卡拉膠的實(shí)際攝入量換算成每日人對(duì)卡拉膠加工食品的可能消耗量，例如果凍和午餐肉。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，數(shù)據(jù)均表示為Mean±SD。統(tǒng)計(jì)分析及作圖均采用GraphPad Prism 7.0和SPSS 19.0專業(yè)軟件，組間采用單因素方差分析（One-way ANOVA），Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析。以*p＜0.05表示為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 卡拉膠及其特征

圖1 卡拉膠特征鑒定Fig.1 Identification of carrageenan characteristics

研究表明，不同亞型的卡拉膠毒性效應(yīng)不同，如Bhattacharyya等[16]表明相同濃度的λ-CGN刺激腸上皮細(xì)胞后產(chǎn)生最高水平的IL-8，ι-次之，而κ-卡拉膠處理后產(chǎn)生的IL-8量最少。因此本文對(duì)購買的卡拉膠進(jìn)行了亞型測(cè)定。紅外光譜圖像表明，在3451.20，2907.10 cm-1處有兩個(gè)吸收峰峰，分別為多糖中O-H和C-H的伸縮振動(dòng)（Stretching Vibration）[17,18]。而1262.32 cm-1和1069.39 cm-1處的吸收峰，表明了硫酸酯和糖苷鍵的存在。928.9 cm-1處的吸收峰是卡拉膠單糖組分3,6-脫水-D-半乳糖的特征峰[19]。在846.92 cm-1（3,6-內(nèi)醚半乳糖C4位硫酸基的吸收峰）有明顯吸收峰，而在805-810 cm-1（3,6-內(nèi)醚半乳糖C2位硫酸基的吸收峰）無吸收峰，表明該樣品確實(shí)為κ-卡拉膠，這與遲連利等報(bào)道的一致[20]（圖1a）。

食品級(jí)卡拉膠是指分子量范圍在100～800/ 200～400 ku，且含有極少量小分子片段的多聚卡拉膠[8]。為了鑒定購買的卡拉膠樣品是否符合食品級(jí)的技術(shù)要求，本文利用高效凝膠排阻色譜對(duì)其分子量及分布進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明該樣品組分分散性良好，平均分子量300.4 ku，分子量分布為200～400 ku的分子占有86%，400～800 ku的分子占有13.3%，不含有＜50 ku的低分子量片段，符合食品級(jí)卡拉膠的分子量范圍，與Tobacman等的描述一致[8]（圖1b）。

此外，根據(jù)鑒定報(bào)告顯示，該樣品硫酸酯含量為21%（食品級(jí)卡拉膠硫酸酯含量國(guó)標(biāo)范圍為15%～40%），粘度為0.16 Pa·s（食品級(jí)卡拉膠粘度范圍應(yīng)≥0.005 Pa·s）[8]，各指標(biāo)均符合食品級(jí)卡拉膠要求范圍。該結(jié)論是后續(xù)毒性研究的基礎(chǔ)。

2.2 不同劑量食品級(jí)卡拉膠對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

圖2 卡拉膠劑量對(duì)小鼠免疫臟器指數(shù)的影響Fig.2 The effects of carrageenan dosage on immune organs index of mice

脾臟和胸腺是哺乳動(dòng)物最重要的淋巴器官，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥時(shí)，脾臟和胸腺指數(shù)顯著下降，標(biāo)志著器官免疫功能的降低[21,22]。本文研究結(jié)果表明，0.05%～5%卡拉膠組小鼠脾臟指數(shù)分別為24.16、23.93、24.56、22.13和24.87（圖2a），與對(duì)照組（23.30）相比無顯著差異；各劑量組小鼠胸腺指數(shù)分別為10.36、10.88、10.25、10.65及10.37（圖2b），與對(duì)照組（11.74）相比仍無顯著差異。說明不同劑量卡拉膠干預(yù)小鼠后，小鼠免疫功能保持正常，這與Weiner等表明高達(dá)5%的κ-卡拉膠（分子量196～257 ku）干預(yù)90 d后對(duì)大鼠的脾臟等臟器重量無明顯影響的研究結(jié)果是一致的[9]。在結(jié)腸炎癥機(jī)體中，結(jié)腸往往會(huì)發(fā)生萎縮，長(zhǎng)度縮短[23]。本文結(jié)果顯示，各劑量組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度（圖2c）與對(duì)照組（6.67）相比無顯著差異，表明小鼠結(jié)腸未發(fā)生明顯萎縮。

圖3 卡拉膠劑量對(duì)小鼠結(jié)腸中炎癥介質(zhì)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 The effects of carrageenan dosage on the protein expression of inflammatory mediators in the colon of mice

2.3 不同劑量食品級(jí)卡拉膠對(duì)小鼠結(jié)腸中炎癥介質(zhì)的影響

炎癥介質(zhì)的釋放是表征腸道炎癥的重要指標(biāo)之一。PGE2是典型的炎癥介質(zhì)，在腹瀉型腸炎中起著關(guān)鍵作用[24]。與此同時(shí)，腸道發(fā)生炎癥時(shí)，腸粘膜常伴有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，而MPO作為中性粒細(xì)胞釋放的酶，其酶活也可作為診斷機(jī)體腸道炎癥的指標(biāo)之一[25]。因此，本文對(duì)各組小鼠結(jié)腸中的PGE2釋放量及MPO酶活進(jìn)行了測(cè)定，以判斷卡拉膠攝入是否能夠誘發(fā)結(jié)腸炎癥反應(yīng)。結(jié)果表明，2.5%CGN組小鼠結(jié)腸中MPO酶活性（210.52，圖3a）與對(duì)照組（298.62）相比下降約29.50%（p＜0.01），其他劑量組（從低到高劑量分別為296.33、259.59、281.29、252.29）與對(duì)照組相比無顯著差異；各劑量卡拉膠組小鼠結(jié)腸中PGE2釋放量（294.76、282.38、290.93、275.27、265.76，圖3b）與對(duì)照組（302.5）相比無顯著差異，說明不同劑量的食品級(jí)κ-卡拉膠干預(yù)小鼠未引起結(jié)腸炎癥介質(zhì)的異常升高并誘發(fā)炎癥。

2.4 不同劑量食品級(jí)卡拉膠對(duì)小鼠結(jié)腸中炎癥因子的影響

認(rèn)為卡拉膠具有腸道毒性效應(yīng)的學(xué)者認(rèn)為，卡拉膠會(huì)被結(jié)腸上皮細(xì)胞中的TLR4識(shí)別并結(jié)合，從而誘發(fā)下游的炎癥因子釋放，導(dǎo)致腸道炎癥[26]。因此本文測(cè)定了結(jié)腸中TLR4的蛋白表達(dá)，以判斷卡拉膠是否能夠誘發(fā)TLR4的高表達(dá)并與之結(jié)合導(dǎo)致小鼠結(jié)腸炎。

如圖4及表2所示，統(tǒng)計(jì)各組AIOD，發(fā)現(xiàn)除1%CGN組（8557.95）的TLR4分泌量高于對(duì)照組66.67%（5134.72，p＜0.05）外，其余劑量組（Table 2）與對(duì)照組相比無顯著差異。而1% CGN組小鼠結(jié)腸中TLR4異常升高可能是由于卡拉膠與一些內(nèi)源性配體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合引起的，但該升高在卡拉膠單獨(dú)處理時(shí)不足以誘發(fā)下游炎癥反應(yīng)，該現(xiàn)象與Wu等發(fā)現(xiàn)卡拉膠單獨(dú)處理可介導(dǎo)HT-29細(xì)胞中TLR4少量分泌但無炎癥反應(yīng)的結(jié)果是相似的。此外，統(tǒng)計(jì)促炎因子TNF-α的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)0.05% CGN組（5462.13）的TNF-α低于對(duì)照組（14818.13，p＜0.05）約63.14%，其余各劑量卡拉膠組小鼠結(jié)腸中的TNF-α（Table 2）蛋白分泌量與對(duì)照組相比無顯著差異。Wu等同樣表明高分子量κ-卡拉膠單獨(dú)以不同劑量處理小鼠時(shí)，未誘發(fā)小鼠結(jié)腸炎癥[27]。因此，綜合其他指標(biāo)考慮，高達(dá)5%的食品級(jí)κ-卡拉膠摻入飼料中飼喂小鼠，小鼠無患發(fā)結(jié)腸炎的風(fēng)險(xiǎn)。

圖4 各組小鼠結(jié)腸中炎癥因子蛋白分泌的電鏡圖像Fig.4 The microscope image of the protein secretion of inflammatory factors in the colon of various groups of mice

表2 卡拉膠劑量對(duì)小鼠結(jié)腸中炎癥因子分泌的影響Table 2 The effects of carrageenan dosage on the secretion of inflammatory factors in the colon of mice

2.5 不同劑量食品級(jí)卡拉膠對(duì)小鼠結(jié)腸病理學(xué)的影響

圖5 卡拉膠劑量對(duì)小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 The effects of carrageenan dosage on colonic structure of mice

最后本文采用4×和20×倍數(shù)顯微鏡對(duì)小鼠結(jié)腸進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和各劑量卡拉膠組小鼠結(jié)腸腸壁完整，厚度正常；腸粘膜結(jié)構(gòu)比較完整，固有層無明顯炎癥浸潤(rùn)，隱窩完整且排列有序，杯狀細(xì)胞無明顯減少，排列有序致密（圖5a）。且0.05%～5%卡拉膠組小鼠結(jié)腸隱窩深度(177.22、180.35、167.68、172.57、157.30)與對(duì)照組(170.92)相比無顯著差異（圖5b）。Weiner等也表明卡拉膠干預(yù)后大鼠腸道仍保持正常生理結(jié)構(gòu)，這與本實(shí)驗(yàn)對(duì)結(jié)腸的病理學(xué)分析結(jié)果一致[9]。表明高達(dá)5%的食品級(jí)κ-卡拉膠以摻入飼料的方式對(duì)小鼠進(jìn)行干預(yù)，小鼠不會(huì)患發(fā)結(jié)腸炎。

2.6 各組小鼠的卡拉膠實(shí)際攝入量

為了將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果合理外推到人對(duì)卡拉膠攝入的安全性上，本文按照FDA推薦的人與小鼠有效劑量換算公式將小鼠對(duì)卡拉膠的實(shí)際攝入量換算成人對(duì)果凍和午餐肉的消耗量，如表3。換算結(jié)果表明，該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的小鼠最大劑量-5%卡拉膠，相當(dāng)于人每日需消耗3.5份及以上午餐肉，而正常人日常對(duì)卡拉膠加工食品的攝入幾乎很少達(dá)到該劑量或者更高劑量。此外，食品行業(yè)常常將卡拉膠與其他食用膠復(fù)配使用來達(dá)到更好的改善產(chǎn)品性能的效果，而過多卡拉膠的添加往往導(dǎo)致食品感官的下降。因此可以合理推測(cè)，正常人群依照科學(xué)飲食習(xí)慣合理攝入卡拉膠加工食品不會(huì)有罹患結(jié)腸炎的風(fēng)險(xiǎn)，更不必過度擔(dān)憂卡拉膠添加過量導(dǎo)致的毒性效應(yīng)。

表3 各組小鼠卡拉膠實(shí)際攝入量Table 3 Actual carrageenan intake of each group

3 結(jié)論

本研究通過將0.05%～5%的市售食品級(jí)κ-卡拉膠摻入飼料中干預(yù)小鼠，來模擬并探究成年人攝食卡拉膠加工食品患發(fā)結(jié)腸炎的可能性。諸多國(guó)內(nèi)外研究表明，影響卡拉膠誘發(fā)腸道毒性的因素眾多，而卡拉膠特征及品質(zhì)的鑒定對(duì)其毒性判斷的影響是首當(dāng)其沖的。因此越來越多的學(xué)者和研究人員呼吁，在實(shí)驗(yàn)時(shí)要考慮卡拉膠的純度、分子量分布及亞型等自身特征，以便得到更準(zhǔn)確的結(jié)論，防止引起公眾和消費(fèi)者的疑慮和恐慌。基于此觀點(diǎn)，本文首先對(duì)購買的卡拉膠樣品進(jìn)行了亞型和分子量測(cè)定。紅外色譜表明該樣品確為κ-型卡拉膠；凝膠排阻色譜顯示該樣品平均分子量300.4 ku，且不含有＜50 ku的小分子片段。這些鑒定結(jié)果說明，所購樣品較好符合食品級(jí)κ-卡拉膠的技術(shù)要求，而該要求是本文后續(xù)研究開展的重要基礎(chǔ)。接下來，為了探究此市售食品級(jí)卡拉膠的腸道毒性，本研究分別將不同劑量的卡拉膠樣品摻入飼料中飼喂小鼠6周，處死后檢測(cè)結(jié)腸炎癥相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果表明，各劑量組小鼠的免疫臟器指數(shù)、結(jié)腸長(zhǎng)度及微觀結(jié)構(gòu)、結(jié)腸中PGE2釋放量與對(duì)照組相比均無顯著差異（p＞0.05），說明0.05%～5%卡拉膠未對(duì)小鼠免疫臟器及結(jié)腸造成明顯損傷。0.05%及2.5%卡拉膠干預(yù)小鼠后，其結(jié)腸中TNF-α蛋白表達(dá)量或MPO酶活與對(duì)照組相比分別有所下降（63.14%，p＜0.05；29.50%，p＜0.01），其余劑量組TNF-α表達(dá)量及MPO酶活與對(duì)照組相比均無顯著差異；而TNF-α釋放及MPO酶活的下降是否表明卡拉膠具有一定的腸道保健作用，還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。此外，研究發(fā)現(xiàn)1% CGN組小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞受體-TLR4的蛋白表達(dá)高于對(duì)照組（p＜0.05），這可能是由于卡拉膠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TLR4引起的，而綜合其他指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，TLR4升高不足以誘發(fā)小鼠結(jié)腸炎癥。綜上所述，可得出結(jié)論：高達(dá)5%的食品級(jí)κ-卡拉膠摻入飼料中飼喂小鼠不會(huì)誘發(fā)其結(jié)腸炎癥。除此之外，根據(jù)人與小鼠對(duì)活性物質(zhì)的有效劑量差異，本研究發(fā)現(xiàn)一般人群對(duì)卡拉膠加工食品的攝入幾乎達(dá)不到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的最高劑量，因此合理推測(cè)正常人群依照科學(xué)飲食習(xí)慣合理攝入卡拉膠加工食品不會(huì)有罹患結(jié)腸炎的風(fēng)險(xiǎn)。本研究有望為消費(fèi)者及卡拉膠產(chǎn)業(yè)提供科學(xué)依據(jù)與有效指導(dǎo)。