魏衍尚， 寧利敏， 姚 忠， 朱本偉

（南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 210009）

卡拉膠是一種從海洋紅藻細(xì)胞壁中提取出來(lái)的多糖物質(zhì)，是一種由D-半乳糖通過(guò)交替的α-1，3和β-1，4糖苷鍵連接而成的線性硫酸多糖[1]。因其具有多樣的生物活性而受到廣大關(guān)注。卡拉膠多糖根據(jù)硫酸基團(tuán)的數(shù)量和位置以及α-1，4連接的半乳糖殘基中3，6-內(nèi)醚-α-D-吡喃半乳糖（3，6-AG）的存在，可將其分為κ-、ι-和λ-型3種卡拉膠，其對(duì)應(yīng)的重復(fù)二糖結(jié)構(gòu)分別為：G4S-DA、G4S-DA2S和G2S-D2S，6S（見(jiàn)圖1）[2]?？ɡz因其出色的物理功能特性而得到廣泛的利用，如增稠、膠凝和穩(wěn)定能力[1]。然而，由于這種硫酸多糖的高相對(duì)分子質(zhì)量和較差的組織穿透能力，大大限制了它們的進(jìn)一步應(yīng)用。

圖1 不同類型卡拉膠的重復(fù)二糖結(jié)構(gòu)Fig.1 Schematic diagram of repeated disaccharide structure of different types of carrageenan

研究表明，經(jīng)過(guò)降解后產(chǎn)生的卡拉膠寡糖或者降解后的卡拉膠經(jīng)過(guò)分子修飾的衍生物往往有著更強(qiáng)的生物活性[3]。卡拉膠的酶降解需要涉及卡拉膠酶和硫酸化酶兩種酶的共同作用，前者降解糖苷鍵，后者脫去卡拉膠分子上的硫酸基團(tuán)[4-6]。因此作者總結(jié)了卡拉膠的多種降解方法以及降解后的卡拉膠所進(jìn)行的分子修飾，并對(duì)其降解后的生物活性做了簡(jiǎn)單的概述。同時(shí)重點(diǎn)概括了近20年來(lái)卡拉膠酶和硫酸化酶的研究進(jìn)展，還在最后介紹了兩種酶協(xié)同降解卡拉膠多糖的機(jī)制。

1 卡拉膠多糖的降解及分子修飾

天然提取的卡拉膠因相對(duì)分子質(zhì)量太大、黏度高、溶解度低等特點(diǎn)，難以通過(guò)機(jī)體內(nèi)的屏蔽作用，致使其應(yīng)用受到很大程度的限制[7]。相比之下，卡拉膠寡糖及其分子修飾后的衍生物具有更為廣泛的應(yīng)用價(jià)值[8]。針對(duì)這一問(wèn)題，目前對(duì)于卡拉膠多糖的研究主要集中在多糖降解或降解后的卡拉膠的分子修飾。

1.1 卡拉膠多糖的降解方法

1.1.1 化學(xué)降解在化學(xué)降解方面可通過(guò)用無(wú)機(jī)酸水解、硫醇水解、甲醇水解、還原水解、過(guò)氧化氫氧化水解等方法來(lái)將大分子卡拉膠降解為小分子多糖，甚至寡糖[3]。其中研究最多的為無(wú)機(jī)酸的水解，在酸性溶液中，卡拉膠多糖的糖苷鍵會(huì)發(fā)生斷裂，從而使多糖降解為小分子片段[3]。通過(guò)控制酸的濃度、溫度以及時(shí)間可獲得相對(duì)分子質(zhì)量大小不一的降解產(chǎn)物。

通過(guò)酸水解可以獲得多種卡拉膠低聚糖及寡糖組分[9-10]。Yang等通過(guò)溫和酸水解方法（用0.1 mol/L H2SO4在60℃降解1.5 h）得到聚合度3～17奇數(shù)κ-卡拉膠寡糖[11]。Hipolito等對(duì)κ-卡拉膠采用0.1 mol/L TFA在65℃降解30 min來(lái)進(jìn)行部分水解，其水解產(chǎn)物為低相對(duì)分子質(zhì)量多糖片段[12]。

對(duì)比其他降解方法，酸降解不易控制反應(yīng)條件，降解產(chǎn)物復(fù)雜，并且會(huì)對(duì)多糖結(jié)構(gòu)造成破壞，進(jìn)而影響生物活性[13]。

1.1.2 物理降解物理降解主要有超聲降解、輻射降解、微波降解。用γ射線在固體、凝膠或溶液中以不同劑量照射，可降解κ-、ι-和λ-卡拉膠，且得到的產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量分布窄[14]。魏元臣等通過(guò)微波降解法得到的不同相對(duì)分子質(zhì)量λ-卡拉膠，并且證明了降解產(chǎn)物能夠使健康小鼠的免疫能力增強(qiáng)[15]。對(duì)于超聲波降解多糖，其反應(yīng)過(guò)程中易于控制反應(yīng)條件，便于得到目標(biāo)產(chǎn)物，且解聚物為具有較窄相對(duì)分子質(zhì)量分布的產(chǎn)物。Tecson等采用低質(zhì)量濃度的κ-卡拉膠底物（5.0 mg/mL）、高振幅的儀器處理（85%）和長(zhǎng)處理時(shí)間（180 min）的超聲波處理，獲得了平均相對(duì)分子質(zhì)量（AMW）為41 864的κ-卡拉膠，這比初始AMW為1 139 927的原始樣品減少了1 098 063（96.3%）[16]。

1.1.3 酶降解由于化學(xué)降解和物理降解的降解條件不易控制，且極易引起多糖結(jié)構(gòu)的破壞，因此生物降解法受到了研究者們極大的關(guān)注[17]?？ɡz酶是一種糖苷水解酶，可以降解卡拉膠的β-1，4糖苷鍵，從而獲得卡拉膠低聚糖。由于酶法降解具有底物專一性、高效性、對(duì)環(huán)境友好、無(wú)副反應(yīng)、工藝易于控制等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的降解方式，目前已逐漸代替?zhèn)鹘y(tǒng)的降解方法。

1.2 降解后的卡拉膠多糖的分子修飾

研究者提出了許多化學(xué)修飾方法來(lái)修飾卡拉膠的理化性質(zhì)。大多數(shù)修飾的目的是通過(guò)用新的官能團(tuán)取代生物聚合物D-半乳糖-4-硫酸鹽部分中的原醇基團(tuán)來(lái)誘導(dǎo)新的性質(zhì)。改性反應(yīng)包括硫酸化[18]和脫硫酸化[19]、乙?；痆20]、烷基化[12]、磷酸化[21]、自由基接枝共聚等[22]。

卡拉膠的硫酸化方法有很多，通過(guò)硫酸鹽基團(tuán)的引入，可以在一定程度上改變卡拉膠多糖的生物活性，其中最常用的3種包括氯磺酸-吡啶法[23]、硫酸化法[24]和三氧化硫-吡啶法[25]。對(duì)于脫硫酸化，則涉及卡拉膠硫酸化酶，詳情見(jiàn)下文。乙?；瘎t通過(guò)酰基轉(zhuǎn)移酶催化，這種化學(xué)修飾不僅可以影響不同化合物的功能，而且可以改變?nèi)芙舛?、穩(wěn)定性或細(xì)胞靶的不同性質(zhì)[26-27]。Yamada等發(fā)現(xiàn)，乙?；牡拖鄬?duì)分子質(zhì)量硫酸卡拉膠具有潛在的抗HIV活性；同時(shí)，卡拉膠多糖在水中的溶解度直接受到乙?；潭鹊挠绊?；λ-和κ-卡拉膠的高取代率表明其不溶于水[28]?？ɡz的烷基化也會(huì)對(duì)卡拉膠的生物活性產(chǎn)生影響。Uryu等對(duì)硫酸寡糖進(jìn)行分子修飾，引入烷基，發(fā)現(xiàn)其修飾產(chǎn)物抗HIV的能力得到了提高，而不含烷基的硫酸寡糖抗HIV活性較低[29]。袁華茂通過(guò)對(duì)降解得到的卡拉膠寡糖混合物進(jìn)行了磷酸化結(jié)構(gòu)修飾，結(jié)果表明硫酸化后的卡拉膠在不同的抗氧化模型中具有較卡拉膠寡糖更高的抗氧化活性，說(shuō)明卡拉膠寡糖的化學(xué)修飾可以增強(qiáng)其抗氧化能力[30]。

除了上述的功能化方法外，接枝和交聯(lián)還可用于化學(xué)改性聚合物。將可聚合的合成部分接枝到天然卡拉膠多糖上，然后進(jìn)行聚合，這是一種產(chǎn)生大分子的方法，合成的大分子具有每種聚合物的某些特性[31]。例如，在κ-卡拉膠上接枝丙烯酸，合成了κ-卡拉膠型高吸水凝膠[32]。

2 卡拉膠酶的研究

卡拉膠酶歸屬于糖苷水解酶家族，其作用模式均為內(nèi)切型，可專一性的裂解卡拉膠分子內(nèi)部的β-1，4糖苷鍵，產(chǎn)物為一系列聚合度為偶數(shù)的低聚卡拉膠[33]。由于卡拉膠酶在水解卡拉膠多糖的過(guò)程中，反應(yīng)條件溫和，底物具有專一性以及所產(chǎn)生的產(chǎn)物均一，因此該法正受到越來(lái)越多的關(guān)注[8]。近年來(lái)，針對(duì)海洋微生物所產(chǎn)生的卡拉膠酶對(duì)卡拉膠多糖的降解和利用的研究，主要集中在卡拉膠酶的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系等。作者將從卡拉膠酶的來(lái)源、種類、酶學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制以及應(yīng)用這幾個(gè)方面來(lái)介紹卡拉膠酶的研究進(jìn)展。

2.1 卡拉膠酶的來(lái)源與種類

卡拉膠酶的來(lái)源主要是海洋微生物和海洋動(dòng)物。比如以海藻為食的軟體動(dòng)物，Mori等從海洋軟體動(dòng)物中純化并鑒定了第一種卡拉膠酶[34]。Skea等在新西蘭食草魚(yú)內(nèi)臟中曾提取到可降解卡拉膠的酶[35]。然而，對(duì)于大多數(shù)已報(bào)道的卡拉膠酶，均是從海洋微生物中分離出來(lái)的。產(chǎn)卡拉膠酶的海洋微生物種類主要包括Pseudomonas、Pseudoalteromonas、Vibrio、Shewanella、Cellulophaga、Cytophaga、Microbulbifer、Tamlana、Pedobacter、Alteromonas和Zobellia等。在已發(fā)現(xiàn)的卡拉膠酶中，根據(jù)其降解底物的專一性，主要分為κ-卡拉膠酶、ι-卡拉膠酶、λ-卡拉膠酶。

2.1.1 κ-卡拉膠酶κ-卡拉膠酶是所有卡拉膠酶中分布與應(yīng)用最為廣泛的一種酶，屬于16糖苷水解酶家族。該類型的酶能夠特異性水解β-4-硫酸-D-半乳糖和α-3，6內(nèi)醚-D-半乳糖之間的β-1，4糖苷鍵，生成以硫酸化新κ-卡拉寡糖為主的產(chǎn)物[33]。具有一定活性的κ-卡拉膠酶可從海洋細(xì)菌或動(dòng)物體內(nèi)某些組織獲得。根據(jù)目前已有報(bào)道，能夠產(chǎn)生κ-卡拉膠酶的菌株包括Alteromonas macleodii KS62[36]、Bacillus sp.SYR4[37]、Cytophaga MCA-2[38]、Cellulophaga lytica[39]、Pedobacter hainanensis 13-Q[40]、Pseudoalteromonas sp.ZDY3[41]、Pseudomonas aeruginosa ZSL-2[42]、Pseudomonas elongata MTCC 5261[43]、Pseudomonas carrageenovora HLX250[44]、Pseudoalteromonas porphyrae LL-1[45]、Pseudoaltero-monas carrageenovora NCMB.302[46]、Shewanella sp.Kz7[47]、Vibrio sp.SY01[48]、Pseudoalteromonas tetraodonis JAMK142[49]、Tamlana sp.HC4[50]等。Kalitnik等 從 紅 藻Tichocarpus crinitus中篩選出28株具有降解κ-卡拉膠能力的菌株，且他們均屬于Phyla-bacteroidetes和Proteobacteria種類[51]。也有研究表明，海洋環(huán)境中存在大量的細(xì)菌細(xì)胞外膜囊泡攜帶具有活性的κ-卡拉膠酶[36]。海洋無(wú)脊椎動(dòng)物Turbo cornutus的腸道中也被證明了可以分離出一種能降解瓊脂、藻酸鹽和κ-卡拉膠的Microbulbifer agarilyticus GP101[52]。

研究表明，κ-卡拉膠酶是對(duì)其κ-卡拉膠內(nèi)部的β-1，4鍵上進(jìn)行剪切[40]。在降解過(guò)程中，κ-卡拉膠酶對(duì)卡拉膠的降解是隨機(jī)的，且當(dāng)卡拉膠為凝膠狀時(shí)卡拉膠酶對(duì)其的降解速率最快[46]。通過(guò)κ-卡拉膠酶降解卡拉膠得到的低聚糖具有更高的同質(zhì)性和更低的多分散性[53]。對(duì)于高聚合度的κ-卡拉膠寡糖的制備，Cui等從Cellulophaga lytica strain N5-2中克隆并異源表達(dá)了一個(gè)新的κ-卡拉膠酶基因，其降解產(chǎn)物為新κ-卡拉辛糖和新κ-卡拉己糖[39]。

對(duì)于κ-卡拉膠的降解，酶法水解相較于化學(xué)水解有許多優(yōu)點(diǎn)，但其明顯的缺點(diǎn)是酶的活性低，需要較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間，其他缺點(diǎn)包括酶活性的自發(fā)喪失和酶具有更昂貴的價(jià)格，這意味著還需要進(jìn)一步探索酶的再利用[54]。而對(duì)于自由酶來(lái)說(shuō)，需面臨較多工業(yè)挑戰(zhàn)，包括在非自然環(huán)境中穩(wěn)定性低、分離和回收困難[55]。為了克服這些問(wèn)題，酶固定化技術(shù)已被廣泛用于提高酶的穩(wěn)定性和可重復(fù)使用性。通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬以及圓二色光譜分析將κ-卡拉膠酶CgkPZ和Ca2+進(jìn)行組裝，合成一種新型的自組裝κ-卡拉膠酶-無(wú)機(jī)雜化納米花CaNF@CgkPZ，且催化效率增加了292%[56]。

在現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)重組菌株培育出的κ-卡拉膠酶對(duì)卡拉膠的降解可以獲得很多具有活性的低聚卡拉膠。例如，Pseudoalteromonas porphyrae LL1的κ-卡拉膠酶的催化結(jié)構(gòu)基因在Brevibacillus choshinensis中有效表達(dá)，且100.0 mmol/L的Mg2+能使PpCgkCD的活性顯著提高97.5%[57]。張成昊等將Pseudoalteromonas JMUZ2的κ-卡拉膠酶基因在大腸桿菌中異源表達(dá)，結(jié)果表明，該酶屬于GH16家族，最適反應(yīng)溫度和pH分別為50℃和8.0，重組酶對(duì)去垢劑Tween 20、Tween 80和Triton X-100有良好的耐受性，酶解產(chǎn)物對(duì)羥自由基、DPPH自由基、ABTS自由基具有一定清除作用，還具有良好的還原能力[58]。對(duì)從南極大型海藻表面分離的Polaribacter sp.NJDZ03的全基因組進(jìn)行了分析，獲得了一個(gè)推測(cè)的卡拉膠酶基因Car3206，且該基因被克隆并在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)[59]。

由于卡拉膠具有較高的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性，存在著典型的雜交卡拉膠。其中一種其結(jié)構(gòu)由交替β-卡拉膠和κ-卡拉膠基序組成。Cao等克隆、表達(dá)和表征了來(lái)自海洋細(xì)菌Wenyingzhuangia funcanilytica CZ1127的新型GH16_13 furcellaran（一種部分硫酸化的β/κ-卡拉膠）水解酶Cgbk16A_Wf，該酶被命名為βκ-卡拉膠酶，可以特異性地將β-卡拉膠和κ-卡拉膠之間的β-1，4糖苷鍵從非還原端切割到還原端，其相對(duì)分子質(zhì)量為43 000，且作用模式不依賴于NaCl，被Cu2+、Mg2+、Hg2+、Mn2+、β-巰基乙醇抑制，在50℃和pH 6.0下表現(xiàn)出最大活性，并表現(xiàn)出高熱穩(wěn)定性[60]。

2.1.2 ι-卡拉膠酶有關(guān)ι-卡拉膠酶的報(bào)道較少，該酶屬于82糖苷水解酶家族。該類型的酶能夠特異性水解β-4-硫酸-D-半乳糖和α-2-硫酸-3，6-內(nèi)醚-D-半乳糖之間的β-1，4糖苷鍵，生成以硫酸化新ι-卡拉寡糖為主的產(chǎn)物[33]。根據(jù)目前已有報(bào)道，能夠產(chǎn)生ι-卡拉膠酶的菌株包括Alteromonas fortis[61]、Brevibacillus choshinensis[62]、Cellulophaga sp.QY3[63]、Flavobacterium sp.YS-80-122[64]、Microbulbifer thermotolerans JAMB-A94T[65]等。

Barbeyron等對(duì)來(lái)自Zobellia galactanovorans和Alteromonas fortis的兩種ι-卡拉膠酶進(jìn)行分析比對(duì)，結(jié)果表明，Z.galactanovorans和A.fortis ι-卡拉膠酶基因編碼的同源蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量分別為53 400和54 800，相似性達(dá)到59%，同源性達(dá)到43%，且這兩種酶都能專一性降解ι-卡拉膠，作用方式均為內(nèi)切[66]。

ι-卡拉膠酶從Alteromonas fortis中首次被提取并表征其酶學(xué)性質(zhì)[61]。Hatada等從Microbulbifer thermotolerans JAMB-A94T的基因組中獲得一個(gè)ι-卡拉膠酶基因，酶解終產(chǎn)物ι-卡拉四糖占總產(chǎn)物的75%以上，這種酶可能有助于工業(yè)生產(chǎn)單一的ι-卡拉膠低聚糖，此外還證明了保守的Glu351對(duì)催化作用至關(guān)重要[65]。Ma等從Cellulophaga sp.和Cellulophaga sp.QY3中分離并鑒定了兩種新的ι-卡拉膠酶，不僅豐富了GH82家族ι-卡拉膠酶資源，而且對(duì)GH82家族酶的結(jié)構(gòu)與功能闡釋有重要意義[63，67]。

有研究報(bào)道，ι-卡拉膠酶Cgi82A在大腸桿菌中表達(dá)，并對(duì)其生化特性、動(dòng)力學(xué)常數(shù)和水解模式進(jìn)行了表征，該酶在25℃時(shí)達(dá)到最高活性，低于迄今報(bào)道的所有GH82 ι-卡拉膠酶，它是一種內(nèi)源性水解酶，可作為一種潛在的生物催化劑，制備不同聚合度的卡拉膠寡糖[68]。最近，來(lái)自Cellulophaga baltica的ι-卡拉膠酶的酶學(xué)性質(zhì)也被進(jìn)行報(bào)道，并且通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了最大ι-卡拉膠酶產(chǎn)量[69]。

2.1.3 λ-卡拉膠酶對(duì)于λ-卡拉膠酶的報(bào)道很少，由于缺少其序列信息，因此該酶構(gòu)成了與包含κ-卡拉膠酶的GH16家族和包含ι-卡拉膠酶的GH82家族沒(méi)有關(guān)系的一個(gè)新的GHs家族[70]。該類型的酶能夠特異性水解β-2-硫酸-D-半乳糖和α-2，6-硫酸-D-半乳糖之間的β-1，4糖苷鍵，生成以硫酸化新λ-卡拉寡糖為主的產(chǎn)物[33]。根據(jù)目前已有報(bào)道，能夠產(chǎn)生λ-卡拉膠酶的菌株包括Bacillus sp.Lc50-1[71]、Pseudoalteromonas sp.CL19[72]、Pseudoalteromonas carrageenovora[73]等。

1955年，Gauthier等發(fā)現(xiàn)了一種來(lái)自海藻細(xì)菌Pseudoalteromonas carrageenovora的λ-卡拉膠酶，并對(duì)其基因進(jìn)行了克隆[73]。2006年，Ohta等從深海沉積物樣品中分離到一株含有λ-卡拉膠酶的Pseudoalteromonas sp.CL19菌株并對(duì)其進(jìn)行了純化及表征，這是首次分離λ-卡拉膠酶及其基因序列的報(bào)道[72]。2014年，首次證實(shí)溫泉細(xì)菌中存在耐熱性λ-卡拉膠酶，并且純化并表征其生理活性[71]。2015年，有相關(guān)報(bào)道指出通過(guò)λ-卡拉膠酶降解所獲得的λ-卡拉膠寡糖具有抗腫瘤和血管生成的活性，并且這種活性與該卡拉膠的聚合程度有關(guān)[74]。

2.2 不同種類卡拉膠酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 κ-卡拉膠酶的酶學(xué)性質(zhì)已報(bào)道的κ-卡拉膠酶的相對(duì)分子質(zhì)量分別在20 000～128 000。最小和最大的相對(duì)分子質(zhì)量分別是來(lái)自Zobellia sp.ZM-2和Pseudomonas elongata MTCC 5261的κ-卡拉膠酶，其對(duì)應(yīng)相對(duì)分子質(zhì)量為20 000和128 000[43，75]。根據(jù)已有報(bào)道，大部分κ-卡拉膠酶的最佳溫度在30～55℃。但也有一些酶的最適溫度超出此范圍，例如，來(lái)自Cytophaga sp.Ik-C783、Pseudoalteromonas sp.WZUC10和Wenyingzhuangia aestuarii OF219的κ-卡拉膠酶，其最佳溫度為25℃[76-78]。 而來(lái)自Bacillus sp.HT19的κ-卡拉膠酶的最佳溫度為60℃，是迄今為止最具耐熱性能的κ-卡拉膠酶，具有一定程度的應(yīng)用潛力[79]。大多數(shù)報(bào)道的κ-卡拉膠酶的最佳pH范圍是7.2～8.0，這與海水的pH接近。然而，一些卡拉膠酶在酸性（pH 6）或中性（pH 7）條件下顯示其最佳活性。例如，來(lái)自Zobellia sp.ZM-2和Cellulophaga lytica strain N5-2的κ-卡拉膠酶的最適pH分別為6和7[75，80]。此外，一個(gè)特殊的例子是，從Pseudomonas elongata MTCC 5261中分離出的κ-卡拉膠酶其活性在酸性（pH 5.6）和堿性（pH 7.7）中都是最佳的[43]。其他κ-卡拉膠酶的酶學(xué)性質(zhì)見(jiàn)表1[36-50，53-54，59，75-88]。

表1 κ-卡拉膠酶的酶學(xué)性質(zhì)Table 1 Enzymatic properties of κ-carrageenase

續(xù)表1

2.2.2 ι-卡拉膠酶的酶學(xué)性質(zhì)有關(guān)ι-卡拉膠酶的酶學(xué)性質(zhì)報(bào)道較少（見(jiàn)表2），其相對(duì)分子質(zhì)量在31 000～58 000。最小的和最大的相對(duì)分子質(zhì)量分別是來(lái)自Cellulophaga baltica和Brevibacillus choshinensis的ι-卡拉膠酶，其對(duì)應(yīng)相對(duì)分子質(zhì)量 為31 000和58 000[62，69]。來(lái) 自Cellulophaga sp.QY3、Microbulbifer thermotolerans JAMB-A94T的ι-卡拉膠酶最適溫度為50℃，是迄今為止所報(bào)道的ι-卡 拉 膠 酶 的 最 佳 溫 度[63，65]。 而 來(lái) 自Wenyingzhuangia fucanilytica的ι-卡拉膠酶在25℃時(shí)可達(dá)到最高活性，低于目前報(bào)道的所有GH82 ι-卡拉膠酶[68]。對(duì)于來(lái)自Flavobacterium sp.YS-80-122的ι-卡拉膠酶在溫度為10℃和15℃下分別顯示出最大活性的36.5%和57%，而且在熱休克后恢復(fù)了58.2%的初始活性，這表明該酶是具有抗寒性、耐熱性，同時(shí)該酶還表現(xiàn)出NaCl獨(dú)立性和高的新ι-卡拉四糖產(chǎn)率，這將是海藻多糖生產(chǎn)ι-卡拉膠寡糖工業(yè)應(yīng)用的優(yōu)質(zhì)候選者[64]。目前已報(bào)道的ι-卡拉膠酶的最適pH在6.5～8.0。值得注意的是，來(lái)自Brevibacillus choshinensis與Cellulophaga sp.的ι-卡拉膠酶分別在pH 6.0～11.0與pH 6.0～9.6相對(duì)較寬范圍內(nèi)表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性[62，67]。

表2 ι-卡拉膠酶的酶學(xué)性質(zhì)Table 2 Enzymatic properties of ι-carrageenase

2.2.3 λ-卡拉膠酶的酶學(xué)性質(zhì)目前僅有3種λ-卡拉膠酶的酶學(xué)性質(zhì)被報(bào)道（見(jiàn)表3）。1995年，Gauthier等報(bào)道了來(lái)自Pseudoalteromonas carrageenovora的λ-卡拉膠酶，其相對(duì)分子質(zhì)量為105 000，是迄今為止相對(duì)分子質(zhì)量最大的λ-卡拉膠酶[73]。2006年，Ohta等報(bào) 道了來(lái) 自Pseudoalteromonas sp.CL19的λ-卡拉膠酶，該酶的相對(duì)分子質(zhì)量約為100 000，最佳pH和活性溫度分別約為7和35℃，最終產(chǎn)物主要為λ-卡拉膠理想結(jié)構(gòu)的四糖[72]。2014年，Li等報(bào)道了來(lái)自Bacillus sp.Lc50-1的λ-卡拉膠酶，該酶可以在75℃下降解λ-卡拉膠，屬于一種耐熱的λ-卡拉膠酶，并且該酶在pH 6～9下穩(wěn)定，且在85℃下保持約50%的活性，并持續(xù)10 min[71]。

表3 λ-卡拉膠酶的酶學(xué)性質(zhì)Table 3 Enzymatic properties of λ-carrageenase

2.3 不同種類的卡拉膠酶序列分析

序列比較是生物信息學(xué)中最基本、最重要的操作。比較序列之間的相似性和差異性對(duì)于分析序列的結(jié)構(gòu)特征、親緣關(guān)系、進(jìn)化地位及生物功能等方面具有重要的意義和價(jià)值[89]。

針對(duì)κ-卡拉膠酶，Barbeyron等分別從Alteromonas carrageenovora與Cytophaga drobachiensis中克隆出兩種新的κ-卡拉膠酶基因，并表明κ-卡拉膠酶中的Glu163殘基對(duì)酶的催化作用很重要，且得出GH16糖苷水解酶家族之間的一般同源性是通過(guò)基因復(fù)制產(chǎn)生的結(jié)論[90-91]。近年來(lái)，相繼從Pseudoalteromonas tetraodonis、Zobellia sp.ZM-2、Pseudoalteromonas sp.QY203中克隆并表征出幾種新的κ-卡拉膠酶基因[49，75，84]。值得注意的是，來(lái)自Pseudoalteromonas tetraodonis與Pseudoal-teromonas carrageenovora的κ-卡拉膠酶具有高度相似性，同源性為94%[49]。對(duì)于以上幾種κ-卡拉膠酶，做出序列比對(duì)，結(jié)果如圖2所示 （其中GenBank為ADD92366.1、AHN05534.1的兩種κ-卡拉膠酶的蛋白質(zhì)序列已上傳，但并未有相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行描述）。結(jié)果 發(fā) 現(xiàn)，來(lái) 自Pseudoalteromonas sp.QY203與Pseudoalteromonas carrageenovora的同源性最高，達(dá)到了97%。對(duì)于參與底物結(jié)合和活性催化所必需的幾個(gè)殘基在這些序列中高度保守，如Glu171、Asp173、Glu176、Asp194、Leu197、Ser271和Leu274，其中3個(gè)殘基（Glu171、Asp173和Glu176）參與底物的結(jié)合[92]。

圖2 不同來(lái)源的κ-卡拉膠酶的多序列比對(duì)Fig.2 Multi-sequence alignment of κ-carrageenases from different sources

對(duì)于ι-卡拉膠酶，目前有7種基因已被克隆分析。早期，Barbeyron等從Zobellia galactanovorans中克隆出一種新的ι-卡拉膠酶基因，并表明該卡拉膠酶是一個(gè)與κ-卡拉膠酶家族不相關(guān)的新家族[66]。之后，隨著對(duì)ι-卡拉膠酶的深入探索，又從Microbulbifer thermotolerans JAMB-A94T與Wenyingzhuangia fucanilytica、Brevibacillus choshinensis中鑒定出3種新的ι-卡拉膠酶基因[62，65，68]。值得注意的是，Ma等從Cellulophaga sp.和Cellulophaga sp.QY3克隆出兩種新的ι-卡拉膠酶基因，并表明存在3個(gè)嚴(yán)格保守的殘基（G228、Y229、R254）對(duì)底物結(jié)合起重要作用[63，67]。近年來(lái)，Li等從Flavobacterium sp.YS-80-122中克隆并表征了一種具有耐寒性、耐熱性的新的ι-卡拉膠酶基因[64]。從ι-卡拉膠酶序列比對(duì)圖得出，來(lái)自Cellulophaga sp.QY3與來(lái)自Zobellia galactanivorans的同源性最高，達(dá)到了79%（見(jiàn)圖3）。

圖3 不同來(lái)源的ι-卡拉膠酶的多序列比對(duì)Fig.3 Multi-sequence alignment of ι-carrageenases

關(guān)于λ-卡拉膠酶，目前已發(fā)現(xiàn)兩種該酶的基因，且同源性達(dá)到98%，故不在此做序列分析。

2.4 卡拉膠酶結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制

2.4.1 卡拉膠酶的結(jié)構(gòu)目前，針對(duì)卡拉膠酶的研究較少，僅有4個(gè)卡拉膠酶的晶體結(jié)構(gòu)被完整表征出來(lái)。第一個(gè)得到結(jié)構(gòu)解析的卡拉膠酶是來(lái)自于Pseudomonas carrageenovora的κ-卡拉膠酶（PcCgkA）[92]。 此 外， 還 有 來(lái) 自Zobellia galactanivorans DsiJT的ZgCgkA[93-95]、Alteromonas fortis的ι-卡拉膠酶（CgiA）[96]和來(lái)源于Bacteroides ovatus的外切卡拉膠酶[95-97]。

PcCgkA和ZgCgkA都屬于κ-卡拉膠酶，它們兩者的結(jié)構(gòu)非常相似，都屬于β-夾心結(jié)構(gòu)，其中包括兩個(gè)反向平行的β-折疊片和6個(gè)延伸帶構(gòu)成的活性裂縫[95]。在二級(jí)結(jié)構(gòu)層面，該β型果凍卷折疊是由3個(gè)小的反平行的β-折疊片和一條α螺旋組成。β-折疊片兩兩反向堆積形成催化腔，如隧道狀鑲嵌在三明治狀的結(jié)構(gòu)中，隧道狀催化中心的裂縫位置便是酶與底物的結(jié)合處，這種隧道活動(dòng)場(chǎng)所暗示著一種過(guò)程性的作用模式（見(jiàn)圖4（a）和（b））。

圖4 不同家族的卡拉膠酶結(jié)構(gòu)Fig.4 Structure of different families of carrageenan

PcCgkA和ZgCgkA之間也存在微小的差異。第一個(gè)明顯區(qū)別是κ-卡拉膠酶的模塊結(jié)構(gòu)。即使兩者都是分泌酶，但只有ZgCgkA擁有一個(gè)CBM（碳水化合物結(jié)合模塊）。附加在催化GH模塊上的CBM的存在，一般與相鄰的酶在固體形式下處理頑固的、復(fù)雜的底物有關(guān)，如在植物細(xì)胞壁中所遇到的情況[98-100]。這也從一定方面說(shuō)明從菌體中分泌的ZgCgkA可能會(huì)降解海藻細(xì)胞壁內(nèi)的半結(jié)晶κ-卡拉膠。此外，與PcCgkA相反，DP6不被ZgCgkA水解，也就是說(shuō)DP8是能被ZgCgkA降解的最小寡糖[101]。對(duì)于PcCgkA，DP6完全由隨機(jī)加工產(chǎn)生，而DP4由隨機(jī)和過(guò)程性作用模式產(chǎn)生[46]。對(duì)于同類型酶的結(jié)構(gòu)多樣性可能是由各種進(jìn)化事件造成的，如水平基因轉(zhuǎn)移或序列復(fù)制后的分化進(jìn)化等。

CgiA晶體結(jié)構(gòu)的分析是82家族糖苷水解酶的首次報(bào)道。CgiA的結(jié)構(gòu)為右手平行的β-螺旋狀結(jié)構(gòu)，由10個(gè)完整的具有右旋性的平行β-螺旋結(jié)構(gòu)和表面Loop組成 （見(jiàn)圖4（c））。與PcCgkA和ZgCgkA相比，CgiA具有兩個(gè)額外的C端結(jié)構(gòu)域（A結(jié)構(gòu)域和B結(jié)構(gòu)域）。結(jié)構(gòu)域A類似于DNA/RNA的結(jié)合蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)域B則是由兩個(gè)二硫鍵組成的環(huán)構(gòu)成。Glu245、Asp247或Glu310在酶的裂縫中被認(rèn)為是候選的催化殘基。同時(shí)，該酶還含有一個(gè)鈉和一個(gè)氯化物結(jié)合位點(diǎn)以及3個(gè)鈣結(jié)合位點(diǎn)，這表明這些離子會(huì)參與穩(wěn)定酶結(jié)構(gòu)。

來(lái)自Bacteroides ovatus的卡拉膠酶（BovGH167）結(jié)構(gòu)顯示了4個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中3個(gè)在GH42家族中經(jīng)常見(jiàn)到（見(jiàn)圖4（d））。保守域是結(jié)構(gòu)域A，催化（α/β）8-桶狀結(jié)構(gòu)域；結(jié)構(gòu)域B是一個(gè)由α-螺旋包圍的5股平行β片；結(jié)構(gòu)域C是一個(gè)反平行的β-三明治狀，獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域是在N端有一個(gè)全α螺旋的區(qū)域。

2.4.2 卡拉膠酶的催化機(jī)制根據(jù)糖水解酶在水解過(guò)程中其異頭碳的構(gòu)象是否變化，可分為兩類：保持型和倒置型。

1995年，Potin等從Alteromonas carrageenovora細(xì)菌中純化出一種κ-卡拉膠酶，并且對(duì)其進(jìn)化和水解機(jī)制進(jìn)行了表述[102]。該酶的N末端的信號(hào)肽和C末端均被加工。通過(guò)免疫印跡法表明，成熟的κ-卡拉膠酶須由一個(gè)前體蛋白質(zhì)在分泌過(guò)程中經(jīng)過(guò)兩次水解才能獲得。在該酶水解κ-卡拉膠后，利用凝膠過(guò)濾色譜和13C-NMR分析水解產(chǎn)物新κ-卡拉六糖，發(fā)現(xiàn)該寡糖異頭碳的構(gòu)象并沒(méi)有發(fā)生改變，這表明在酶解過(guò)程中異頭碳的構(gòu)象未發(fā)生變化是屬于保持異構(gòu)構(gòu)型的分子機(jī)制（見(jiàn)圖5）。這一結(jié)果同GH16糖苷水解酶家族的其他糖苷水解酶在酶解過(guò)程中的催化機(jī)制相一致。

κ-卡拉膠酶的反應(yīng)機(jī)制如下，酶結(jié)構(gòu)催化腔主要參與催化作用的氨基酸分別是Glu163、Glu168、Asp165，其中谷氨酸殘基E163作為親核催化，谷氨酸殘基E168作為酸堿催化，而天冬氨酸D165可以促進(jìn)中間轉(zhuǎn)換狀態(tài)的解體。在催化開(kāi)始時(shí)，底物-1處的精氨酸殘基R260將會(huì)結(jié)合κ-卡拉膠的硫酸脂基，其目的是用于識(shí)別底物，保證酶的專一性。該酶的反應(yīng)機(jī)理為雙置換反應(yīng)，具體反應(yīng)過(guò)程如圖5所示。

圖5 κ-卡拉膠酶通過(guò)雙置換反應(yīng)降解卡拉膠的保留機(jī)制Fig.5 Retention mechanism of κ-carrageenase degradation of carrageenan by double substitution reaction

1）Glu的羧基發(fā)生親核取代反應(yīng)，與底物的異頭碳C1生成共價(jià)鍵，在此過(guò)程中，Glu163和Asp165因?yàn)槲蛔栎^大暫時(shí)無(wú)法形成氫鍵。

2）Asp165作為質(zhì)子供體與異頭碳C1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，由于位阻減小，因此Asp165和Glu163之間形成氫鍵，此時(shí)Glu163發(fā)生酸堿催化，導(dǎo)致水分子的電離。

3）Glu163和Asp165之間的低位阻氫鍵得以恢復(fù)，Glu163的親核取代基保持負(fù)電的狀態(tài)，并且開(kāi)始準(zhǔn)備參與新一輪的催化反應(yīng)。

ι-卡拉膠酶的反應(yīng)機(jī)制是通過(guò)一步親核取代作用于β-1，4糖苷鍵，同時(shí)還發(fā)生轉(zhuǎn)糖基和轉(zhuǎn)變異構(gòu)構(gòu)型，因此該酶的催化機(jī)制為倒置型。這種相互作用機(jī)制主要體現(xiàn)在糖鏈上β-螺旋在凹槽上進(jìn)行移動(dòng)，形成一種酶-底物結(jié)合的開(kāi)放式復(fù)合物；隨著酶解過(guò)程的進(jìn)行，該結(jié)構(gòu)折疊閉合，其目的是保證糖鏈降解之后不會(huì)脫離酶的作用位點(diǎn)，使得催化反應(yīng)能夠繼續(xù)進(jìn)行。

Barbeyron等研究了ι-卡拉膠酶的降解機(jī)制，發(fā)現(xiàn)該酶是通過(guò)一步親核取代作用于β-1，4糖苷鍵，同時(shí)還發(fā)生了轉(zhuǎn)糖基和轉(zhuǎn)變異構(gòu)構(gòu)型，其水解產(chǎn)物主要是硫酸化新ι-卡拉二糖[66]。Potin等對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該酶降解ι-卡拉膠的方式是通過(guò)異頭碳構(gòu)象倒置，作用于其內(nèi)部的β-1，4糖苷鍵，有別于κ-卡拉膠酶的保持型[102]。這種相互作用機(jī)制主要體現(xiàn)在糖鏈上β-螺旋在凹槽上進(jìn)行移動(dòng)，形成一種酶-底物結(jié)合的開(kāi)放式復(fù)合物；隨著酶解過(guò)程的進(jìn)行，該結(jié)構(gòu)折疊閉合，其目的是保證糖鏈降解之后不會(huì)脫離酶的作用位點(diǎn)，使得催化反應(yīng)能夠繼續(xù)進(jìn)行（見(jiàn)圖6）。

圖6 ι-卡拉膠酶通過(guò)單置換反應(yīng)降解卡拉膠的倒置機(jī)制Fig.6 Inversion mechanism of ι-carrageenase degradation of carrageenan via a monosubstitution reaction

2.5 卡拉膠酶的應(yīng)用

目前，卡拉膠已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等多方面的工業(yè)生產(chǎn)中。研究表明，降解后的卡拉膠具有抗凝血、抗腫瘤、增強(qiáng)人體體液免疫和細(xì)胞免疫，以及抗病毒等多方面生物活性[7]。通過(guò)酶解法降解卡拉膠，反應(yīng)過(guò)程和條件易于控制且不破壞糖鏈結(jié)構(gòu)，因此酶解法受到了越來(lái)越多的關(guān)注?？ɡz酶是酶解過(guò)程中所需要的酶，因其具有底物的專一性，研究卡拉膠酶具有深遠(yuǎn)的應(yīng)用價(jià)值和理論意義。

2.5.1 制備卡拉膠寡糖據(jù)報(bào)道的卡拉膠寡糖及其修飾后的衍生物具有很多功能的生物活性。郭丹等通過(guò)酶解法制備了低相對(duì)分子質(zhì)量的卡拉膠，隨后進(jìn)行磺化修飾，獲得了具有不同硫酸基含量的卡拉膠寡糖衍生物，發(fā)現(xiàn)新κ-卡拉膠寡糖具有顯著的抗腫瘤活性，并證明了其空間結(jié)構(gòu)、相對(duì)分子質(zhì)量以及硫酸基團(tuán)的含量和存在位置都會(huì)影響卡拉膠衍生物的生物活性[3]。又比如2019年，陳夢(mèng)等通過(guò)酶解法和醇沉法，并與KCl溶液混合，以此獲得高結(jié)合率的低相對(duì)分子質(zhì)量的κ-卡拉膠鉀（LCP），結(jié)果表明，LCP對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠有穩(wěn)定且持續(xù)的降壓作用，此外，還顯著降低血液中脂多糖的水平（P＜0.05），并顯著改善了腸道上皮結(jié)構(gòu)的完整性，該研究填補(bǔ)了LCP在心腦血管疾病領(lǐng)域的空白[103]。另外，卡拉膠寡糖還表現(xiàn)出抗氧化、抗血栓、增強(qiáng)免疫的作用[104-106]。

2.5.2 用于海藻遺傳工程由于卡拉膠主要存在于紅藻細(xì)胞壁中，其黏度很大，DNA提取困難。因此，可以通過(guò)卡拉膠酶和其他酶共同作用來(lái)降解海藻細(xì)胞壁，用于提取DNA、蛋白質(zhì)和原生質(zhì)體等物質(zhì)。

1995年，F(xiàn)leurence等通過(guò)使用不同的酶來(lái)降解細(xì)胞壁從而提取蛋白質(zhì)，不同的酶與不同的海藻的反應(yīng)均在最適反應(yīng)條件下進(jìn)行，結(jié)果表明，用纖維素酶與卡拉膠酶或瓊脂酶結(jié)合使用，在2 h內(nèi)可獲得最高產(chǎn)量的蛋白質(zhì)。該實(shí)驗(yàn)證明了多糖類的酶可以有效幫助降解細(xì)胞壁從而獲得目的產(chǎn)物[107]。Zablackis等通過(guò)纖維素酶與卡拉膠酶的協(xié)同作用，從Kappaphycus alvarezii中分離出來(lái)原生質(zhì)體[108]。

2.5.3 研究卡拉膠的結(jié)構(gòu)卡拉膠是具有重復(fù)二糖單元的線性硫酸化多糖，因此可以通過(guò)卡拉膠酶水解其中糖苷鍵獲得低聚卡拉膠，通過(guò)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析來(lái)推測(cè)卡拉膠多糖的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。Guibet等通過(guò)λ-卡拉膠酶來(lái)降解卡拉膠，并通過(guò)核磁共振技術(shù)研究寡糖產(chǎn)物，結(jié)果表明，λ-卡拉二糖單元中并不都含有3個(gè)硫酸基團(tuán)，而是在部分單元中存在4個(gè)硫酸基團(tuán)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果改變了人們先前所知的λ-卡拉膠結(jié)構(gòu)特征[109]。Antonopoulos等通過(guò)重組ι-卡拉膠酶降解ι-卡拉膠，然后用高效液相色譜法進(jìn)行分離，結(jié)合蒸發(fā)光散射測(cè)定ι-卡拉膠寡糖的結(jié)構(gòu)[110]。

2.5.4 其他應(yīng)用針對(duì)卡拉膠獨(dú)特的生物活性，可以通過(guò)發(fā)酵改造的工程菌株獲取重組卡拉膠降解酶，該重組酶的特點(diǎn)是為外切酶，專一識(shí)別單位僅為六糖，并且表現(xiàn)出抗阿爾茲海默癥的活性[111]。此外，卡拉膠酶對(duì)于海藻廢物處理的應(yīng)用也引起越來(lái)越多的關(guān)注[37]。最后，有研究指出，以κ-卡拉膠為原料，經(jīng)脫硫、專一降解酶系的定向水解及菌種發(fā)酵，從而實(shí)現(xiàn)其乙醇轉(zhuǎn)化，獲得可工業(yè)生產(chǎn)的生物乙醇，這一途徑在未來(lái)將會(huì)極大程度上緩解不可再生資源的供給壓力[112]。

3 硫酸化酶的研究

卡拉膠的生物降解涉及卡拉膠酶和硫酸化酶，前者裂解糖苷鍵，后者催化去除硫酸鹽。盡管大量的卡拉膠酶已被描述，但只確定了少數(shù)硫酸化酶的生物化學(xué)特征。它們都是在海洋細(xì)菌中觀察到的，但從紅藻基因組的分析中還沒(méi)有預(yù)測(cè)到硫酸化酶[113]。

根據(jù)序列同源性、晶體結(jié)構(gòu)和機(jī)制，硫酸化酶被分為4類。I型硫酸化酶或依賴甲酰甘氨酸的硫酸化酶，包括絕大多數(shù)已知的硫酸化酶，以及迄今為止所有生化特性的碳水化合物硫酸化酶[114]。這個(gè)家族的成員是依賴α-甲酰甘氨酸（fgly-dependent）的酶，含有10個(gè)高度保守的極性殘基，參與硫酸鹽識(shí)別和硫酸酯水解[19]。該家族最明顯的特征是其中一個(gè)極性殘基半胱氨酸（Cys）或絲氨酸（Ser）經(jīng)過(guò)翻譯后將轉(zhuǎn)化為具有催化活性位點(diǎn)的醛殘基（α-Fgly殘基）[114]。

II型硫酸化酶包括依賴于α-酮戊二酸的Fe（II）烷基硫酸化酶，屬于雙加氧酶超家族[115]。該酶的催化作用需要分子氧（O2）和α-酮戊二酸作為共同底物，導(dǎo)致醛中的初級(jí)硫酸酯基團(tuán)被氧化，同時(shí)導(dǎo)致α-酮戊二酸氧化脫羧成琥珀酸。III型硫酸化酶的代表是與Zn2+或Mn2+依賴性金屬-β-內(nèi)酰胺酶有關(guān)的酶[116]。

IV型硫酸化酶指一個(gè)由非特征蛋白質(zhì)組成的分支家族。其中具有代表性的酶是來(lái)自Pseudoalteromonas carrageenovora的ι-卡拉膠硫酸化 酶 （PSC ι-CgsA）。 研 究 表 明， 位 于P.carrageenovora的κ-卡拉膠酶產(chǎn)生的低聚κ-卡拉膠非還原端上的硫酸酯基團(tuán)被特異性地消除，這表明硫酸化酶在κ-卡拉膠的酶解后進(jìn)行干預(yù)[117-118]。Weigl等首次證明了從海洋細(xì)菌P.carrageenovora中獲得了具有活性的卡拉膠硫酸化酶[119]。2014年，Genicot等純化并表征了該酶。PSC ι-CgsA的相對(duì)分子質(zhì)量為115 9 00，在pH 8.3和溫度為（40±5）℃時(shí)表現(xiàn)出最佳的活性和穩(wěn)定性。序列分析表明，PSC ι-CgsA與P.haloplanktis TAC 125的一個(gè)假定的非特征蛋白質(zhì)Q3IKL4具有90%以上的序列同源性，但除此之外，與已鑒定的硫酸化酶沒(méi)有任何同源性，因此PSC ι-CgsA做為代表了一個(gè)新的硫酸化酶家族的第一個(gè)特征化成員[120]。

近來(lái)，學(xué)者對(duì)能夠降解卡拉膠的菌株P(guān)seudoalteromonas atlantica T6c進(jìn)行了類似的研究，其基因組已經(jīng)被測(cè)序[121]。一種對(duì)ι-卡拉膠有活性的內(nèi)切ι-卡拉膠硫酸化酶被分離出來(lái)，并進(jìn)行了生物化學(xué)鑒定。該酶特異性地去除β-連接的半乳糖第4位的硫酸鹽，導(dǎo)致ι-卡拉二糖重復(fù)單元轉(zhuǎn)化為α-卡拉二糖重復(fù)單元（見(jiàn)圖7中B）[4，122]。編碼硫酸化酶的基因已被克隆并在大腸桿菌中重組表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)證明，內(nèi)切-4S-ι-卡拉膠硫酸化酶是一種I型硫酸化酶，一種依賴甲酰甘氨酸的硫酸化酶。

另一種卡拉膠硫酸化酶是從P.atlantica T6c中分離出來(lái)的，但它催化κ-卡拉二糖單元的脫硫作用，產(chǎn)生中性的β-卡拉二糖重復(fù)單元（見(jiàn)圖7）。這種內(nèi)切-κ-卡拉膠硫酸化酶在大腸桿菌中的過(guò)度表達(dá)也驗(yàn)證了其在I型硫酸化酶家族中的分組[123]。結(jié)果表明，此類型的酶與第一種卡拉膠硫酸化酶的調(diào)查相反，此類型的酶是對(duì)聚合物發(fā)揮作用，而不是寡糖。這表明卡拉膠的降解可能遵循不同的途徑，即一種途徑是在寡糖卡拉膠脫硫之前卡拉膠的解聚，另一種途徑是假設(shè)多糖的脫硫是在尚未發(fā)現(xiàn)的α-和β-卡拉膠酶降解α-或β-卡拉膠之前。

圖7 在卡拉膠的生物合成和生物降解過(guò)程中觀察到的卡拉膠硫酸化酶Fig.7 Carrageenan sulphatase observed in the biosynthesis and biodegradation of carrageenan

4 卡拉膠酶與硫酸化酶協(xié)同作用降解卡拉膠

由于卡拉膠是高度硫酸化的多糖，去除硫酸基團(tuán)是實(shí)現(xiàn)卡拉膠完全分解所必需的。有研究證實(shí)，來(lái)自海洋異養(yǎng)細(xì)菌Zobellia galactinovorans中卡拉膠的完整分解代謝途徑已被表述（如圖8）。結(jié)果表明，Z.galactinovorans中的GHs和硫酸化酶對(duì)卡拉膠的降解具有協(xié)同作用。在這里，ι-和κ-卡拉膠需要由兩個(gè)專門(mén)的硫酸化酶對(duì)D-半乳糖的C4硫酸基進(jìn)行脫硫，從而產(chǎn)生α-或β-卡拉膠。對(duì)于α-卡拉膠將通過(guò)第3種硫酸化酶將其轉(zhuǎn)化為β-卡拉膠，此過(guò)程是從脫水半乳糖中去除C2硫酸鹽基團(tuán)[124]。如果沒(méi)有這些脫硫處理，低聚卡拉膠的進(jìn)一步的降解步驟將會(huì)停止。具體步驟如下：

圖8 來(lái)自海洋異養(yǎng)細(xì)菌Zobellia galactinovorans中卡拉膠的完整分解代謝途徑Fig.8 Complete metabolic pathway of carrag eenan from the marine heterotrophic bacterium Zobellia galactinovorans

1）卡拉膠多糖的降解 ι-卡拉膠的降解是由GH82家族的ι-卡拉膠酶將多糖鏈裂解成更小的寡糖。而在κ-卡拉膠中，則是由GH16家族的一個(gè)κ-卡拉膠酶完成的。

2）低聚體卡拉膠上的G4脫硫 低聚體ι-卡拉膠需要由S1_19家族的ι-卡拉膠G4S-硫酸化酶對(duì)D-半乳糖殘基進(jìn)行脫硫，從而產(chǎn)生低聚體α-卡拉膠。同樣的步驟發(fā)生在κ-卡拉膠中，在這里，一個(gè)κ-卡拉膠G4S-硫酸化酶水解了在D-半乳糖殘基上的硫酸酯，結(jié)果產(chǎn)生了非硫酸化的β-卡拉膠。

3）α-卡拉膠的脫硫 為了將α-卡拉膠轉(zhuǎn)化為非硫酸化的β-卡拉膠，需要用S1_17家族的α-卡拉膠DA2S-硫酸化酶對(duì)剩余的3，6-脫水-D-半乳糖殘基進(jìn)行脫硫。

4）β-卡拉膠的降解 未硫酸化的β-卡拉膠可以被GH127或GH129家族的3，6-脫水-D-半乳糖苷酶或GH2家族的β-半乳糖苷酶從非還原端繼續(xù)連續(xù)降解。

5 展望

卡拉膠作為一種從海洋紅藻的細(xì)胞壁提取出的多糖物質(zhì)，具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展?jié)摿?。其已被證明具有多種生物活性，包括抗腫瘤、抗病毒、抗凝血等。降解后的卡拉膠及其分子修飾后的衍生物在某些方面已經(jīng)展現(xiàn)出更強(qiáng)的生物活性。但由于目前所了解的卡拉膠分子修飾主要集中在構(gòu)效方面，對(duì)于分子修飾的方法研究較少，因而在對(duì)卡拉膠進(jìn)行設(shè)計(jì)改性從而獲得高活性、高穩(wěn)定性以及具有特定功能的卡拉膠衍生物仍然是今后的研究方向[8]。

卡拉膠多糖的酶降解需要卡拉膠酶和硫酸化酶的共同作用。卡拉膠酶的來(lái)源主要依靠于海洋細(xì)菌。但由于海洋環(huán)境的復(fù)雜性和特殊性，目前對(duì)海洋細(xì)菌的了解還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。迄今為止，已有許多關(guān)于卡拉膠酶得到了分離純化的報(bào)道，并且對(duì)其中的基因進(jìn)行了克隆表達(dá)，但仍未能滿足工業(yè)化生產(chǎn)與

應(yīng)用的要求。其中一部分原因是缺乏相應(yīng)的基因信息或者表達(dá)出來(lái)的酶具有過(guò)低的活性以及較差的穩(wěn)定性。田琳曾通過(guò)優(yōu)化κ-卡拉膠酶的發(fā)酵條件，使其酶活回收率高達(dá)72.4%，為其工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)[125]。因此，在以后的研究中仍然需要重點(diǎn)分析卡拉膠酶的基因序列以及優(yōu)化表達(dá)條件[126-127]。而卡拉膠硫酸化酶的多樣性在于卡拉膠多糖的多樣性。其中卡拉膠硫酸化酶大部分的組成和結(jié)構(gòu)都是未知的。因此，要全面分析硫酸化酶的功能，需要同時(shí)獲得關(guān)于卡拉膠多糖的新數(shù)據(jù)。揭示海洋生物來(lái)源多糖中硫酸化酶和其他酶的轉(zhuǎn)化過(guò)程，這將增強(qiáng)對(duì)海洋生物的分子層面理解。相信隨著基因組學(xué)的不斷進(jìn)步以及科研技術(shù)的不斷發(fā)展，將會(huì)實(shí)現(xiàn)卡拉膠多糖以及其他海洋類能源物質(zhì)的可持續(xù)發(fā)展。