陸雅婷，蘇志恒，梁永紅

（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021）

馬兜鈴酸類物質(zhì)（aristolochic acids，AAs）是常見于馬兜鈴科馬兜鈴屬和細(xì)辛屬植物中的硝基菲類化合物，主要包含馬兜鈴酸（aristolochic acid，AA）I、II、III 和IV 等組分，其中以AAI 的分布最為廣泛[1-3]。早在上個(gè)世紀(jì)，AAI 就被證實(shí)具有明顯的腎毒性，臨床上表現(xiàn)為腎間質(zhì)纖維化、腎小管壞死，被冠以“馬兜鈴酸腎病”[4-5]。同時(shí)也有研究論證AAI作為潛在的致癌物質(zhì)，可引起腎癌、肝癌、淋巴癌等[6-8]。由于AAI 暴露所引起的全球公共衛(wèi)生問題引起了廣泛的關(guān)注，許多國(guó)家和地區(qū)叫停了馬兜鈴科中草藥及其制劑在臨床上的使用。然而，在中醫(yī)藥悠久的發(fā)展進(jìn)程中，該類中草藥及其制劑在抗炎、抗瘧疾和降血糖方面表現(xiàn)出了舉足輕重的作用[9-11]。因此，如果能實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥材中AAI 的捕獲、富集、去除將有助于達(dá)到減毒存效的目的，與此同時(shí)，建立AAI 快速檢測(cè)的方法也將進(jìn)一步推動(dòng)AAI的毒理學(xué)研究，有助于臨床上對(duì)“馬兜鈴酸腎病”的早期預(yù)防診斷，提高用藥安全性和有效性。

基于此，本研究以四氧化三鐵納米顆粒（Fe3O4）為載體，甲基丙烯酸（MAA）為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）為交聯(lián)劑，2,2－偶氮二異丁腈（AIBN）為引發(fā)劑制備AAI 磁性分子印跡聚合物（MIPs），依據(jù)該聚合物特異性吸附、易于分離等特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)AAI快速富集以及專一、簡(jiǎn)便檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

AAI（批號(hào)：MUST-19031511，純度大于98%）購自成都曼思特生物科技有限公司；Fe3O4、MAA、AIBN、EGDMA、丙烯酰胺（AM）、硅酸四乙酯（TEOS）、3-（異丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（3-MPS）、2-乙烯吡啶（2-VP）均是分析純級(jí)別，購于上海阿拉丁試劑有限公司。質(zhì)譜級(jí)別乙腈和磷酸分別購于阿達(dá)瑪斯試劑有限公司和天津市大茂化學(xué)試劑廠。所有的實(shí)驗(yàn)用水均通過凈水系統(tǒng)（Milli-Q）進(jìn)行純化。實(shí)驗(yàn)用的主要儀器有LC-1260Ⅱ型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；傅立葉變換紅外光譜儀（美國(guó)珀金埃爾默公司）；掃描電子顯微鏡（捷克TESCAN）；XS205DU 十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）；超聲清洗器（上海冠特超聲儀器公司）；離心機(jī)TDL-5A（上海菲恰爾分析儀器有限公司）。

1.2 AAI MIPs的制備

1.2.1 Fe3O4@SiO2顆粒的合成 將600 mg Fe3O4顆粒分散在60 mL 異丙醇-超純水（5∶1，v/v）的體系，超聲分散20 min，分別加入10 mL 氨水（25%，w/w）、4 mL TEOS，室溫反應(yīng)12 h，得到黑色產(chǎn)物。反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵吸住產(chǎn)物，除去溶劑。用超純水和甲醇反復(fù)洗滌數(shù)次以除去未反應(yīng)的試劑，最后得到Fe3O4@SiO2顆粒。將顆粒置于50 ℃的真空下干燥，備用。

1.2.2 Fe3O4@SiO2@MPS 顆粒的合成 將600 μL 3-MPS分散在120 mL含10%乙酸溶液的超純水中，室溫下持續(xù)機(jī)械攪拌5 h。上述溶液充分混勻后加入750 mg Fe3O4@SiO2顆粒，60 ℃下機(jī)械攪拌反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后用超純水將得到的產(chǎn)物洗滌直至中性，40 ℃的真空下干燥24 h，備用。

1.2.3 Fe3O4@SiO2@MPS@MIPs（MIPs）和Fe3O4@SiO2@ MPS@ NIPs（NIPs）的合成 將0.026 mmol的AAI 溶于40 mL 乙腈—甲醇（3∶1，v/v）的體系，充分溶解后加入0.104 mmol MAA，室溫下反應(yīng)5 h 形成預(yù)聚物，再將50 mg 的Fe3O4@SiO2@MPS、0.52 mmol EGDMA 和0.06 mmol AIBN 分散在上述溶液中?；旌先芤涸诔曉≈忻摎?5 min 后用氮?dú)夤呐?0 min 以除去氧氣。系統(tǒng)密封，在氮?dú)獗Ｗo(hù)裝置下，65 ℃水浴反應(yīng)24 h。用磁鐵收集得到的黑色產(chǎn)物，依次用甲醇—乙酸溶液（9∶1，v/v）洗滌得到的聚合物，直至濾液通過HPLC檢測(cè)不到有AAI的存在。非分子印跡聚合物（non molecular imprinted poly‐mers,NIPs）的合成方法與MIPs的合成方法類似，只是不需要加入模板分子AAI。

1.3 合成條件的優(yōu)化

1.3.1 模板分子、功能單體和交聯(lián)劑比例的選擇 實(shí)驗(yàn)中固定MAA為功能單體、EDGMA為交聯(lián)劑，考察模板分子、功能單體和交聯(lián)劑的用量比例，分別為1∶4∶20、1∶2∶20、1∶6:20、1∶4∶10、1∶4∶40。

用印跡效率因子（IF）評(píng)價(jià)不同比例的印跡效率，定義為IF=QMIPs/QNIPs。其中QMIPs 和QNIPs 分別代表MIPs 和NIPs 的吸附容量，吸附量Q（μg/mg）采用下面公式計(jì)算：Q=（C0-C）×V/m,式中：C0和C分別為吸附前、后溶液中AAI 的濃度，單位μg/mL；V為加入的AAI 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的體積，單位mL；m 為加入MIPs或者NIPs的質(zhì)量，單位mg。

1.3.2 功能單體的選擇 根據(jù)“1.3.1”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果固定模板分子、功能單體和交聯(lián)劑之間的用量比例，考察不同種類的功能單體對(duì)印跡效率的影響。實(shí)驗(yàn)中選擇的功能單體有MAA、AM、2-VP，用IF評(píng)價(jià)不同功能單體的印跡效率。

1.3.3 溶劑的選擇 溶劑又稱致孔劑，在MIPs的制備過程中溶劑應(yīng)有助于模板分子和其他反應(yīng)物的溶解，從而使聚合物具有孔狀結(jié)構(gòu)，便于模板分子進(jìn)入識(shí)別位點(diǎn)。常用的溶劑種類有乙腈、甲醇、丙酮、氯仿等，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)AAI 易溶于乙腈-甲醇（3∶1,v/v）、丙酮、氯仿，因此本次實(shí)驗(yàn)考察以上幾個(gè)溶劑種類對(duì)印跡效率的影響，用IF 評(píng)價(jià)不同溶劑的印跡效率。

1.4 MIPs和NIPs的表征

采用掃描電鏡（SEM）、傅立葉紅外變換光譜儀（FT-IR）表征得到的MIPs和NIPs形貌以及結(jié)構(gòu)。

1.5 AAI MIPs吸附性能的研究

1.5.1 AAI 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱定15 mg AAI于50mL 容量瓶中并用甲醇溶解定容，配成300 μg/mL AAI 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。再依次量取適量?jī)?chǔ)備液，配成25～200 μg/mL AAI標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.5.2 AAI 在C18柱上的色譜測(cè)定條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相條件：0.1%磷酸水溶液:乙腈=50∶50；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；進(jìn)樣體積:10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm。

1.5.3 MIPs 和NIPs 的靜態(tài)吸附試驗(yàn)將20 mg 的MIPs 或者NIPs 放置于10 mL 離心管，管內(nèi)加入1.5 mL 甲醇，超聲分散30 min 后加入2.5 mL 不同濃度的AAI 標(biāo)準(zhǔn)溶液。室溫條件下將所有的離心管放置在恒溫回旋振蕩器振蕩12 h，1 000 r/min 離心3 min 后再次用超聲儀分散3 min。用磁鐵移除MIPs 或者NIPs，取離心管上清液過0.22 μm 濾膜，用HPLC測(cè)定吸附后溶液中AAI的濃度。

1.5.4 MIPs 和NIPs 的動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn) 將20 mg 的MIPs 或者NIPs 放置于10 mL 離心管，管內(nèi)加入1.5 mL甲醇，超聲分散30 min后加入2.5 mL 200 μg/mL 的AAI 標(biāo)準(zhǔn)溶液。室溫條件下將所有的離心管放置在恒溫回旋振蕩器，分別振蕩5 min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，1 000 r/min離心3 min 后再次用超聲儀分散3 min。用磁鐵移除MIPs 或者NIPs，取離心管上清液過0.22 μm 濾膜，用HPLC測(cè)定吸附后溶液中AAI的濃度。

2 結(jié)果

2.1 AAI MIPs的制備

AAI MIPs 可以高度分散在超純水中（圖1a）。在外部磁鐵的吸附下，黑色固體可以迅速聚集，從而達(dá)到固體、液體完全分離的效果（圖1b）。固液分離的過程可以在10 s內(nèi)完成。

2.2 合成條件的優(yōu)化

2.2.1 模板分子、功能單體和交聯(lián)劑比例的選擇當(dāng)模板分子、功能單體和交聯(lián)劑的物質(zhì)的量比為1∶4∶20時(shí)，AAIMIPs的印跡效果最好，見表1。

圖1 合成的AAI MIPs在超純水中的分散情況（a）和固液分離情況（b）

表1 模板分子、功能單體和交聯(lián)劑不同物質(zhì)的量比對(duì)AAI的印跡效率的影響

2.2.2 功能單體的選擇 以MAA 作為功能單體得到的印跡效率明顯高于選擇AM 和2-VP 作為功能單體，見表2。

表2 不同種類的功能單體對(duì)AAI的印跡效率

2.2.3 溶劑的選擇 以乙腈—甲醇（3∶1，v/v）作為實(shí)驗(yàn)的溶劑體系，可以獲得較高的印跡效率，見表3。

表3 不同種類的溶劑對(duì)AAI的印跡效率

2.3 MIPs和NIPs的表征

從圖2可以看到合成的兩種粒子均近似球形團(tuán)簇在一起，個(gè)體圓滑，粒徑基本一致。圖3 是MIPs和NIPs 的紅外光譜圖，二者的特征峰形基本一致，說明AAI 已經(jīng)成功從聚合物中洗脫。圖3 中1 082.94 cm-1、1 092.65 cm-1吸收峰屬于Si-O-Si 的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)，證明了硅烷偶聯(lián)劑成功偶聯(lián)在了Fe3O4納米顆粒的表面，形成硅層；2 916.51 cm-1、2 920.96 cm-1振動(dòng)峰對(duì)應(yīng)于3-MPS 中C-H 的伸縮振動(dòng)，說明雙鍵基團(tuán)成功接枝在Fe3O4@SiO2，為在其表面制備MIPs提供了條件。

圖2 MIPs（a）和NIPs（b）的SEM 圖

圖3 MIPs和NIPs的紅外光譜圖

2.4 AAI MIPs吸附性能的研究

2.4.1 AAI標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 配制系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的AAI 溶液后利用HPLC 進(jìn)行檢測(cè)，得到AAI 的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖4 所示，在25～200 μg/mL 范圍內(nèi)溶液濃度與峰面積之間有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=5100.7CAAI+3739.6，其中CAAI為AAI 的濃度，相關(guān)系數(shù)R2為0.9996。

2.4.2 MIPs 和NIPs 的靜態(tài)吸附試驗(yàn) 吸附量Q 與AAI 吸附濃度之間的關(guān)系曲線如圖5 所示。對(duì)于MIPs，在AAI 濃度為25～75 μg/mL 范圍內(nèi)吸附量大體保持恒定，在75 μg/mL 之后隨著AAI 濃度的增大，MIPs 的吸附量增大。該現(xiàn)象體現(xiàn)MIPs 對(duì)AAI存在物理吸附和特異性吸附兩種性能。對(duì)于NIPs，其不存在AAI 特異性識(shí)別位點(diǎn)，對(duì)AAI 只有物理吸附，所以吸附效果顯著差于MIPs。

圖4 AAI的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖

圖5 同一吸附時(shí)間MIPs、NIPs對(duì)不同濃度的AAI吸附容量

2.4.3 MIPs 和NIPs 的動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn) 在不同時(shí)間點(diǎn)吸附量Q 與AAI 吸附濃度之間的關(guān)系如圖6 所示。MIPs對(duì)AAI明顯存在較高的吸附速度，且隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，MIPs 對(duì)AAI 的吸附量逐漸增大。在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，NIPs 對(duì)AAI 的吸附量大體保持恒定，未表現(xiàn)出良好的吸附性能。

圖6 不同吸附時(shí)間MIPs、NIPs對(duì)同一濃度的AAI吸附容量

3 討論

3.1 AAI MIPs的制備

Fe3O4納米顆粒有以下特點(diǎn)：低毒性、良好的生物相容性、順磁性[12]，其中，利用Fe3O4的磁性結(jié)合分子印跡聚合物的特異識(shí)別性可以對(duì)模板分子進(jìn)行快速分離，所以本次研究首選Fe3O4作為載體材料。為了更好地形成表面印跡層，本研究還參考現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)Fe3O4進(jìn)行一定的修飾[13]，即在磁球表面用硅殼進(jìn)行改性，再進(jìn)一步經(jīng)溶膠－凝膠反應(yīng)加入3-MPs在Fe3O4@SiO2表面形成雙鍵基團(tuán)。這樣的修飾不僅可以提高納米粒子的分散性，減少團(tuán)聚現(xiàn)象，提高其可重復(fù)利用性，也使其更易于進(jìn)行下一步的修飾，增加了磁性納米粒子的應(yīng)用范圍。同時(shí)，雙鍵基團(tuán)的引入為模板分子與功能單體的聚合提供活性位點(diǎn)，更易于對(duì)AAI 的吸附。通過利用SEM、FTIR 表征得到的產(chǎn)物，確證了成功制備AAI MIPs，該聚合物不僅能對(duì)AAI 有吸附作用，還在外部磁鐵的作用下快速實(shí)現(xiàn)了固液分離，說明所制備的AAI MIPs 保留有載體材料的磁性，同時(shí)也展現(xiàn)出MIPs對(duì)目標(biāo)分析物的高強(qiáng)吸附性。

3.2 AAI MIPs合成條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)選擇EGDMA 為交聯(lián)劑，MAA 作為功能單體，乙腈－ 甲醇作為溶劑，且AAI∶MAA∶EGDMA 物質(zhì)的量比例為1∶4∶20 時(shí)，IF 為3.11，產(chǎn)生較好的印跡效果。EGDMA 可以通過AIBN 與MAA 形成良好的交聯(lián)，從而將MAA 的功能基團(tuán)在空間排列和空間方向上固定下來，更好的讓AAI 鑲嵌其中形成復(fù)合物。MAA 可以與AAI 發(fā)生較強(qiáng)的分子間作用力，形成氫鍵。氫鍵具有方向性和飽和性，可以采用物理或化學(xué)的方法將其斷裂，將AAI完全從復(fù)合物中洗脫。AAI易溶于乙腈、甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑中[14]，所以以乙腈－甲醇作為反應(yīng)溶劑可以讓AAI 高度分散其中，有利于AAI 與MAA 相互結(jié)合，形成均一穩(wěn)定的復(fù)合物。一般而言增大功能單體的比例可以充分地預(yù)組裝印跡分子，但過大濃度的功能單體有可能因?yàn)樽陨淼木酆隙鴾p少特異性結(jié)合位點(diǎn)[15]。參照文獻(xiàn)，模板分子、功能單體和交聯(lián)劑的物質(zhì)的量比以1∶4∶20為宜[16]，本次研究的結(jié)果也表明在這個(gè)條件下對(duì)AAI 有最大吸附效率。IF是評(píng)價(jià)MIPs印跡性能的重要參數(shù)，李小燕課題組制備的MIPs 以青蒿素為模板分子，其IF為2.16，對(duì)青蒿素表現(xiàn)出顯著的吸附效果[17]；陳朗星等[18]以萘夫西林作為模板分子制備MIPs，其IF 為2.46，對(duì)萘夫西林有較高的吸附容量；本研究中得到的MIPs，其IF為3.11，與既往研究的結(jié)果比較，印跡效率因子更大，說明印跡效率更高。

3.3 AAI MIPs吸附性能的研究

在靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)中MIPs 的吸附量隨AAI 濃度的增加而增加，動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MIPs的吸附量隨吸附時(shí)間的增加而增加，且兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中均呈現(xiàn)NIPs 對(duì)AAI 的結(jié)合量明顯低于MIPs。二者吸附差異的原因是NIPs 對(duì)AAI 的吸附是物理吸附，MIPs因內(nèi)部有很多對(duì)AAI 的結(jié)合位點(diǎn)，因此其對(duì)AAI 的吸附量明顯增大。這也進(jìn)一步說明了合成MIPs 對(duì)AAI 具有較高吸附容量，有望應(yīng)用于實(shí)際樣品中AAI的富集和分析。