何奕霏 秦世雯 張石來 黃光福 張靜 楊勤忠 胡鳳益*

（1 云南大學農(nóng)學院/云南省多年生稻工程技術研究中心，昆明650504；2 云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，昆明650205；第一作者：heyifei@mail.ynu.edu.cn；*通訊作者：hfengyi@ynu.edu.cn）

稻瘟病是由稻梨孢菌（Magnaporthe oryzae）引起的水稻真菌病害之一，具有發(fā)病急、破壞力強、發(fā)病地區(qū)廣泛、發(fā)病時期及發(fā)病部位類型多、造成經(jīng)濟損失嚴重等病害特征[1]。利用抗病基因改良品種是目前防治該病害最有效的措施，至今已定位了100 多個稻瘟病抗性主效基因，并克隆了30 多個稻瘟病抗性主效基因[2]。利用已開發(fā)的功能分子標記，可準確地檢測不同水稻品種中存在的稻瘟病抗性基因[3]。

利用長雄野生稻地下莖無性繁殖特性培育的多年生稻已在生產(chǎn)上推廣應用[4-6]。多年生稻不僅能實現(xiàn)免耕、減緩耕作帶來的水土流失等問題，同時還能減少人力和農(nóng)資投入[7]。在多年生稻試驗示范和推廣過程中發(fā)現(xiàn)，其對稻瘟病具有一定抗性，但具體的抗性水平和抗病基因還未明晰。雖然已發(fā)現(xiàn)長雄野生稻第12 號染色體上具有一定稻瘟病廣譜抗性基因Pi57[8]，但該基因是否導入多年生稻品種（系）并引起相應抗性反應還未知。因此，本研究對5 個多年生稻品種（系）PR23、PR24、PR25、PR101、PR107，及其父本長雄野生稻、母本RD23 及（RD23/O. longistaminata）F1進行田間病情調(diào)查、接種抗性鑒定，以及分析已知的多個R 基因在多年生稻品種（系）中有無，初步明確多年生稻對稻瘟病的抗性情況，為多年生稻的稻瘟病抗病育種和生產(chǎn)布局提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以多年生稻品種（系）PR23、PR24、PR25、PR101、PR107、長雄野生稻（多年生稻父本）、泰國優(yōu)質(zhì)秈稻RD23（多年生稻母本）、（RD23/O. longistaminata）F1及本地感稻瘟病品種麗江新團黑谷（LTH）為供試品種。

供試稻瘟病菌為強致病力CH091C 菌株，由云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所保存和提供。

1.2 田間病情調(diào)查

2019 年6 月，在云南省西雙版納州多年生稻示范推廣田塊進行多年生稻品種（系）的葉瘟田間病情情況調(diào)查。采用五點取樣法，各品種（系）取樣數(shù)量為100株，參照國際水稻研究所葉瘟抗性評價分級標準[9]進行病級分級，按照病情指數(shù)=∑（各級病株數(shù)×該病級值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級值）×100 進行病情指數(shù)計算。病情指數(shù)為0 表示高抗（HR），0～5%表示抗（R）, 5.1%～15%表示中抗（MR），15.1%～25%為中感（MS），25.1%～50%為感（S），＞50%為高感（HS）。水稻苗瘟、葉瘟抗性分級標準見表1。

表1 水稻苗瘟葉瘟抗性分級標準（IRRI）

表2 稻瘟病抗性基因檢測的引物序列及相關信息

1.3 苗瘟抗性水平評價

以LTH 為感病對照，利用5%次氯酸鈉對RD23、PR23、PR24、PR25、PR101、PR107 種子以及長雄野生稻地下莖尖組織進行消毒后催芽，每個材料在播種盤（規(guī)格為30 cm×10 cm）中播2 行，每行10 株，共20 株，待長至3 葉1 心時接種稻瘟病菌。稻瘟病菌CH091C菌株于燕麥培養(yǎng)基（燕麥10.0 g、瓊脂4.0 g、蔗糖5.0 g，加水至300 mL，120℃高溫高壓滅菌）上進行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d 后將菌絲洗凈放置于光照培養(yǎng)箱中，產(chǎn)孢培養(yǎng)2 d 后配置濃度約1×105個/mL 孢子懸浮液。用噴壺均勻噴灑于水稻葉片上，放置于培養(yǎng)箱中25℃保濕培養(yǎng)24 h。接種7 d 后，參照國際水稻研究所苗瘟抗性鑒定分級標準進行抗性水平鑒定。

1.4 稻瘟病抗性基因檢測

利用已知的多個稻瘟病抗性基因功能標記和緊密連鎖SSR 標記對多年生稻材料進行PCR 擴增（表2），擴增產(chǎn)物利用1.0%（目標產(chǎn)物＞500bp）或2.0%的瓊脂糖凝膠和8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測（目標產(chǎn)物＜500 bp）。

2 結果與分析

2.1 稻瘟病田間病情調(diào)查結果

通過調(diào)查多年生稻示范推廣田的稻瘟病發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)多年生稻品種（系）和父本長雄野生稻無明顯葉瘟癥狀，呈現(xiàn)較強的稻瘟病抗性，PR23、PR24、PR25、PR101、PR107、長 雄 野 生 稻、F1病 情 指 數(shù) 分 別 為1.44%、1.67%、1.56%、1.11%、1.33%、0、0.74%（表3）。而母本RD23 具有典型稻瘟病斑，調(diào)查病株最輕病級達3級（葉片出現(xiàn)橢圓灰白病斑），大部分病株病級分布于5～7 級（受害面積10%～50%），最高病級可達8 級（葉部受害面積為51%～75%），病情指數(shù)為63.33%（表3）。

表3 多年生稻品系（種）田間病情調(diào)查和苗瘟抗性評價結果

表4 10 個R 基因在多年生稻品系（種）及親本中的分布檢測

表5 5 個R 基因在多年生稻及其親本中的多態(tài)性檢測

2.2 苗瘟抗性水平評價

接種強致病力稻瘟病菌CH091C 菌株7 d 后，PR23、PR24、PR25、PR101、PR107 和長雄野生稻僅有針尖大小病斑，表現(xiàn)為抗病。而感病對照麗江新團黑谷（LTH）和多年生稻品種（系）母本RD23 均具有典型葉瘟癥狀，表現(xiàn)為感?。ū?）。多年生稻品種（系）苗期接種稻瘟病菌進行稻瘟病抗性水平鑒定與田間病情調(diào)查結果較為一致，說明多年生稻品系（種）具有較強的抗瘟性，同時該特性可能來源于父本長雄野生稻。

2.3 稻瘟病抗性基因檢測

利用功能標記檢測10 個已知的R 基因在多年生稻中的分布，在PR23 和PR25 中均檢測到抗性基因Pizt、Pi5、Pi1、Piz，但只有Pi5 在長雄野生稻以及PR23、PR25 中檢測得到，且在RD23 中缺失，所以PR23、PR25 所攜帶的Pi5 基因可能來源于長雄野生稻（表4）。

PR107 攜帶Pizt、Piz、Pi5 稻瘟病抗病基因，僅Pi5在長雄野生稻檢測到，而RD23 中缺失，因此來源于長雄野生稻的Pi5 可能為PR107 的稻瘟病抗病基因（表5）。

利用與Pish、Pita-2、Pi7、Pi20、Pi57（t）基因分別連鎖的SSR 標記RM212（Pish）、RM6905（Pita-2）、RM273 84/RM27386（Pi7）、OSR32（Pi20）、RM5364/RM7102（Pi 57（t））對5 個多年生稻品系（種）進行基因型評價，發(fā)現(xiàn)PR23、PR24、PR25 中攜帶來自長雄野生稻的Pita-2位點，而PR107 中攜帶來自長雄野生稻的Pish 位點（表5）。推測PR23、PR24、PR25 的稻瘟病抗性基因可能來源于長雄野生稻的Pita-2 位點，而PR107 的稻瘟病抗性基因可能來源于長雄野生稻的Pish 位點。

因此，PR23 和PR25 的稻瘟病抗性基因可能來源于長雄野生稻的Pi5 基因和Pita-2 位點，PR24 稻瘟病抗性基因可能來源于長雄野生稻的Pita-2 位點，PR107 稻瘟病抗性基因可能來源于長雄野生稻的Pi5基因和Pish 位點，本文涉及到的稻瘟病抗性基因或位點PR101 中均不存在，推測其稻瘟病抗性來自長雄野生稻未知的稻瘟病抗性基因。

3 結論與討論

稻瘟病是危害最嚴重的水稻病害之一，培育和推廣抗病品種是目前最科學的防治對策。由于稻瘟病菌變異頻率較高，大部分抗病品種的抗性會隨著應用時間的增長而逐漸降低直至消失[17]。因此，需要不斷挖掘、鑒定新的抗病品種進行推廣或作為抗源應用于未來的稻瘟病抗性育種中。本文針對具有抗稻瘟病潛力的5 個主栽多年生稻品種（系）的抗性水平進行了初步探究。在田間病情調(diào)查中，這5 個多年生稻品種（系）的病情指數(shù)均未達到感病系數(shù)，抗性鑒定中，這5 個多年生稻品種（系）對接種稻瘟病菌為完全免疫反應。因此，可以認為這些多年生稻抗稻瘟病。此次多年生稻田間抗性的評價是針對其自然狀態(tài)下的發(fā)病情況來評定，反應了多年生稻在田間的自然抗性的差異，今后可以進一步建立病圃對多年生稻的抗病水平進行更精準的評定。除此之外，對多年生稻抗性水平的全面解析還需進一步利用更多的優(yōu)勢生理小種對其抗譜進行測定，并結合田間鑒定。

多年生稻親本的田間病情調(diào)查結果和抗性鑒定均顯示，長雄野生稻為抗性品種，RD23 為感病品種，多年生稻的稻瘟病抗性可能來源于父本長雄野生稻。且有前人報道，基于長雄野生稻轉錄組中發(fā)現(xiàn)大量導致栽培稻感稻瘟病的基因在長雄野生稻中沒有檢測到相應的基因信號，長雄野生稻可能是稻瘟病抗性基因庫[18]。本文利用功能性分子標記和緊密連鎖SSR 標記對多個稻瘟病抗性基因在多年生稻品種（系）的分布及遺傳背景進行分析，發(fā)現(xiàn)3 個抗性基因位點Pish、Pita-2、Pi5可能為多年生稻中來源于長雄野生稻的抗性基因。另外，本研究中還發(fā)現(xiàn)部分多年生稻的稻瘟病抗性可能來源于長雄野生稻中其余已知基因或未知基因，這些未知基因很可能是長雄野生稻中未被挖掘的稻瘟病抗性新基因，需進行更深入的研究。

無論是田間自然發(fā)病、接種鑒定，還是鑒定部分已知的稻瘟病抗性基因或位點，均表明已經(jīng)育成的多年生稻23、云大24、云大25、云大101、云大107 具有較好的稻瘟病抗性，這對多年生稻的示范推廣、品種布局、植保技術等示范推廣具有實際指導意義。