陳飛 張昌泉 周少川 李愛(ài)宏 劉巧泉*

（1 揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院/江蘇省作物基因組學(xué)和分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州225009；2 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，廣州510640；3 江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州225009；

*通訊作者：qqliu@yzu.edu.cn）

我國(guó)水稻單產(chǎn)已獲得了較大進(jìn)步，但稻米品質(zhì)總體偏差，尤其是一些高產(chǎn)秈稻品種，稻米品質(zhì)往往較差。胚乳是稻米的主要食用部分，其干質(zhì)量的90%左右是淀粉[1-2]。一般認(rèn)為，直鏈淀粉和支鏈淀粉構(gòu)成了淀粉的半晶體結(jié)構(gòu)，兩者的組成和結(jié)構(gòu)對(duì)稻米品質(zhì)特別是蒸煮食味品質(zhì)的優(yōu)劣起到?jīng)Q定性的作用[3-4]。直鏈淀粉含量是影響稻米食味品質(zhì)最重要的因素，也是最重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)。通常直鏈淀粉含量高的米飯質(zhì)地偏硬，直鏈淀粉含量低的米飯比較松軟。除直鏈淀粉含量外，直鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)差異也顯著影響米飯的口感[5]。此外，支鏈淀粉的鏈長(zhǎng)分布差異是一些具有相似直鏈淀粉含量水稻品種間食味品質(zhì)差異的重要原因[3,6]。

我國(guó)水稻種植區(qū)域廣泛，亞種和品種間的品質(zhì)差異較大。從秈稻品種的稻米品質(zhì)上來(lái)看，秈稻品種的整精米率、堊白粒率、堊白度和直鏈淀粉含量的優(yōu)質(zhì)達(dá)標(biāo)率往往都不是很高[7]。對(duì)長(zhǎng)江上游的中秈稻、長(zhǎng)江中下游和華南的晚秈稻膠稠度和直鏈淀粉含量的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，近些年通過(guò)審定的品種膠稠度普遍有了提高，同時(shí)，稻米直鏈淀粉含量出現(xiàn)下降[7]。此外研究表明，近10 年來(lái)通過(guò)審定推廣的秈稻品種稻米品質(zhì)有了很大的提高，如黃華占、玉針香、中早35、豐華占、揚(yáng)稻6 號(hào)等[8-9]。揚(yáng)稻6 號(hào)是江蘇里下河地區(qū)農(nóng)科所選育的集優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)和多抗于一體的適應(yīng)性強(qiáng)的中秈稻新品種[10-11]。黃華占是由廣東省農(nóng)科院水稻研究所選育的抗逆性強(qiáng)、生育期短、耐肥抗倒、米質(zhì)特優(yōu)的常規(guī)秈稻品種[12-14]。本研究以黃華占和揚(yáng)稻6 號(hào)為試驗(yàn)材料，系統(tǒng)分析了這2 個(gè)品種的稻米理化品質(zhì)和淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)，以期探尋優(yōu)質(zhì)常規(guī)秈稻品質(zhì)形成的理化特性和淀粉結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，為優(yōu)質(zhì)秈稻品質(zhì)的進(jìn)一步改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試品種與種植條件

黃華占（簡(jiǎn)寫(xiě)HHZ）和揚(yáng)稻6 號(hào)（又名9311）于2019 年夏天正季種植于揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院校區(qū)試驗(yàn)基地。5 月15 日播種，6 月12 日移栽，每個(gè)材料種植4行，每行10 株，株行距14 cm×18 cm。10 月5 日收割，按照常規(guī)栽培技術(shù)管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

將收獲的成熟稻谷在自然條件下干燥1 周，用礱谷機(jī)出糙獲得糙米，除雜后用精米機(jī)（日本Kett 公司）出精獲得精米。部分精米用于淀粉的提取，其他精米利用旋風(fēng)式磨粉機(jī)（丹麥FOSS 公司）磨成粉。米粉過(guò)100目篩后在40℃烘箱中烘2 d，隨后在室溫條件下放置2 d 用于平衡水分。最后用自封袋密封保存米粉，室溫下存放待用。

1.2.2 稻米理化品質(zhì)測(cè)定

表觀直鏈淀粉含量（Apparent amylose content,AAC）和膠稠度（Gel consistency, GC）分別按照NY147-88 和GB 17891- 1999 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定。堿消值（Alkali spreading value, ASV）的測(cè)定依照NY147-88 標(biāo)準(zhǔn)和LITTLE 等[15]方案進(jìn)行。參照Z(yǔ)HANG 等[16]的方法利用快速黏度分析儀（Rapid visco-analyzer, RVA）測(cè)定稻米淀粉黏滯性，利用差示掃描量熱儀（Difference Scan Calculation, DSC200F3, 德國(guó)耐馳公司）測(cè)定淀粉熱力學(xué)特性。

1.2.3 淀粉的提取

參照Z(yǔ)HANG 等[16]的方法利用堿性蛋白酶去除米粉中的蛋白獲得淀粉。此外，利用氯仿和甲醇混合液（1∶1，v/v）在40℃條件下抽提淀粉2 次，去除淀粉中的脂類。淀粉用90%酒精洗2 次后用冷凍干燥機(jī)干燥，將干燥了的淀粉過(guò)200 目篩，從而獲得純化淀粉。

1.2.4 淀粉粒形態(tài)和粒徑分析

取2～3 粒成熟的精米，用鑷子掰斷獲得橫斷面，用刀片切割獲得平整的另一斷面并用導(dǎo)電膠固定在樣品上。樣品噴金處理后直接在掃描電子顯微鏡（S4800II，日立公司）進(jìn)行斷面觀察。對(duì)于純化的淀粉，直接用鑷子挑取微量淀粉分散在導(dǎo)電膠上，噴金處理后直接進(jìn)行掃描電鏡觀察。為比較淀粉粒徑分布，拍取相同放大倍數(shù)下的淀粉粒，用Nano Measurer 1.2 軟件測(cè)定淀粉粒直徑，每個(gè)品種測(cè)量300 粒，最后繪制淀粉粒徑分布圖。

1.2.5 淀粉鏈長(zhǎng)分布分析

參照Z(yǔ)HANG 等[16]的方法用異淀粉酶（E-ISAMY，Megazyme，愛(ài)爾蘭）脫去淀粉分支，隨后用高溫凝膠排阻色譜儀（GPC, PL-GPC 220，美國(guó)）測(cè)定淀粉的相對(duì)分子量分布。此外，利用高效液相陰離子色譜儀（HPAEC, Thermo ICS-5000，美國(guó)）分析支鏈淀粉的鏈長(zhǎng)分布。

1.2.6 淀粉的晶體結(jié)構(gòu)分析

參照CAI 等[17]的方法，利用多晶X-射線衍射儀（D8-ADVANCE，德國(guó)）分析淀粉的相對(duì)結(jié)晶度；利用傅里葉紅外光譜儀（Varian 7000 FTIR，美國(guó)）分析淀粉的短程有序結(jié)構(gòu)；利用小角X-射線散射儀分析淀粉的晶體片層強(qiáng)度和厚度。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

本研究中各個(gè)實(shí)驗(yàn)的每個(gè)樣品至少進(jìn)行2 次重復(fù)，并利用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 21.0 以及Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，樣本間比較采用單因素T-測(cè)驗(yàn)。試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻米主要理化品質(zhì)的比較

相對(duì)于揚(yáng)稻6 號(hào)而言，黃華占千粒重（20.56 g）顯著低于揚(yáng)稻6 號(hào)（32.59 g）。從外觀看，黃華占和揚(yáng)稻6號(hào)稻米堊白粒率分別為11.2%和13.5%，差異不顯著，兩者均為低堊白粒率品種。黃華占成熟稻米的表觀直鏈淀粉含量為16.22%，顯著高于揚(yáng)稻6 號(hào)（15.00%）；總淀粉含量（7.89 mmol/L）與揚(yáng)稻6 號(hào)（7.83 mmol/L）無(wú)顯著差異；但是，黃華占稻米中的粗蛋白含量（8.28%）要明顯低于揚(yáng)稻6 號(hào)（8.73%）。由表1 可知，2 個(gè)稻米樣品的水分、總淀粉含量和膠稠度無(wú)顯著差異。堿消值（ASV）測(cè)定結(jié)果顯示，2 個(gè)品種稻米均屬于中低糊化類型，但黃華占的堿消值要低于揚(yáng)稻6 號(hào)，說(shuō)明黃華占稻米糊化溫度要高于揚(yáng)稻6 號(hào)。圖1A 是2 個(gè)品種米粉熱糊化特性（DSC 吸熱曲線）的比較分析，較揚(yáng)稻6 號(hào)而言，黃華占的吸熱峰提前，起始、峰值和最終糊化溫度都略高（表1），完成糊化所用的溫度跨度也縮短，也就是說(shuō)通過(guò)熱糊化過(guò)程所需要的時(shí)間變短；此外，黃華占米粉糊化需要較高的焓值，即需吸收更多的熱量。

評(píng)價(jià)稻米食味品質(zhì)的另一重要理化指標(biāo)是由RVA 儀測(cè)定的稻米黏滯性。如圖1B 所示，2 個(gè)稻米樣品的RVA 曲線較為相近。但是從特征值來(lái)看，黃華占米粉的峰值黏度（3288.5±13.4 cP）和崩解值（1263.5±26.2 cP）顯著高于揚(yáng)稻6 號(hào)（3048.0±15.6 cP 和796.0±2.8 cP）。此外，黃華占米粉的熱漿黏度（2025.0±12.7 cP）和消減值（183.0±28.3 cP） 顯著低于揚(yáng)稻6 號(hào)（2253.5±14.8 cP 和415.5±6.4 cP）。兩者的冷膠黏度（CPV）和初始糊化溫度（PaT）比較接近。研究表明，RVA 譜特征值中的崩解值和消減值與稻米的食味品質(zhì)密切相關(guān)，一般崩解值大而消減值小的稻米食味品質(zhì)較好[18]。結(jié)合RVA 譜的特征值分析可知，黃華占米粉表現(xiàn)出較小的消減值和回復(fù)值、以及較高的崩解值，推測(cè)出黃華占的稻米食味品質(zhì)可能優(yōu)于揚(yáng)稻6 號(hào)。

表1 黃華占和揚(yáng)稻6 號(hào)稻米的主要理化和熱力學(xué)特性比較

圖1 黃華占和揚(yáng)稻6 號(hào)米粉的DSC 吸熱曲線（A）和RVA 譜（B）

2.2 稻米淀粉粒結(jié)構(gòu)的比較

如圖2A 所示，2 個(gè)品種稻米外觀均為透明的長(zhǎng)粒形，相對(duì)于揚(yáng)稻6 號(hào)而言，黃華占粒長(zhǎng)較短、粒寬較窄，但長(zhǎng)寬比相似，兩者無(wú)顯著差異（圖2B-D）。為明確2個(gè)品種稻米內(nèi)部淀粉粒結(jié)構(gòu)是否有差異，利用掃描電鏡分析了籽粒斷面的結(jié)構(gòu)，如圖2E-F 所示，2 個(gè)品種籽粒斷面中的淀粉粒排列均較為緊湊且規(guī)則，無(wú)顯著差異。同時(shí)對(duì)從稻米中分離純化的淀粉粒做了觀察比較，2 個(gè)品種的淀粉粒均較為規(guī)則，也無(wú)顯著差異（圖2G-H）。進(jìn)一步基于掃描電鏡結(jié)果計(jì)算了了2 個(gè)樣品的淀粉粒徑分布，2 個(gè)樣品淀粉粒徑分布較為相似，平均直徑均在4.5 μm 左右，其中黃華占淀粉粒徑較揚(yáng)稻6 號(hào)稍大，但未達(dá)顯著水平（圖2I）。上述結(jié)果說(shuō)明這2個(gè)品種在淀粉粒結(jié)構(gòu)上無(wú)顯著差異。

圖2 黃華占和揚(yáng)稻6 號(hào)稻米外觀和淀粉粒掃描電鏡觀察

2.3 稻米淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的比較

為明確淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)對(duì)稻米品質(zhì)的影響，首先利用高溫凝膠滲排阻色譜儀（GPC）分析這2 個(gè)品種稻米淀粉的相對(duì)分子量分布。如圖3A 所示，2 個(gè)樣品淀粉均被分成了3 個(gè)峰，基于已有研究，可知其中峰1 和峰2 分別為支鏈淀粉的短鏈（AP1）和長(zhǎng)鏈（AP2）[16]，其中，揚(yáng)稻6 號(hào)淀粉的AP1 組分稍有提高，但并不顯著。研究表明，AP1/AP2 反映的是支鏈淀粉的分支度，其比值越大說(shuō)明淀粉的分支度越高[17]。通過(guò)計(jì)算2 個(gè)樣品的分支度，發(fā)現(xiàn)黃華占淀粉的AP1/AP2 比值（2.89±0.03）顯著小于揚(yáng)稻6 號(hào)（3.09±0.02）。第3 個(gè)峰表示的是直鏈淀粉組分（AM），從中可以看出黃華占淀粉的直鏈淀粉組分顯著多于揚(yáng)稻6 號(hào)，尤其是直鏈淀粉的短鏈組分更為明顯。

進(jìn)一步明確支鏈淀粉鏈長(zhǎng)分布特點(diǎn)，借助于高效液相陰離子色譜儀（HPAEC）獲得支鏈淀粉的鏈長(zhǎng)分布特點(diǎn)的信息。通過(guò)計(jì)算黃華占與揚(yáng)稻6 號(hào)支鏈淀粉鏈長(zhǎng)的差值，發(fā)現(xiàn)黃華占淀粉的支鏈短鏈DP[（6～14）和（16～23）]部分明顯減少，而中長(zhǎng)鏈DP（25～34）和長(zhǎng)鏈DP（42-70）部分明顯增加。研究表明，淀粉的中長(zhǎng)鏈?zhǔn)切纬傻矸劬w結(jié)構(gòu)的主要組分，較長(zhǎng)的支鏈所形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定而使得熔解淀粉晶體所需要的溫度更高[9]。因此，該結(jié)果能夠較好的解釋黃華占稻米較高的糊化溫度。

圖3 黃華占和揚(yáng)稻6 號(hào)稻米淀粉的相對(duì)分子量分布（A）和支鏈淀粉的鏈長(zhǎng)分布（B）

圖4 黃華占和揚(yáng)稻6 號(hào)稻米淀粉的X 射線衍射（A）和傅里葉紅外光譜（B）分析

2.4 稻米淀粉晶體結(jié)構(gòu)比較

稻米淀粉粒主要是由其中支鏈淀粉分子所形成的雙螺旋晶體結(jié)構(gòu)和部分支鏈淀粉及直鏈淀粉形成的無(wú)定型結(jié)構(gòu)的半晶復(fù)合體，因此淀粉的分子結(jié)構(gòu)對(duì)淀粉的晶體類型和結(jié)晶度具有重要的影響[19]。首先利用X-射線衍射（XRD）技術(shù)分析了2 個(gè)淀粉樣品的晶體衍射情況。如圖4A 所示，2 個(gè)淀粉樣品均在衍射角2θ 角為15°、17°、18°和23°時(shí)產(chǎn)生單衍射峰，其中17°和18°附近的衍射峰為相連的雙峰，屬于谷物淀粉典型的A 型衍射類型[20]。但是進(jìn)一步比較分析淀粉的長(zhǎng)程有序結(jié)構(gòu)（相對(duì)結(jié)晶度）部分，發(fā)現(xiàn)黃華占淀粉的相對(duì)結(jié)晶度（23.41%±0.21%）顯著高于揚(yáng)稻6 號(hào)淀粉（21.58%±0.16%）。該結(jié)果與淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)差異具有很好的一致性。因?yàn)榈矸劬w主要是由支鏈淀粉的中長(zhǎng)鏈所形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)組成，從而推斷出黃華占淀粉中相對(duì)較多的支鏈淀粉長(zhǎng)鏈?zhǔn)瞧漭^高結(jié)晶度的主要原因。此外，這也解釋了黃華占淀粉較高的熱焓值，因?yàn)榈矸劢Y(jié)晶度越高，其在糊化過(guò)程中所需的熱量也就越多[19]。

傅里葉紅外光譜技術(shù)可以精確的解析淀粉晶體結(jié)構(gòu)的短程有序的結(jié)構(gòu)。如圖4B 所示，黃華占和揚(yáng)稻6號(hào)淀粉的紅外吸收曲線較為一致。通常紅外光譜中1045/cm 和1022/cm 的紅外吸收峰是淀粉結(jié)晶區(qū)和無(wú)定形區(qū)的結(jié)構(gòu)特征，兩者的比值（1045/1022）能夠反映淀粉分子的短程有序程度[21]。通過(guò)特征值的計(jì)算發(fā)現(xiàn)，黃華占淀粉的短程有序度（0.96±0.06）較揚(yáng)稻6 號(hào)淀粉（0.92±0.04）高，但差異不顯著。

3 討論

3.1 稻米理化品質(zhì)與稻米食味品質(zhì)的關(guān)系

黃華占和揚(yáng)稻6 號(hào)已經(jīng)審定并推廣多年，由于其較好的適應(yīng)性、抗逆性和優(yōu)良稻米品質(zhì)特性，目前在國(guó)內(nèi)種植面積仍然較大。稻米品質(zhì)涉及多方面，而稻米蒸煮食味品質(zhì)是消費(fèi)者所重點(diǎn)關(guān)心的性狀，該性狀又涉及多個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)[22]。其中，直鏈淀粉含量是稻米重要的品質(zhì)指標(biāo)，通常優(yōu)質(zhì)稻米直鏈淀粉含量處于中等偏低水平（5%～15%），近些年來(lái)選育的優(yōu)良食味軟米類品種直鏈淀粉含量普遍在10%左右[23-24]。本研究中選用了2 個(gè)中等直鏈淀粉含量類型的秈稻品種，但黃華占稻米的表觀直鏈淀粉含量和實(shí)際直鏈淀粉含量（AM）均高于揚(yáng)稻6 號(hào)。研究表明，稻米直鏈淀粉含量與膠稠度、食味品質(zhì)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性[3，19]，但是通過(guò)RVA 特征值的數(shù)據(jù)可以看出黃華占稻米的食味品質(zhì)可能優(yōu)于揚(yáng)稻6 號(hào)。研究發(fā)現(xiàn)，稻米蛋白質(zhì)含量與米飯質(zhì)地呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)[25]，此外，直鏈淀粉短鏈和支鏈淀粉的鏈長(zhǎng)分布都與米飯的質(zhì)地密切相關(guān)[3]。因而這種差異可能與黃華占稻米具有相對(duì)較低的蛋白質(zhì)含量和淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)方面的差異有關(guān)。

3.2 淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)差異是稻米理化特性變異的重要原因

Wx 基因是稻米食味品質(zhì)的關(guān)鍵基因，而參試的2個(gè)品種均攜帶Wxb等位基因，因此通過(guò)對(duì)兩者稻米理化品質(zhì)和淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)分析可以獲得除主效基因外的一些信息。綜合分析結(jié)果表明，黃華占稻米蛋白質(zhì)含量較揚(yáng)稻6 號(hào)低，但表觀直鏈淀粉含量相對(duì)較高。此外，盡管利用堿消值法測(cè)得的糊化溫度2 個(gè)品種間無(wú)顯著差異，但通過(guò)熱力學(xué)特性分析表明，黃華占稻米的糊化溫度高于揚(yáng)稻6 號(hào)。淀粉結(jié)構(gòu)分析表明，2 個(gè)品種在淀粉粒結(jié)構(gòu)層面無(wú)顯著差異，但是黃華占稻米淀粉中含有相對(duì)較少的支鏈淀粉短鏈以及較多的支鏈淀粉長(zhǎng)鏈和較多的直鏈淀粉短鏈。研究表明，較長(zhǎng)的支鏈淀粉長(zhǎng)鏈能夠形成更加穩(wěn)定且更長(zhǎng)的雙螺旋結(jié)構(gòu)。因此，淀粉的長(zhǎng)程有序結(jié)構(gòu)明顯較高，而短程有序結(jié)構(gòu)差異不顯著。此外，多數(shù)直鏈淀粉分子在淀粉粒組裝過(guò)程中存在于非結(jié)晶區(qū)內(nèi)（無(wú)定型區(qū)域），因而直鏈淀粉增加會(huì)降低淀粉的結(jié)晶度[19]。本研究表明，盡管黃華占稻米淀粉的直鏈淀粉含量較高，但其相對(duì)結(jié)晶度仍然較高，分析可能與其增加的幅度較小有關(guān)。黃華占和揚(yáng)稻6 號(hào)都攜帶相同的Wxb等位基因，直鏈淀粉含量屬中等偏低。上述結(jié)果表明，除直鏈淀粉含量外，品種間也會(huì)因支鏈淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)方面的差異而造成稻米品質(zhì)的細(xì)微區(qū)別。

3.3 微調(diào)直鏈淀粉含量和支鏈淀粉結(jié)構(gòu)的遺傳調(diào)控位點(diǎn)

稻米品質(zhì)性狀的遺傳調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，盡管Wx 基因是直鏈淀粉含量調(diào)控的主效基因，但近些年來(lái)已經(jīng)鑒定了多個(gè)直鏈淀粉含量調(diào)控的微效QTL 或基因。如ZHANG 等[26]鑒定的qsAC3 位點(diǎn)能夠穩(wěn)定提高約1%的直鏈淀粉含量。此外，一些直接參與淀粉合成相關(guān)的基因也能影響稻米直鏈淀粉含量，如ALK 基因。攜帶控制高糊化溫度的ALKc 等位基因其稻米直鏈淀粉含量會(huì)有一定程度的下降[27]。本實(shí)驗(yàn)中，黃華占稻米的糊化溫度較高，而其直鏈淀粉含量仍然相對(duì)較高，因此推測(cè)這種差異與ALK 基因等位變異無(wú)關(guān)。進(jìn)而可以推測(cè)可能存在一些其他未知位點(diǎn)在微調(diào)直鏈淀粉含量和支鏈淀粉結(jié)構(gòu)。本研究表明蛋白質(zhì)含量和淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)等差異可能是稻米食味品質(zhì)差異的主要原因。