(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院慢病研究院,山東 青島 266071)

卵巢漿液性囊腺癌(OV)是比良性漿液性囊腺瘤和交界性漿液性囊腺瘤(SBT)嚴(yán)重的一種卵巢上皮性癌亞型[1]。根據(jù)美國KURMAN教授提出的卵巢癌“二元模型”理論，可以將OV分為兩種類型：Ⅰ型的低級別漿液性囊腺癌(LGSC)和Ⅱ型的高級別漿液性囊腺癌(HGSC)[2]。目前認(rèn)為，HGSC發(fā)病起源于輸卵管，與LGSC在分子學(xué)和組織學(xué)水平上存在明顯差異[3-4]。相較于LGSC，HGSC具有發(fā)病年齡較晚(55～65歲)、發(fā)病率高、生存率低、對化療藥物敏感性高且易復(fù)發(fā)等特點，因此對HGSC預(yù)后判斷和治療策略的深入研究也顯得尤為迫切。本研究運用生物信息學(xué)的方法，從GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫獲取OV基因芯片數(shù)據(jù)，從中挖掘HGSC的差異表達(dá)基因(DEGs)，進(jìn)行基因本體(GO)富集分析和KEGG信號通路分析，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，篩選出關(guān)鍵基因，并分析關(guān)鍵基因表達(dá)與HGSC預(yù)后的關(guān)系，從而為HGSC的靶向治療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO/)中檢索并下載的OV相關(guān)數(shù)據(jù)集有5個(GSE10971、GSE14001、GSE18521、GSE27651、GSE12470)[5-6]，其中前4個數(shù)據(jù)集對應(yīng)的檢測平臺為GPL570，而最后1個數(shù)據(jù)集對應(yīng)的檢測平臺為GPL887。在每個GSE數(shù)據(jù)集中，只選擇HGSC樣本以及與之匹配的正常樣本數(shù)據(jù)。其中GSE10971數(shù)據(jù)集中包含腫瘤樣本13個和正常樣本12個，GSE14001數(shù)據(jù)集中包含腫瘤樣本10個和正常樣本3個，GSE18521數(shù)據(jù)集中包含腫瘤樣本53個和正常樣本10個，GSE27651數(shù)據(jù)集中包含腫瘤樣本22個和正常樣本6個， GSE12470數(shù)據(jù)集中包含腫瘤樣本35個和正常樣本10個[7-11]。利用GEO2R (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)分析工具進(jìn)行在線分析，將結(jié)果匯總在Excel表格中，去除沒有基因名稱或基因探針以及同一個基因?qū)?yīng)多個基因探針的數(shù)據(jù)。

1.2 DEGs的篩選

使用R 3.6.2軟件(https://www.r-pro-ject.org/)中的edgeR包對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，之后對數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選。篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：P<0.01，差異倍數(shù)logFC≥1或≤-1[12]。然后再對篩選出的DEGs進(jìn)行火山圖的可視化分析。

1.3 上調(diào)基因和下調(diào)基因的篩選

將上一步篩選的DEGs數(shù)據(jù)，按照logFC>1為上調(diào)基因的標(biāo)準(zhǔn)、logFC<-1為下調(diào)基因的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行再次篩選。然后，將5個數(shù)據(jù)集中的上調(diào)基因或下調(diào)基因全部導(dǎo)入Bioinformatics & Evolutionary Genomics(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在線數(shù)據(jù)庫中，以尋找5個數(shù)據(jù)集中上調(diào)基因或著下調(diào)基因的交集[13]。

1.4 GO和KEGG富集分析

利用DAVID 6.8(Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery, https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫分析基因組規(guī)模數(shù)據(jù)集的生物信息，并進(jìn)行基因和蛋白質(zhì)的功能信息的可視化[14]。GO分析用于分析大量注釋基因的生物學(xué)過程、分子功能及細(xì)胞組成[15]。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析是從分子水平上了解基因和蛋白質(zhì)所參與的信號通路和生物學(xué)功能。GO和KEGG富集分析均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵基因的篩選

將全部的DEGs導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)[16]中進(jìn)行分析，以置信度≥0.4為PPI顯著。將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中進(jìn)行可視化分析[17]。應(yīng)用Cytoscape軟件中的cytoHubba插件從PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選關(guān)鍵基因，選擇度定位≥12的DEGs作為關(guān)鍵基因。

1.6 關(guān)鍵基因的生存預(yù)后分析

通過在線生存分析工具Kaplan-Meier plotter(http://kmp lot.com/analysis/)，根據(jù)上述篩選條件，按照關(guān)鍵基因排名從上至下進(jìn)行生存預(yù)后分析，評估每個關(guān)鍵基因在OV中的預(yù)后意義[18]。根據(jù)基因的表達(dá)中值，將病人樣本分為兩組(高表達(dá)組和低表達(dá)組)進(jìn)行分析，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 從5個數(shù)據(jù)集中篩選出的DEGs

本文從GSE18521數(shù)據(jù)集中篩選出了6 669個DEGs(共有45 118個基因)，從GSE12470數(shù)據(jù)集中篩選出了6 068個DEGs(共有18 819個基因)，從GSE27651數(shù)據(jù)集中篩選出了6 593個DEGs(共有45 118個基因)，以及從GSE14001數(shù)據(jù)集中共篩選出了12 408 個DEGs(共有45 118個基因)，從GSE10971數(shù)據(jù)集中篩選出了5 612個DEGs(共有45 118個基因)，其結(jié)果通過火山圖直觀展示，紅色代表高表達(dá)基因，綠色代表低表達(dá)基因，黑色表示表達(dá)水平差異并不顯著的基因(圖1)。

進(jìn)一步對5個獨立數(shù)據(jù)集進(jìn)行交集分析，找出5個數(shù)據(jù)集的共同DEGs，其中表達(dá)上調(diào)基因94個(logFC>1，P<0.05)，下調(diào)基因為40個(logFC<-1，P<0.05)(圖2)，具體的基因名稱見表1。

圖1 從5個數(shù)據(jù)集中篩選出DEGs

圖2 上調(diào)和下調(diào)基因中的共同DEGs

表1 5個數(shù)據(jù)集中篩選出的共同上調(diào)DEGs和下調(diào)DEGs

2.2 DEGs的GO和KEGG富集分析

在生物過程上，上調(diào)DEGs大多參與RNA代謝過程和其他代謝過程的調(diào)節(jié)，RNA轉(zhuǎn)錄和DNA模板的調(diào)控以及分子功能調(diào)節(jié)，大分子代謝過程和氮化合物代謝過程的調(diào)節(jié)；而下調(diào)DEGs大多參與細(xì)胞過程、細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過程、蛋白質(zhì)修飾過程和蛋白質(zhì)磷酸化過程的調(diào)控(圖3A)。在細(xì)胞成分上，上調(diào)DEGs屬于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器成分、膜結(jié)合細(xì)胞器成分、細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器成分、細(xì)胞質(zhì)成分抑或?qū)儆诩?xì)胞外成分；而下調(diào)DEGs分布于細(xì)胞核、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜上(圖3B)。在分子功能上，上調(diào)DEGs一般具有絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、蛋白質(zhì)二聚活性、內(nèi)肽酶活性、微管蛋白結(jié)合和蛋白質(zhì)均聚活性等；而下調(diào)DEGs一般具有polyA結(jié)合功能和一氧化氮合酶結(jié)合功能(圖3C)。在KEGG信號通路上，上調(diào)DEGs多數(shù)參與細(xì)胞周期及細(xì)胞周期中的有絲分裂過程，細(xì)胞周期檢驗點過程，DNA修復(fù)和M期信號途徑；而下調(diào)DEGs多參與STAT信號通路、黏附斑粘連途徑、Epstein-Barr病毒感染和腫瘤信號途徑等(圖3D)。

A～C為GO分析；D為KEGG分析。

2.3 5個數(shù)據(jù)集的交互分析及關(guān)鍵基因的篩選

為了從系統(tǒng)角度發(fā)現(xiàn)和分析相關(guān)DEGs之間的相互作用，通過String在線數(shù)據(jù)庫分析得到5個數(shù)據(jù)集的134個DEGs之間的PPI交互網(wǎng)絡(luò)(圖4A)。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，存在一些基因能夠與其他基因發(fā)生強(qiáng)的相互作用，而往往這些基因還處于PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵位置，因此被稱為關(guān)鍵基因，它們也被認(rèn)為是疾病發(fā)生的潛在驅(qū)動因子[19]。為找出導(dǎo)致HGSC發(fā)生的關(guān)鍵基因，我們使用Cytoscape軟件插件過濾出69個DEGs，再根據(jù)排名篩選出前12個關(guān)鍵基因，顏色由紅至黃，紅色越深表示關(guān)鍵基因在PPI中具有的作用越大(圖4B)。

圖4 5個數(shù)據(jù)集的交互分析及關(guān)鍵基因的篩選

2.4 關(guān)鍵基因的生存預(yù)后分析

通過Kaplan Meier-plotter網(wǎng)站對篩選出的12個關(guān)鍵基因進(jìn)行生存預(yù)后分析，其中6個基因?qū)GSC預(yù)后有顯著影響，分別為BUB1B(r=1.20，P<0.05)、CENPF(r=1.25，P<0.05)、BIRC5(r=0.87，P<0.05)、UBE2C(r=1.15，P<0.05)、ASPM(r=1.55，P<0.05)、TOP2A(r=1.20，P<0.05)(圖5)。這些上調(diào)基因的高表達(dá)會顯著降低HGSC病人的生存率。

3 討 論

目前認(rèn)為，LGSC由卵巢上皮性包涵體(OEI)至良性囊腺瘤再至SBT連續(xù)發(fā)展而來，而HGSC由輸卵管遠(yuǎn)端發(fā)展而來，即使二者在起源上有相似之處，但目前普遍認(rèn)為，兩種疾病在臨床上具有不同的病理特征，這意味著尋找能鑒別LGSC和HGSC的腫瘤標(biāo)志物極為重要[20]。

有研究表明，50%的HGSC與DNA修復(fù)缺陷有關(guān)[21]。根據(jù)GO和KEGG富集分析，本研究顯示上調(diào)DEGs參與DNA模板的調(diào)控和DNA修復(fù)，這可以作為尋找HGSC靶基因的依據(jù)。之后通過生物信息學(xué)分析找到6個與預(yù)后顯著相關(guān)的基因，這6個基因在HGSC中都表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào)。有研究結(jié)果表明，BUB1B基因的GLEBS結(jié)構(gòu)域?qū)χ委熌z質(zhì)母細(xì)胞瘤有重要作用，并且PTTG3P-FOXM1-BUB1B信號軸上調(diào)成為肺腺瘤的治療靶點[22-23]；CENPF基因相關(guān)級聯(lián)信號軸的失調(diào)促進(jìn)前列腺癌的轉(zhuǎn)移[24]；BIRC5基因的高表達(dá)對淋巴瘤的細(xì)胞活力具有重要作用，使用相關(guān)藥物降低BIRC5在淋巴瘤中的表達(dá)具有潛在靶向治療作用[25];在高風(fēng)險的乳癌病人中，UBE2C基因高表達(dá)者具有不良預(yù)后[26]；ASPM基因可作為肝細(xì)胞癌血管侵襲、早期復(fù)發(fā)和預(yù)后不良的新型標(biāo)記物[27]；在早期乳癌病人中檢測到TOP2A基因表達(dá)異常[28]。目前研究發(fā)現(xiàn)BUB1B基因在高級別腫瘤疾病中的表達(dá)較高，并與長期預(yù)后有關(guān)[29]，這與本研究生物信息學(xué)分析的結(jié)果一致。雖然上述基因在卵巢癌中的研究甚少，但是根據(jù)它們在其他腫瘤中的研究，我們猜測這些基因處于腫瘤信號通路的某個關(guān)鍵節(jié)點上，影響機(jī)體的正常生理功能，從而引起腫瘤的發(fā)生。

綜上所述，本研究通過對5個數(shù)據(jù)集進(jìn)行生物信息學(xué)分析，挖掘出了與HGSC有關(guān)的DEGs共134個，其中與HGSC預(yù)后顯著相關(guān)的基因6個，這6個基因可能對HGSC的臨床治療及預(yù)后判斷具有潛在的指導(dǎo)價值，并為后續(xù)的實驗研究提供新的思路。但是，對于本研究篩選出的這些基因是否能夠有效鑒別LGSC和HGSC，還需要在今后的研究中進(jìn)一步探討。