蟾毒靈對低氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷保護作用及機制

(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科,河南 開封 475000)

急性心肌梗死是冠狀動脈持續(xù)性缺血低氧引起的心肌壞死，當(dāng)冠狀動脈血運重建時可能誘發(fā)缺血/再灌注損傷[1-2]。如何減少缺血/再灌注造成的心肌細(xì)胞損傷一直以來是心血管疾病臨床和基礎(chǔ)研究的重點。蟾毒靈是一種從傳統(tǒng)中藥蟾酥中提取的中藥單體，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、強心、抗腫瘤等多種臨床功效[3-4]。有研究顯示，蟾酥能夠改善缺血心肌細(xì)胞的能量代謝，在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性地抑制大鼠心肌細(xì)胞收縮，減輕心肌損傷，對心肌具有保護作用[5-6]。然而，蟾毒靈在心肌缺血/再灌注損傷中是否發(fā)揮作用的研究鮮有報道。因此，本實驗通過體外構(gòu)建低氧/復(fù)氧(H/R)心肌細(xì)胞損傷模型，觀察蟾毒靈對H/R損傷心肌細(xì)胞的影響及機制，為利用蟾毒靈防治心肌H/R損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大鼠心肌細(xì)胞株H9c2購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞資源中心；蟾毒靈(純度≥98%)購自煙臺靶點藥物研究有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒購自北京曠博生物技術(shù)有限公司；活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司；Western blot檢測所需試劑均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3和9(Cleaved Caspase-3，Cleaved Caspase-9)抗體購自美國Santa Cruz公司；β-actin抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自美國CST公司。

1.2 實驗方法

1.2.1H/R心肌細(xì)胞模型的構(gòu)建 在含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)心肌細(xì)胞H9c2，放置在體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、0.95空氣、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參照文獻(xiàn)方法構(gòu)建H/R心肌細(xì)胞模型[7]，待心肌細(xì)胞生長達(dá)60%左右融合時，除去舊培養(yǎng)液，加入不含血清的新鮮DMEM培養(yǎng)液，將心肌細(xì)胞放置在體積分?jǐn)?shù)0.95 N2和0.05 CO2培養(yǎng)箱中低氧處理12 h，取出細(xì)胞，棄去舊培養(yǎng)液，更換成含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，再將細(xì)胞放置在體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、0.95空氣的培養(yǎng)箱中復(fù)氧處理4 h。

1.2.2實驗分組 心肌細(xì)胞接種到6孔板中，將細(xì)胞隨機分為5組：空白對照組(A組)，未經(jīng)任何處理正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞；H/R組(B組)，按照上述1.2.1方法對心肌細(xì)胞進行H/R處理；低濃度蟾毒靈組(C組)，以0.1 μmol/L蟾毒靈預(yù)處理心肌細(xì)胞12 h再行H/R處理；中濃度蟾毒靈組(D組)，以1.0 μmol/L蟾毒靈預(yù)處理心肌細(xì)胞12 h再行H/R處理；高濃度蟾毒靈組(E組)，以10.0 μmol/L蟾毒靈預(yù)處理心肌細(xì)胞12 h再行H/R處理。蟾毒靈處理濃度選擇依據(jù)文獻(xiàn)報道及前期預(yù)實驗結(jié)果[8]。

1.2.3CCK-8檢測心肌細(xì)胞活力 將心肌細(xì)胞以每孔1×103個接種于96孔板中，置37 ℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)48 h，按照上述1.2.2方法分組處理心肌細(xì)胞，分別向每孔細(xì)胞中添加10 μL CCK-8試劑和100 μL無血清培養(yǎng)液，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h，采用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處各孔心肌細(xì)胞光密度值(OD值)。計算各組心肌細(xì)胞活力(%)=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.4酶標(biāo)法檢測細(xì)胞內(nèi)SOD和MDA含量 各組心肌細(xì)胞處理后，棄去培養(yǎng)液分別收集細(xì)胞，使用磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞，通過超聲破碎儀破碎細(xì)胞，以3 500 r/min低溫離心10 min，收集上清，分別按照試劑盒說明書進行處理。采用多功能酶標(biāo)儀測定各組心肌細(xì)胞內(nèi)SOD和MDA含量。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測各組心肌細(xì)胞凋亡率 各處理組心肌細(xì)胞以胰蛋白酶消化后，離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞。按照Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒使用說明書進行操作，加入1×Binding buffer重懸細(xì)胞100 μL，再向細(xì)胞懸液中加入Annexin Ⅴ-FITC和PI各5 μL，輕輕混勻，室溫下避光孵育15 min。使用流式細(xì)胞儀測定各組心肌細(xì)胞凋亡率。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS水平 將熒光探針DCFH-DA以不含血清的培養(yǎng)液稀釋。各處理組心肌細(xì)胞除去培養(yǎng)液，分別加入稀釋的DCFH-DA，置37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min，用不含血清的培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，除去DCFH-DA。收集各組細(xì)胞上流式細(xì)胞儀使用488 nm激發(fā)波長和525 nm發(fā)射波長檢測熒光強度。

1.2.7Western blot檢測各組心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達(dá)水平 分別收集各組處理后的心肌細(xì)胞，向細(xì)胞中加入RIPA裂解液，冰上提取總蛋白。以BCA蛋白濃度測定試劑盒對提取蛋白進行定量，調(diào)整蛋白濃度，取等量蛋白加入到各上樣孔中，采用SDS-PAGE凝膠進行電泳，電泳結(jié)束后將各組蛋白采用半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放置于50 g/L脫脂奶粉封閉液中孵育2 h，取出膜使用TBST洗滌3次，每次10 min，再加入稀釋的相應(yīng)一抗，Cleaved Caspase-3和-9一抗均為1∶800稀釋，4 ℃過夜孵育。以TBST洗滌3次，每次10 min，再加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。以TBST洗滌3次，每次10 min，在暗室中加入ECL化學(xué)發(fā)光液進行顯影，曝光，采用凝膠成像儀拍照。以β-actin為內(nèi)參照，采用Quantity One圖像分析軟件統(tǒng)計各組心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組心肌細(xì)胞活力比較

CCK-8檢測結(jié)果顯示，A～E組心肌細(xì)胞活力分別為(100.00±5.01)%、(39.84±2.12)%、(49.28±3.44)%、(64.71±4.81)%和(87.01±4.69)%。與A組比較，B組心肌細(xì)胞活力顯著下降(F=330.050，q=43.377，P<0.05)；與B組相比較，C、D、E組心肌細(xì)胞活力有不同程度的升高(q=6.804～34.011，P<0.05)。提示隨蟾毒靈濃度的增加心肌細(xì)胞活力逐漸升高。

2.2 各組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平、SOD和MDA含量比較

酶標(biāo)法和流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與A組比較，B組心肌細(xì)胞內(nèi)SOD含量降低(F=129.978，q=28.673，P<0.05)，ROS水平和MDA含量升高(F=171.502、178.726，q=33.623、31.443，P<0.05)；與B組比較，C、D、E組心肌細(xì)胞內(nèi)SOD含量隨藥物濃度的增加而增加(q=4.144～17.689，P<0.05)，ROS水平和MDA含量隨藥物濃度的增加而降低(q=7.893～27.065，P<0.05)。見圖1。

①流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS水平；②酶標(biāo)法檢測SOD含量；③酶標(biāo)法檢測MDA含量。與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05；與D組比較，dP<0.05。

2.3 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，A～E組心肌細(xì)胞凋亡率分別為(3.81±0.66)%、(35.69±5.35)%、(27.04±3.29)%、(18.48±2.84)%和(9.26±1.15)%。與A組比較，B組心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高(F=152.747，q=30.467，P<0.05)；與B組比較，C、D、E組心肌細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度的增加逐漸降低(q=8.267～25.259，P<0.05)。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組心肌細(xì)胞凋亡率

2.4 各組心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達(dá)水平比較

Western blot檢測結(jié)果顯示，與A組比較，B組心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)(F=211.749、217.378，q=32.577、37.566，P<0.05)；與B組比較，C、D、E組心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達(dá)水平隨藥物濃度的增加逐漸下調(diào)(q=6.831～25.469，P<0.05)。見圖3。

①Western blot檢測各組心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達(dá)水平；②各組心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達(dá)水平比較。與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05；與D組比較，dP<0.05。

3 討 論

急性心肌梗死是常見的心血管疾病，美國每年約有150萬人發(fā)病[9]。近年來，我國急性心肌梗死的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，嚴(yán)重危害著人類的健康和生命[10]。臨床上常通過血運重建的方式縮小梗死面積，挽救心肌，但血運重建會導(dǎo)致缺血/再灌注損傷的發(fā)生。目前關(guān)于心肌缺血/再灌注損傷的發(fā)生機制尚未徹底闡明，認(rèn)為可能與氧自由基的作用、細(xì)胞凋亡過程紊亂、細(xì)胞內(nèi)鈣超載和白細(xì)胞的激活等相關(guān)[11-14]。研究證實，細(xì)胞凋亡過程的紊亂是病理性的，而且與Caspase基因有關(guān)[15]。在目前用于心肌缺血/再灌注損傷的新型治療劑中，各種天然植物化學(xué)物質(zhì)可通過各種途徑對心肌損傷起保護作用[16-17]。研究已證實，蟾酥提取物對心力衰竭、缺血性心肌病和高血壓等心血管疾病的治療具有重要作用[18-20]。作為蟾酥中的有效化學(xué)物質(zhì)，蟾毒靈具有多種生物活性。本實驗通過建立H/R心肌細(xì)胞損傷模型，探究蟾毒靈對心肌細(xì)胞損傷的影響及機制。

在預(yù)實驗中依據(jù)文獻(xiàn)報道篩選蟾毒靈的作用濃度[8]，研究結(jié)果顯示，當(dāng)蟾毒靈濃度≤10.0 μmol/L時，能夠促進心肌細(xì)胞增殖活性；當(dāng)蟾毒靈濃度>30.0 μmol/L時，則抑制心肌細(xì)胞增殖活性。因此，本實驗根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果選擇0.1、1.0、10.0 μmol/L為實驗加藥濃度。本文結(jié)果表明，H/R損傷顯著降低了心肌細(xì)胞的活力，而蟾毒靈明顯逆轉(zhuǎn)了H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低。越來越多的研究結(jié)果已經(jīng)證實，氧化應(yīng)激在心肌缺血/再灌注損傷中起關(guān)鍵作用[21-23]。心肌細(xì)胞中的氧化劑和抗氧化劑失衡有利于ROS積累，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，引起氧化應(yīng)激[24]。已證明，在心肌缺血/再灌注損傷期間ROS水平增加，內(nèi)源性自由基清除酶如SOD活性降低[25-27]。眾所周知，活性醛如MDA是氧化應(yīng)激最常見的產(chǎn)物和毒性標(biāo)志物之一。心肌缺血/再灌注損傷促進氧化應(yīng)激，引起活性醛積累，導(dǎo)致心臟損傷[28]。因此，通過檢測心肌細(xì)胞中ROS水平、SOD活性以及MDA含量能夠顯示心肌細(xì)胞的氧化損傷程度。本實驗酶標(biāo)法檢測結(jié)果顯示，蟾毒靈處理的心肌細(xì)胞內(nèi)SOD活性增加，ROS和MDA含量減少，且具有濃度依賴關(guān)系。這些結(jié)果提示，蟾毒靈對H/R條件下心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護作用。

心肌細(xì)胞凋亡過程的紊亂被認(rèn)為是心肌缺血/再灌注損傷的主要病理生理機制之一，并且被認(rèn)為是導(dǎo)致心肌缺血/再灌注損傷后細(xì)胞死亡的重要原因[29]。本研究流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，蟾毒靈處理組的心肌細(xì)胞凋亡率明顯低于H/R處理組，且隨著蟾毒靈濃度的升高，心肌細(xì)胞凋亡率逐漸降低，表明蟾毒靈能夠呈濃度依賴性地抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。此外，本文Western blot檢測顯示，蟾毒靈處理組心肌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和-9蛋白表達(dá)水平明顯低于H/R處理組。Caspase-3和-9作為半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶家族成員，在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。特定位點的切割將激活Caspase-3和-9并促進細(xì)胞凋亡[30]。本文結(jié)果提示，蟾毒靈可能通過下調(diào)Cleaved Caspase-3和-9的蛋白表達(dá)抑制心肌細(xì)胞凋亡，對H/R心肌細(xì)胞損傷起保護作用。

總之，本研究的結(jié)果揭示了蟾毒靈對H/R損傷心肌細(xì)胞具有保護作用，其作用機制與降低氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡有關(guān)。初步證實蟾毒靈的心肌保護作用和潛在機制，這些結(jié)果為體內(nèi)作用進一步評估提供了證據(jù)，這可能有助于開發(fā)新的治療急性心肌梗死的方法。本實驗初步探究蟾毒靈是否對H/R心肌細(xì)胞起保護作用，其作用效果在何種水平尚未可知，后期實驗將設(shè)置已知有效藥物的陽性對照組，以更深入明確其作用的分子機制。此外，為更充分了解蟾毒靈作用，需增加H/R后蟾毒靈不同濃度和不同時間點對細(xì)胞作用，闡述蟾毒靈是否在發(fā)病后有一定的抑制氧化、凋亡和促進修復(fù)的作用。