陳蓉芬，黃堅欽，陳 榮，徐川梅

（浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300）

流式細胞術(shù)是指利用流式細胞儀對懸浮細胞或微粒等進行分析的現(xiàn)代分析技術(shù)，該技術(shù)可對一些特異的細胞和染色體等進行分析和分選，還可對動植物基因組大小及倍性水平等進行測定和分析[1?3]。在分析植物基因組大小過程中，與傳統(tǒng)的福爾根染色技術(shù)相比，流式細胞術(shù)具有速度快、準確性高等優(yōu)點。因此，目前流式細胞術(shù)在植物基因組大小研究中發(fā)揮了重要的作用，約265種菊科Asteraceae植物、157種莎草科Cyperaceae植物及191種毛茛屬Ranunculus植物的基因組大小已通過流式細胞儀被測定[2,4?7]，大量植物的C值(指單倍體細胞核的DNA含量)數(shù)據(jù)庫已建立[8]?；蚪M大小信息可為植物系統(tǒng)分類、基因組測序及重測序等研究提供參考，因此，提高植物基因組大小測量精度至關(guān)重要[9?10]。竹類植物是重要的森林資源，全世界約119屬1 482種，在中國分布的約37屬500余種，變種變型100余種[11?13]。在竹類植物基因組學(xué)研究中，目前僅有毛竹Phyllostachysedulis、莪莉竹Olyra latifolia、蕓香竹Raddia guianensis及瓜多竹Guadua angustifolia等竹種完成了全基因組測序工作，在整個竹類植物中所占比例還不足0.2%[10,14?15]。另外，在竹類植物基因組大小研究中，目前約200個竹種的基因組大小通過流式細胞儀被測定，但由于不同研究者所用實驗內(nèi)參、儀器類型及實驗方法不同，部分竹種在測量結(jié)果間存在一定差異[16?19]。流式樣品制作主要分為細胞核提取和染色2個步驟，因不同植物細胞內(nèi)含物及代謝物成分不同，所用細胞核提取液在組成上存在較大差異。研究者們往往會重點關(guān)注細胞核提取液，而忽略染色時間對實驗結(jié)果的影響。因此，為了進一步提高竹類植物基因組大小測定結(jié)果的精度，本研究分析了樣品采集部位及染色時間對竹類植物基因組大小測定結(jié)果的影響，并在此基礎(chǔ)上揭示了12個竹種的基因組大小，以期為竹類植物系統(tǒng)分類及基因組測序等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以已測序的水稻Oryza sativa為參照。12個竹種清單及采樣信息見表1。流式細胞儀分析的植物材料要求是新鮮幼嫩的組織部位，不能進行冷凍和干燥等處理。竹類植物葉片和筍均可滿足實驗要求，而且方便采集，特別是竹筍更適合長時間保存。唐竹Sinobambusa tootsik、茶竿竹Pseudosasa amabilisvar.amabilis、孝順竹Bambusa multiplex及黃皮剛竹Phyllostachys sulphurea等4個竹種同時以葉片和筍為材料，花葉唐竹Sinobambusa tootisikf.albo-striata、黃皮綠筋竹Phyllostachys sulphurea、平安竹Pseudosasa japonicavar.tsutsumiana、柳葉細竹Thyrsostachy ssiamensis、花葉赤竹Sasaella glabraf.albo-striata、美麗箬竹Indocalamus decorus、曙筋矢竹Pseudosasa japonicaf.akebono及紅稈寒竹Chimonobambusa mamoreaf.variegata等8個竹種主要是從國內(nèi)外一些竹種園收集而來。這些竹種數(shù)量有限，目前尚無筍，因此，這8個竹種均以葉片為材料。

表1 12 個竹種的采樣信息Table 1 Description of the geographical distribution of 12 bamboo species

1.2 方法

1.2.1 流式細胞儀樣品制備 對于竹類植物葉片樣品，選取頂端尚未展開的心葉或緊鄰心葉已完全展開的嫩葉；對于竹筍樣品，選擇新鮮無病蟲害的嫩筍，實驗過程中剝?nèi)スS殼。用雙面刀片切取一段面積約1 cm2或厚度約1.0 mm的葉片，面積約0.25 cm2的嫩筍置于干凈的培養(yǎng)皿中，然后向培養(yǎng)皿中加入500 μL細胞核提取液(cystain UV precise P Nuclei Extraction Buffer，PARTEC，編號5003)潤濕樣品，用鋒利的雙面刀片迅速將樣品剁碎，將培養(yǎng)皿傾斜靜置1～2 min，使細胞核提取充分，之后向培養(yǎng)皿中加入2 mL DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)染色液(cystain UV precise P stain Buffer，PARTEC，編號5003)對細胞核進行染色，然后用30目的濾頭將樣品過濾到進樣管中，準備上機測樣。

1.2.2 流式細胞儀樣品測定 根據(jù)前期多次預(yù)實驗結(jié)果，設(shè)置樣品染色時間為1、3、5、7、9、12、18、24和30 min共9個梯度，利用流式細胞儀(Partec CyFlow ploidy Analyser)對樣品進行測定。為了確保測量結(jié)果的準確性，每次實驗先以水稻為參照，分析已測序毛竹的基因組大小，在此基礎(chǔ)上再對其他竹種基因組大小進行測量和分析。為了減少誤差，每個竹種設(shè)置3個不同重復(fù)，變異系數(shù)控制在5%以內(nèi)。

1.2.3 不同竹種的DNA含量分析 登錄C值數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://www.rbgkew.org.uk/cval/homepage.html)，查出水稻二倍體基因組對應(yīng)的DNA含量2C為1.0 pg，并推算待測竹種的2C值：待測竹種2C值 (pg)=(待測竹種峰值/水稻峰值)×水稻2C值(1.0 pg)，水稻單倍體基因組大小為466 Mb[20]。據(jù)此可以推算出相應(yīng)竹種基因組對應(yīng)的堿基數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹類植物葉片和筍基因組大小測量結(jié)果分析

利用流式細胞儀測定植物基因組大小過程中，樣品峰形狀是判斷實驗結(jié)果是否可靠的重要依據(jù)。樣品處理過程中細胞核提取質(zhì)量越好，相應(yīng)的細胞碎片及雜質(zhì)越少，雜峰就會越少，樣品峰往往表現(xiàn)得尖而細，測量誤差也較小，實驗結(jié)果較為可靠；反之，樣品處理過程中產(chǎn)生的細胞碎片越多，對應(yīng)的雜峰也會隨之增多，進而影響甚至改變樣品峰形狀，實驗結(jié)果往往不可靠。從圖1可以看出：孝順竹、唐竹、茶竿竹及黃皮剛竹等4個竹種葉片和筍所呈現(xiàn)的峰在形狀上均尖而細，碎片背景也非常少。另外，同一竹種的葉片和筍對應(yīng)的峰形和峰值也十分相似，如孝順竹的葉片和筍均表現(xiàn)出雙峰，其中左側(cè)較高的峰為2C細胞所對應(yīng)的峰，右側(cè)較低的峰為4C細胞所對應(yīng)的峰，且相同類型細胞對應(yīng)的熒光強度值也幾乎一致(圖1A1～A2)。除此之外，唐竹、茶竿竹和黃皮剛竹等3個竹種與孝順竹情況相似，葉片和筍的測量結(jié)果也十分接近 (圖1B1～B2，圖1C1～C2，圖1D1～D2)。

圖1 部分竹種葉片和筍的流式峰形圖Figure 1 Flow cytometer peak value of some bamboo leaves and shoots

理論上，熒光強度值達到最大，說明此時細胞核染色最充分，獲得的基因組大小與其真實值也最接近。為了更科學(xué)地對竹類植物葉片和筍對應(yīng)的基因組大小進行比較分析，分別以黃皮剛竹、茶竿竹、孝順竹及唐竹4個竹種葉片和筍的最大熒光強度值為依據(jù)，計算出4個竹種葉片和筍對應(yīng)的基因組大小。結(jié)果表明：4個竹種葉片和筍對應(yīng)的基因組大小并非完全吻合，唐竹、茶竿竹、孝順竹及黃皮剛竹葉片對應(yīng)的 2C值分別為 (5.03±2.33)、(4.82±0.54)、(2.64±0.50)和 (3.76±1.51) pg，而筍對應(yīng)的 2C值分別為(4.99±1.56)、(5.02±1.99)、(2.72±0.59)和 (3.86±2.31)pg，其中茶竿竹、孝順竹及黃皮剛竹葉片2C值略小于筍對應(yīng)的2C值，差值分別為0.20、0.10和0.08 pg，而唐竹葉片2C值比其筍略大0.04 pg(表2)。雖然4個竹種葉片和筍所獲基因組大小并不完全吻合，但是差值非常小，在誤差允許范圍內(nèi)。因此，對竹類植物而言其葉片和筍均可作為其基因組大小研究的材料。

表2 4 個不同竹種葉片和筍的基因組大小Table 2 Genome size of leaves and shoots from 4 bamboo species

2.2 染色時間對竹類植物基因組大小測定結(jié)果的影響

表3表明：12個竹種在一定時間內(nèi)達到最大熒光強度值后，隨著染色時間延長，熒光強度值均有不同程度的減少，當染色時間延長到30 min時，大部分竹種的熒光強度值基本減少到最小。首先，同一竹種的葉片和筍的染色時長及熒光強度變化也不完全相同。以唐竹為例，葉片染色1 min熒光強度即達到最大，之后隨著染色時間延長，熒光強度值不斷減少，當染色時間延長到30 min時，熒光強度值減少到最小，約減少6.23%，而唐竹筍最大熒光強度則出現(xiàn)在3 min，之后隨著染色時間延長，熒光強度不斷減少，染色30 min時，其熒光強度減少到119.75±1.40，約減少2.67%(表3和表4)。其次，12個竹種熒光強度在0～30 min也存在較大變化，變異范圍為2.67%～12.93%，除唐竹筍、茶竿竹葉和筍、孝順竹葉及柳葉細竹葉等熒光強度變化小于5%外，其余竹種熒光強度變化值均大于5%，有些竹種熒光強度變化值甚至超過10%，如孝順竹筍、平安竹葉、花葉赤竹葉及美麗箬竹葉等，熒光強度變化值分別為11.02%、12.93%、12.88%及12.33%等(表4)。表明細胞核染色時間對竹類植物基因組大小測定結(jié)果存在一定影響。

另外，不同竹種甚至同一竹種不同組織部位對染色時間反應(yīng)也不完全相同。以葉片材料為例，唐竹、花葉唐竹、平安竹、曙筋矢竹、美麗箬竹、花葉赤竹及紅稈寒竹染色1 min即達到最大熒光強度，染色時間延長到3 min時，熒光強度略有衰減，但減少不明顯(表3)；孝順竹和黃皮綠筋竹最大熒光強度出現(xiàn)在3 min，但與1、5 min對應(yīng)的熒光強度相差不明顯(表3)；茶竿竹和柳葉細竹最大熒光強度出現(xiàn)在5 min，其中茶竿竹最大熒光強度與其3 min時的熒光強度最接近，而柳葉細竹最大熒光強度與其7 min時的熒光強度最接近，只有黃皮剛竹最大熒光強度出現(xiàn)在7 min，但與5、9 min對應(yīng)的峰值十分接近(表3)。以筍為材料時，熒光強度隨染色體時間變化情況與葉片相似，其中孝順竹的筍最大熒光強度出現(xiàn)在1 min，唐竹和黃皮剛竹2個竹種筍的最大熒光強度出現(xiàn)在3 min，茶竿竹最大熒光強度出現(xiàn)在5 min (表3)。唐竹、茶竿竹、孝順竹和黃皮剛竹4個竹種同時以葉片和筍為材料，但是葉片和筍對應(yīng)的熒光曲線圖也不完全相同，例如黃皮剛竹筍的最大熒光強度出現(xiàn)在3 min，葉片最大熒光強度卻出現(xiàn)在7 min (表3)。綜上所述，無論是葉片還是竹筍，當染色時間延長到3 min時，75%的竹種已達到最大熒光強度值，延長到5 min時，已有91.67%的竹種達到最大熒光強度值。因此，為確保竹類植物基因組大小測定結(jié)果的準確性，竹類植物染色時間最好控制在7 min以內(nèi)，以3～5 min最佳。

表3 12 個竹種不同染色時間下對應(yīng)的熒光峰值Table 3 Mean value under different dyeing time of 12 bamboo species

表4 12 個竹種熒光強度變化Table 4 Fluorescence intensity change of 12 bamboos

2.3 12 個不同屬種竹種的基因組大小分析

表5表明：孝順竹和柳葉細竹對應(yīng)的基因組大小分別為(2.64±0.54)和(2.69±1.01) pg，明顯小于其他10個竹種；其次為剛竹屬Phyllostachys的黃皮剛竹和黃皮綠筋竹，對應(yīng)的2C值分別為(3.76±1.51)和(3.91±0.95) pg，明顯小于其他一些竹屬的竹種；再次為唐竹屬Sinobambusa的唐竹和花葉唐竹，對應(yīng)的基因組大小分別為(5.03±2.33)和(5.13±1.96) pg。赤竹屬Sasaella的花葉赤竹、箬竹屬Indocalamus的美麗箬竹及寒竹屬Chimonobambusa的紅稈寒竹3個竹種基因組大小比較相近，對應(yīng)的基因組大小分別為(5.36±1.58)、(5.39±1.14)和(5.38±0.97) pg。茶竿竹、平安竹和曙筋矢竹在分類上雖然為同一屬，但彼此間差異較大，這3個竹種的基因組大小分別為(4.82±0.54)、(5.44±0.93)和(5.73±1.85) pg。

表5 12 個不同竹種的基因組大小Table 5 Genome size of 12 different bamboo species

3 討論

KUMAR等[18]研究表明：分布在新加坡的孝順竹基因組大小為(3.11±0.02) pg，而ZHOU等[19]研究表明：分布在中國的孝順竹基因組大小為(2.78±0.02) pg。本研究中孝順竹葉片和筍對應(yīng)的基因組大小分別為(2.64±0.54)和(2.72±0.59) pg，與ZHOU等[19]研究結(jié)果較為接近，與KUMAR等[18]研究結(jié)果存在一定差異。流式細胞儀測定植物基因組大小過程中，細胞核提取液種類、染色液濃度、染色液類型及染色時間等均會對基因組大小測定結(jié)果產(chǎn)生一定影響[21?23]。KUMAR等[18]以煙草Nicotiana tabacum為對照，采用碘化丙啶(PI)熒光染料對細胞核進行染色，為了去除煙草等植物細胞中一些特殊的內(nèi)含物，細胞核提取液中加入了一定量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果PVP濃度過大，在一定程度上會影響細胞核與熒光染料的結(jié)合，進而影響細胞核染色效果[24]。本研究與ZHOU等[19]的實驗方法相似，均以水稻為對照，用DAPI對細胞核進行染色，這可能是本研究結(jié)果與ZHOU等[19]較為接近而與KUMAR等[18]有差異的主要原因。另外，本研究中紅稈寒竹和茶竿竹對應(yīng)的基因組大小分別為(5.38±0.97)和(4.82±0.54)pg，比ZHOU等[19]研究的2個竹種的基因組略大。這種差異可能是由于染色時間不同而造成的。本研究表明：染色時間對竹類植物基因組大小測定結(jié)果存在一定影響，且不同竹種對染色時間要求并不完全相同，大部分竹種的細胞核可以被快速染色，如紅稈寒竹、美麗箬竹及曙筋矢竹等1 min即可達到最大熒光值；還有少量竹種染色較慢，如茶竿竹和黃皮剛竹等需5～7 min才可達到最大熒光值。ZHOU等[19]對竹類植物基因組大小進行分析過程中，所有竹種均采用相同的染色時間，這可能是造成這種差異的主要原因。

利用流式細胞儀分析植物基因組大小過程時，一般需要選擇基因組大小已知的物種做對照，然后根據(jù)流式細胞儀測量結(jié)果對待測物種基因組大小進行估算[24?25]。對照物種選擇一般需遵循以下幾個原則：①對照物種已測序，且基因組大小與待測物種基因組大小間存在顯著差異，以便區(qū)分對照峰和樣品峰；②對照樣品與待測樣具有一定的生物學(xué)相似性；③對照材料方便采集且易大量獲取。目前，雖然毛竹、莪莉竹、蕓香竹及瓜多竹等已完成測序[10,14?15]，但其中大部分竹種主要分布在南方熱帶地區(qū)，這些竹種在經(jīng)過長時間、長距離運輸后，部分材料萎蔫或者細胞核結(jié)構(gòu)改變已達不到實驗要求。為了檢測不同對照對竹類植物基因組大小測定結(jié)果是否存在影響，本研究嘗試同時利用水稻和毛竹為參照，對孝順竹、柳葉竹、黃皮剛竹、黃皮綠筋竹、唐竹及曙筋矢竹等竹種基因組大小進行比較分析，表明2種參照所獲基因組大小十分接近，但由于毛竹基因組大小與待測竹種黃皮剛竹、黃皮綠筋竹、茶竿竹及唐竹等竹種的基因組相差較小，因此測量過程中對照毛竹的峰和待測竹種的峰間存在較大區(qū)域的重疊和干擾。水稻與竹類植物同屬禾本科Poaceae，其種子通過催芽2～3周即可獲得大量嫩苗，另外水稻與竹類植物基因組大小相差約3～6倍，測量過程中對照峰和樣品峰區(qū)分非常明顯，彼此間干擾較少。因此，對竹類植物而言水稻是非常理想的參照物。

竹類植物主要分為草本竹種和木本竹種2個基本類型。根據(jù)分布區(qū)域，木本竹種又分為溫帶木本竹種和熱帶木本竹種2個類型[11，26]。溫帶木本竹種染色體數(shù)目比較穩(wěn)定，基本上為2n=48(2n代表體細胞染色體數(shù)，即是單倍體的2倍)，熱帶木本竹種染色體數(shù)目表現(xiàn)比較復(fù)雜，主要有2n=64，2n=70±2，2n=96，2n=104等多種類型[19,27?29]。本研究所分析的12個木本竹種中，孝順竹和柳葉細竹為熱帶木本竹種，黃皮剛竹、黃皮綠筋竹、唐竹、花葉唐竹、茶竿竹、平安竹、曙筋矢竹、花葉赤竹、美麗箬竹及紅稈寒竹均為溫帶木本竹種。本研究表明：12個木本竹種基因組大小與染色體數(shù)目并不呈正相關(guān)，雖然孝順竹和柳葉細竹2個竹種染色體數(shù)目多于另外10個溫帶木本竹種，但基因組大小卻明顯小于溫帶木本竹種，這與一些溫帶竹種和熱帶竹種研究的情況類似[16,18?19,25]。部分竹種測序結(jié)果表明：竹類植物是異源多倍體植物，基因組主要分為A、B、C和D等4個不同的亞基因組，長期進化過程中C基因組竹種分別與B和D基因組竹種雜交形成染色體組類型分別為BBCC和CCDD的異源四倍體竹種(2n=48)，之后A基因組竹種又與基因組類型為BBCC的異源四倍體竹種雜交形成染色體組類型為AABBCC的異源六倍體竹種(2n=72)[14]。本研究中：黃皮剛竹、黃皮綠筋竹、唐竹、花葉唐竹、茶竿竹、平安竹、曙筋矢竹、花葉赤竹、美麗箬竹及紅稈寒竹等溫帶竹種雖然染色體數(shù)目相同，但基因組大小卻存在較大差異，2C值為3.76～5.73 pg，相差近1.52倍。這些竹種中，剛竹屬的黃皮剛竹和黃皮綠筋竹對應(yīng)的基因組大小分別為(3.76±1.51)和(3.91±0.95) pg，明顯小于其他竹屬中的一些竹種。另外，唐竹屬、矢竹屬、赤竹屬、箬竹屬及寒竹屬中的一些竹種在基因組大小上差異不大，特別是花葉刺竹、美麗箬竹及紅稈寒竹3個竹種基因組大小十分接近。因此，根據(jù)12個不同竹種的基因組大小測定結(jié)果推測，赤竹屬、箬竹屬及寒竹屬等屬竹種在染色體組組成類型上可能相同或相近，與剛竹屬竹種在染色體組類型上存在較大差異。