馬延琴，徐曉裕，李 甜，李春燕，蔣 霞，王 斌，史學(xué)偉*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

葡萄表皮具有非常豐富的微生物資源，包括酵母、霉菌和細(xì)菌[1]。葡萄表皮的酵母包括參與酒精發(fā)酵的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和對葡萄酒風(fēng)味具有重要貢獻(xiàn)的非釀酒酵母（non-Saccharomyces cerevisiae），受葡萄園氣候、環(huán)境和葡萄品種影響較大，表現(xiàn)出明顯的地域特色[2]。非釀酒酵母在葡萄酒發(fā)酵過程中分泌各種胞外酶（如β-葡萄糖苷酶、蛋白酶和脂肪酶），將葡萄汁中的糖分、含氮化合物和含硫化物轉(zhuǎn)化為風(fēng)味物質(zhì)，賦予葡萄豐富的水果香和花香類香氣[3-5]。

在釀造過程中，葡萄酒酒體香氣因葡萄酒揮發(fā)性成分、含量及平衡關(guān)系變化而發(fā)生改變[6]。葡萄中的揮發(fā)性物質(zhì)大多以結(jié)合態(tài)的形式存在，非釀酒酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的各種酶類可以降解大分子化合物，將結(jié)合態(tài)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)釋放出來，提高葡萄酒香氣的復(fù)雜性[7]。β-葡萄糖苷酶通過酶促水解移除相應(yīng)的糖配基進(jìn)而斷裂糖苷鍵后釋放揮發(fā)性香氣成分[8]。蛋白酶將蛋白質(zhì)降解為氨基酸，為葡萄酒酸類和醇類等香氣物質(zhì)的形成提供重要的前體[9]。脂肪酶能夠逐漸將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸，進(jìn)而產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)[10]。

非釀酒酵母在葡萄酒發(fā)酵過程中對葡萄酒風(fēng)味形成具有重要作用，然而能用于改善葡萄酒風(fēng)味的非釀酒酵母制劑很少。本研究以新疆釀酒葡萄為原料，分離和鑒定產(chǎn)酶非釀酒酵母，并對非釀酒酵母的酶學(xué)特性進(jìn)行分析，為產(chǎn)酶非釀酒酵母在葡萄酒發(fā)酵中的應(yīng)用提供理論依據(jù)，為后續(xù)葡萄酒增香及開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

赤霞珠葡萄：采摘于新疆瑪納斯葡萄園區(qū)，利用五點(diǎn)取樣法在不同種植區(qū)域中采取不同品種的葡萄樣品。采集過程中，將采集樣品放入無菌自封袋中貼上標(biāo)簽。葡萄樣品保存在4 ℃條件下，并于24 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

坎迪達(dá)尼克森選擇性瓊脂（bismuth sulfite glucose glycine yeast agar，BIGGY）：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基[11]：葡萄糖20 g/L，酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

酵母膏胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）瓊脂培養(yǎng)基[12]：葡萄糖20 g/L，酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

β-葡萄糖苷酶培養(yǎng)基[13]：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，NH4NO33 g/L，KH2PO44 g/L，自然pH值，121 ℃滅菌20 min，溫度為60～70 ℃時(shí)加入對硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（p-nitrobenzene-β-D-galactopyranoside，p-NPG）1 g/L。

蛋白酶篩選培養(yǎng)基[14]：葡萄糖20 g/L，酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂20 g/L，脫脂乳粉20 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

脂肪酶篩選培養(yǎng)基[15]：葡萄糖20 g/L，酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂20 g/L，甘油三丁酸酯10 mL/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京博邁生物科技有限公司；2×Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、Ladder Marker、DNA擴(kuò)增引物：上海生工生物技術(shù)有限公司。所有試劑為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼電熱蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠制造；CX21FS1光學(xué)顯微鏡：日本Olympus公司；DYY-8CLHP電泳儀：北京六一生物科技有限公司；GelDOCXR凝膠成像系統(tǒng)：美國BioRad公司；B250恒溫水浴鍋：上海予卓儀器有限公司；X7酶標(biāo)儀：美國伯騰儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 釀酒葡萄表皮微生物的分離和純化

將去梗后并保持完整的葡萄樣品放入無菌三角瓶中，加入100 mL無菌水振蕩混勻（30 ℃、180 r/min振蕩2 h），取1 mL懸浮液按10-1、10-2、10-3、10-4和10-5共5個(gè)梯度進(jìn)行稀釋，各取200 μL涂布于YPD培養(yǎng)基上，30 ℃倒置恒溫培養(yǎng)48 h，劃線分離，直至出現(xiàn)單菌落。酵母以40%甘油保存在-20 ℃冰箱。

1.3.2 酵母菌株的形態(tài)觀察

菌株在YPD固體平板中30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌株的形態(tài)大小進(jìn)行初步判定是否為酵母菌，并在光學(xué)顯微鏡下根據(jù)單細(xì)胞的個(gè)體大小及酵母菌典型細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)一步判斷菌株的類型，并命名。

1.3.3 酵母菌株分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)真菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，以提取真菌的總DNA為模板，采用ITS通用引物（ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）通過PCR擴(kuò)增序列，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，52 ℃退火2 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。將擴(kuò)增后的酵母菌PCR產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠電泳上跑樣，確認(rèn)擴(kuò)增結(jié)果和片段的大小，使用Marker判斷擴(kuò)增條帶大小。將條帶清楚的PCR產(chǎn)物純化后寄往上海生工生物科技有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果通過基本局部比對搜索工具（basiclocal alignmentsearchtool，BLAST）與美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析，用軟件Mega 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶菌株的篩選及酶活性測定

產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌的定性：由于產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株在以p-NPG為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基上能水解p-NPG生成對硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP），在Na2CO3作用下可形成黃色光圈。光圈顏色深淺能初步反映酶活性高低。因此，將菌株經(jīng)YEPD培養(yǎng)基活化后接種在篩選培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)72 h，噴1 mol/L Na2CO3進(jìn)行顯色，黃色光圈明顯的菌株即為目標(biāo)菌株[16]，接種于斜面4 ℃保存，作為產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株進(jìn)行復(fù)篩。

產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌的定量：將初篩得到的菌株活化后，接種到液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)72 h。取發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min 離心10 min，收集上清液，即為β-葡萄糖苷酶粗酶液，用于酶活性測定，從中篩選酶活力較高的菌株（以加熱失活的酶液按照同樣處理作為空白）。酶活的測定：離心管中加入0.8 mL上清液和0.2 mL底物溶液（5 mmol/L p-NPG溶解在2 mL pH為5.0的100 mmol/L檸檬酸緩沖溶液，750 μL檸檬酸-磷酸緩沖液（pH 5.0）和250 μL 1 mmoL/L p-NPG混合）在50 ℃條件下無菌培養(yǎng)25 min后，加入2 mL 1 mol/L碳酸鈉終止反應(yīng)，在波長400 nm處比色測定酶活，同時(shí)用未加酶的0.3 mL的底物溶液作空白對照。酶活定義：在一定溫度和pH條件下，1 min水解產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酚所需的酶量為1個(gè)酶活單位（U/mL）[17]。

采用加入2%脫脂乳粉于YPD培養(yǎng)基中篩選產(chǎn)蛋白酶活性的菌株。操作方法如下：將分離得到的菌株接種到相應(yīng)的YEPD培養(yǎng)基，將大小相同的滅菌圓紙片放入液體培養(yǎng)基中于相應(yīng)的溫度下培養(yǎng)24 h，然后用鑷子取出圓形濾紙片貼到含有2%脫脂乳粉的蛋白酶篩選固體培養(yǎng)基平板上，置于相應(yīng)的生化恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以菌落周圍是否產(chǎn)生白色水解圈為篩選依據(jù)[18]。

蛋白酶活力測定方法：采用GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》測定[19]。將具有明顯水解圈的初篩菌株接種于液體培養(yǎng)基后，搖床培養(yǎng)24 h以6 000 r/min離心取上清液，將酪蛋白為底物反應(yīng)后于波長680 nm處測定吸光度值。酶活定義：1 mL酶液在一定pH值和溫度條件下，每分鐘內(nèi)酪蛋白水解所產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選采用脂肪酶篩選培養(yǎng)基，將含有菌液的濾紙片接種到含有甘油三丁酸酯的培養(yǎng)基中于相應(yīng)的溫度下培養(yǎng)24 h，待有菌落長出來后將平板放在燈下觀察有無水解圈的產(chǎn)生。有透明水解圈的菌株則為產(chǎn)酶菌株[20]。將具水解圈的菌株接種到液體培養(yǎng)基后離心取上清，用電位及指示劑結(jié)合的滴定法測定酶活[21]。酶活定義：在一定溫度和pH 條件下，1 min水解底物產(chǎn)生1 μmol可滴定的脂肪酸，即可定義為1個(gè)酶活單位（U/mL）。

1.3.5 菌株耐受性研究

乙醇耐受性實(shí)驗(yàn)[22]：將純化過的酵母菌株以1×106CFU/mL分別接種于含0、4%、8%、12%、16%、20%乙醇的YPD液體培養(yǎng)基，在28 ℃條件下培養(yǎng)，每隔24 h測定OD600nm值，持續(xù)3 d。

糖耐受性實(shí)驗(yàn)[23]：將純化過的酵母菌株以1×106CFU/mL分別接種于含0、50 g/L、100 g/L、150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L、320 g/L葡萄糖的YPD液體培養(yǎng)基，在28 ℃條件下培養(yǎng)，每隔24 h測定OD600nm值，持續(xù)3 d。

二氧化硫耐受性實(shí)驗(yàn)[24]：將純化過的酵母菌株以1×106CFU/mL分別接種于含0、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L、320 mg/L二氧化硫的YPD液體培養(yǎng)基，在28 ℃條件下培養(yǎng)，每隔24 h測定OD600nm值，持續(xù)3 d。

H2S產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)[25]：將純化過的酵母菌株在坎迪達(dá)尼克森選擇性瓊脂（BIGGY）培養(yǎng)基涂布培養(yǎng)，在28 ℃條件下培養(yǎng)3 d，每隔24 h 觀察菌株顏色的變化。顏色分為四類：乳白色（+）、淺棕褐色（++）、棕褐色（+++）、褐色（++++）。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)過程中每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。用Edraw（V7.2.0.2467）畫圖軟件整合并繪制微生物菌株產(chǎn)酶示意圖。SPSS 19.0進(jìn)行差異顯著性分析，Origin 9.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)圖的繪制，R軟件（4.0.3）繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母的分離與鑒定

2.1.1 酵母的分離

本研究從新疆昌吉地區(qū)釀酒葡萄表皮篩選得到了62株酵母菌，編號為CZ1～CZ10，AG1～AG9，KL1～KL6，KS1～KS12，PM1～PM16，Y1～Y9。具有代表性的酵母菌落形態(tài)分別見圖1和表1。

圖1 篩選酵母菌細(xì)胞形態(tài)及鏡檢結(jié)果Fig. 1 Cell morphology and microscopic examination results of screened yeasts

表1 篩選酵母菌菌落形態(tài)Table 1 Colony morphology of screened yeasts

從圖1、表1可知，通過篩選代表性菌株的單個(gè)菌落圖發(fā)現(xiàn)大多數(shù)菌落是圓形。酵母菌株顏色主要為白色、淡粉色。大多數(shù)微生物菌株的表面光滑或有光澤，菌株邊緣整齊且不透明，菌落形狀基本都為高凸起。由鏡檢結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，酵母的形態(tài)有圓形、橢圓形和棱狀，能明顯觀察到部分酵母的細(xì)胞核、液泡及細(xì)胞壁。

2.1.2 酵母的鑒定

根據(jù)酵母菌株的形態(tài)篩選出12株具有代表特征的酵母菌并命名。按照真菌提取試劑盒說明書提取DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察其條帶是否明顯，是否符合測序標(biāo)準(zhǔn)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。

圖2 酵母菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 2 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification products of yeasts

由圖2可知，所有酵母菌的分子大小都在750 bp左右，且條帶非常清晰明亮，沒有明顯拖尾或是特別顯著的現(xiàn)象，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物符合測序標(biāo)準(zhǔn)并送往上海生工進(jìn)行測序。得到的測序結(jié)果再根據(jù)Mega軟件進(jìn)行序列的1 000次置信分析即可得到酵母菌的進(jìn)化樹，結(jié)果見圖3。

圖3 基于26S rDNA序列分析酵母菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of yeast strains based on 26S rDNA sequence analysis

由圖3可知，菌株KL6、CZ3和KS5為葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）；菌株KS3和PM11為仙人掌有孢漢遜酵母（Hanseniaspora opuntiae）；菌株Y1為德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）；菌株CZ10、AG2、Y8、CZ4和PM13為畢赤克魯維酵母（Pichia kluyveri）；菌株P(guān)M14為庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。

2.2 高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶菌株的篩選及酶活測定

以篩選得到的葡萄表皮樣品中的62株酵母菌為研究對象，篩選得到12株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶較高的菌株結(jié)果見表2。

表2 高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶酵母菌株的酶活測定Table 2 Enzyme activity determination of yeast strain with high production of β-glucosidase, protease and lipase U/mL

由表2可知，產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、蛋白酶和脂肪酶活性最高的分別是菌株CZ4（214.57 U/mL）、KS5（178.56 U/mL）和KS3（184.68 U/mL）；而最低的分別是菌株Y1（126.24 U/mL）、KL6（60.19 U/mL）和KL6（55.04 U/mL）?？梢钥闯?，菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活性明顯高于蛋白酶和脂肪酶活性。

2.3 酵母酶學(xué)特性分析

2.3.1 菌株耐受性分析

根據(jù)以上產(chǎn)酶菌株篩選得到的3株優(yōu)良產(chǎn)酶酵母菌株（KS3、CZ4、KS5），對其進(jìn)行耐受性分析，結(jié)果見表3。

表3 酵母菌株耐受性Table 3 Tolerance of yeast strains

由表3可知，隨著SO2濃度逐漸增加時(shí)，菌株KS5的SO2耐受性呈先增加后減少的趨勢，SO2含量為350 mg/L時(shí)，生長受到抑制，但仍能緩慢生長；當(dāng)糖含量逐漸增加時(shí)，菌株整體耐受性先增加后減少，在糖含量為200 g/L的環(huán)境中能夠生長，而在250 g/L環(huán)境生長受到抑制；隨著酒精含量的增加，酒精耐受性逐漸減弱，在酒精含量為16%時(shí)，雖然生長受到抑制但仍能生長，在酒精含量為20%時(shí)，生長受到強(qiáng)烈抑制。菌株KS3隨著SO2含量的增加，生長量呈先增加后減少的趨勢，SO2耐受量達(dá)到300 mg/L，但當(dāng)SO2含量為350 mg/L時(shí)，生長受到抑制；隨著糖含量的增加，其糖耐受性呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢；隨著酒精含量的上升，菌株KS3的生長量呈先升高后降低的趨勢，酒精含量為20%時(shí)，其生長受到了抑制。隨著SO2濃度的增加，菌株CZ4的生長量先增加后降低，在100 mg/L的環(huán)境中生長且生長量提升，但在350 mg/L時(shí)，生長受到抑制；隨著糖含量的增加，生長量呈先增加后減少的趨勢，在糖含量為200 g/L的環(huán)境中能夠生長，而在250 g/L環(huán)境生長受到抑制；隨著酒精含量的上升，生長量同樣呈先增加后減少的趨勢，當(dāng)酒精含量為20%時(shí)，生長受到了抑制。

2.3.2 H2S的產(chǎn)生

選擇產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、蛋白酶和脂肪酶活性最高的菌株CZ4、KS5和KS3在Biggy瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察酵母菌株菌落的顯色情況判斷H2S產(chǎn)生情況，結(jié)果見表4。

表4 酵母菌H2S產(chǎn)生試驗(yàn)結(jié)果Table 4 H2S production test results of strain

酵母菌株H2S產(chǎn)生量根據(jù)菌株在BIGGY培養(yǎng)基中顏色深淺判斷。由表4可知，菌株CZ4、KS3、KS5的H2S產(chǎn)生量均較低，適用于釀造葡萄酒。

3 結(jié)論

通過對所選釀酒葡萄表皮酵母菌的分離鑒定，從葡萄表皮篩選到62株酵母菌。通過對所篩酵母菌株的產(chǎn)酶特性分析，其中3株酵母菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、蛋白酶和脂肪酶活最高，分別是Pichia kluyveriCZ4（214.57 U/mL）、Hanseniaspora uvarumKS5（178.56 U/mL）和Hanseniaspora opuntiaeKS3（184.68 U/mL）。為了確保酵母菌株能夠在葡萄酒釀造環(huán)境中正常生長并提高葡萄酒品質(zhì)，對選取的產(chǎn)3種酶活性較高的酵母菌株進(jìn)行了耐受性和H2S產(chǎn)生量分析，結(jié)果表明，三株菌的SO2耐受性、糖耐受性和酒精耐受性整體呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，H2S產(chǎn)生量較低，能夠耐受葡萄酒釀造的環(huán)境。葡萄酒香氣大多數(shù)以結(jié)合態(tài)的形式存在，而通過酵母菌株自身代謝的酶類可以將結(jié)合態(tài)香氣轉(zhuǎn)化為游離態(tài)香氣，促進(jìn)葡萄酒香氣的呈現(xiàn)，提高葡萄酒品質(zhì)。通過對產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶、蛋白酶和脂肪酶酵母菌株的篩選，確定產(chǎn)酶效果較好的酵母菌株，為后續(xù)葡萄酒釀造增香效應(yīng)研究提供理論基礎(chǔ)。