李 櫻 綜述 單煜恒 審校

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染腦膜引起的非化膿性炎癥，具有病死率高，發(fā)病年齡低等特點。即使經(jīng)過規(guī)范化治療，依然有超過1/3的患者死亡，存活的患者也常遺留有多種神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[1]。早期診斷和及時、規(guī)范的治療是改善TBM預后的重要手段。然而，由于臨床表現(xiàn)缺乏特異性、檢驗手段缺乏敏感性，部分患者在疾病早期難以得到準確診斷[2]。

診斷TBM的關(guān)鍵在于對腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)中Mtb的檢測，常規(guī)檢測方法包括涂片染色鏡檢法及Mtb培養(yǎng)法[3]。但這兩種常規(guī)方法耗時長且敏感度低，難以實現(xiàn)TBM的早期診斷[4]。隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，利用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)擴增Mtb特異性堿基序列(探針法)、利用基因測序技術(shù)檢測微生物種類(測序法)等分子檢測技術(shù)逐漸應用于Mtb的實驗室檢測。以其標準化的操作流程，及時高效的診斷效能，這些分子檢測技術(shù)逐漸成為目前TBM實驗室診斷的研究熱點。本文將圍繞不同分子檢測技術(shù)在TBM診斷中的應用現(xiàn)狀和前景進行綜述。

1 Amplicor與COBAS TaqMan MTB技術(shù)

由瑞士Roche公司研發(fā)的Amplicor是首批應用于Mtb實驗室檢測的商業(yè)化試劑盒。該技術(shù)利用特異性引物選擇性擴增16S rRNA基因中一個長為584 bp 的DNA片段，再將擴增子與生物素標記的特異性探針雜交，進而利用酶聯(lián)免疫技術(shù)進行比色鑒定，當660 nm的吸光度值(OD660)>0.35時，判讀為Mtb陽性[5]。在2003年的一項研究中，作者發(fā)現(xiàn)以Mtb培養(yǎng)為金標準時，Amplicor診斷TBM的敏感度僅為55.6%，近半數(shù)患者呈現(xiàn)為假陰性。而當調(diào)整判讀閾值后(OD660>0.2)Amplicor的特異度又大幅下降。鑒于Amplicor技術(shù)在診斷效能中的缺陷，Roche公司在其基礎上開發(fā)了COBAS TaqMan MTB技術(shù)。該技術(shù)是首個基于TaqMan探針的診斷檢測方法。2011年，Kim應用Amplicor及COBAS TaqMan MTB技術(shù)對406個CSF樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)以Mtb培養(yǎng)陽性為金標準時，Amplicor診斷TBM的敏感度與特異度分別為58.3%與99.5%，而COBAS TaqMan MTB的敏感度與特異度分別為79.1%與98.2%[6]。這一結(jié)果提示，COBAS TaqMan MTB技術(shù)在TBM 診斷中具有較為理想的診斷效能及應用前景。

2 Mtb核酸直接擴增(amplified Mtb direct test，AMTD)技術(shù)

與Amplicor類似，由美國Gene-probe公司研發(fā)的AMTD技術(shù)也是一種早期應用于Mtb檢測的分子診斷技術(shù)。該技術(shù)使用轉(zhuǎn)錄酶擴增的方法擴增Mtb的16S rRNA，并利用吖啶脂標記的探針與擴增產(chǎn)物結(jié)合，從而進行化學發(fā)光檢測。由于rRNA在Mtb細胞中具有較高的拷貝數(shù)，因此AMTD技術(shù)也具有較高的敏感度。Chedore通過對311個CSF樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)以Mtb培養(yǎng)為金標準時，AMTD診斷TBM的敏感度與特異度分別為94%及99%。在另一項研究中，Lang等[7]發(fā)現(xiàn)AMTD在抗酸染色陰性的TBM患者中也具有良好的診斷效能，敏感度可達83%。該技術(shù)可在2.5 h內(nèi)實現(xiàn)樣本中Mtb的快速檢測，且整個反應過程在單一溫度及反應管內(nèi)進行，易于操作且不易污染。但是，由于rRNA只存在于活的Mtb細胞中，因此抗結(jié)核治療可能會影響AMTD的檢測結(jié)果。

3 環(huán)介導的等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)

LAMP技術(shù)是由日本Eiken Chemical公司研發(fā)的一種快速、簡便且有效的DNA擴增技術(shù)。該技術(shù)屬于恒溫擴增檢測技術(shù)的一種，僅需要2h即可完成對Mtb的鑒定[8]。LAMP可應用多種引物分子探針實現(xiàn)多個靶基因的擴增。其中，最常用的靶基因位點為IS6110，其次為MPB64。2011年，Nagdev[9]通過對27例TBM患者的CSF樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)以Mtb培養(yǎng)為金標準時，LAMP(IS6110)診斷TBM的敏感度為88%，特異度為80%。在另一項研究中，Modi等[10]通過對250例TBM患者及100例非TBM患者的CSF進行檢測，發(fā)現(xiàn)LAMP(IS6110)及LAMP(MPB64)診斷TBM的敏感度分別為87%及88%。上述結(jié)果提示LAMP對于TBM具有良好的診斷效能。但是，LAMP 技術(shù)也存在明顯不足。首先，應用于LAMP的引物分子探針設計較為復雜，且不同的引物分子探針的診斷效能不一。其次，LAMP的擴增產(chǎn)物常帶有核酸內(nèi)切酶殘端，無法直接進行定量分析，只能對擴增片段的有無進行定性分析。

4 分子線性探針技術(shù)(molecular line probe assay，LPA)

LPA主要應用于多耐藥性Mtb的檢測。該技術(shù)使用能夠靶向擴增Mtb耐藥基因的特異性引物，將擴增子與生物素標記的分子探針雜交，利用化學顯色技術(shù)進行結(jié)果判讀。目前，應用LPA檢測Mtb的方法主要有兩種：靶向利福平(rifampin，RIF)耐藥基因rpoB的INNO-LiPA Rif TB Assay和靶向異煙肼耐藥基因katG、inhA的GenoType MTBDRplus[11]。2015年，Solomons等[12]檢測了GenoType MTBDRplus的診斷效能，發(fā)現(xiàn)以TBM臨床診斷為金標準時，該檢測技術(shù)的敏感度為33%，特異度為98%。雖然LPA對TBM診斷的敏感度并不理想，但是該技術(shù)對于Mtb耐藥性的檢測非常準確，敏感度與特異度均超過95%。

5 GeneXpert MTB/RIF技術(shù)

GeneXpert MTB/RIF(簡稱Xpert)技術(shù)是一種以全自動半巢式實時定量熒光PCR為基礎，rpoB基因為靶點，利用GeneXpert平臺自動提取DNA并擴增的一種分子檢測技術(shù)[13]。該技術(shù)應用5種相互重疊的引物分子探針，選擇性擴增與RIF耐藥相關(guān)的rpoB基因核心區(qū)域，從而實現(xiàn)對Mtb DNA及RIF耐藥性的同時檢測。它具有方便、快速等特點，約2 h即可讀取結(jié)果。結(jié)果判讀依靠探針的循環(huán)閾值，即Ct值。當不少于2個探針的Ct值≤38時，即可判讀為Mtb陽性，當探針的早期與晚期Ct值之差>3.5時，即提示Mtb對RIF耐藥[14]。自2009年由美國 Cepheid 公司研發(fā)以來，Xpert技術(shù)逐步應用于臨床，并于2010年及2013年先后經(jīng)過世界衛(wèi)生組織及美國藥品食品監(jiān)督局批準，成為診斷TMB的一線方法[15]。

2014年，Denkinger等[16]在研究中發(fā)現(xiàn)，以Mtb培養(yǎng)陽性為金標準時，Xpert診斷TBM的敏感度超過80%，而以臨床診斷為金標準時，其敏感度也可達到60%。2018年，Kohli等[17]對33項關(guān)于Xpert診斷TMB的研究進行薈萃分析，發(fā)現(xiàn)Xpert診斷TMB的合并敏感度為71%、合并特異度為98%。自Xpert檢測系統(tǒng)得到國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準后，我國部分醫(yī)院也開展這一檢測技術(shù)，并發(fā)現(xiàn)以Mtb培養(yǎng)陽性為金標準時，其診斷TBM的敏感度約為80%，而以臨床診斷為金標準時，其敏感度約為50%[18-20]。上述結(jié)果提示，Xpert對于TBM的診斷具有良好的診斷效能。但是，價格高、通量小的特點限制其在基層醫(yī)院的廣泛應用。而且，早期應用該技術(shù)是否能夠改善TBM患者的總體預后還有待進一步研究。

6 Xpert MTB/RIF Ultra技術(shù)

Xpert MTB/RIF Ultra(簡稱Xpert Ultra)技術(shù)是在Xpert技術(shù)基礎上的發(fā)展與改進，兩者在檢測原理及操作流程等方面基本相同。而Xpert Ultra技術(shù)應用了更豐富的引物分子探針，不僅包括原有的4種靶向rpoB基因的引物分子探針，還包括2種靶向多拷貝序列IS6110和ISl081的引物分子探針。這一改動使Xpert Ultra具有較低的檢測閾值，從而提高了Mtb檢測的陽性率。2018年，Bahr[21]開展了一項包括129例TBM患者的診斷實驗，發(fā)現(xiàn)以Mtb培養(yǎng)、Xpert或Xpert Ultra陽性為金標準時，Xpert Ultra的敏感度為95%，高于Mtb培養(yǎng)及Xpert的敏感度，具有統(tǒng)計學差異。而在近期發(fā)表的一項前瞻性診斷實驗中，Donovan等[22]發(fā)現(xiàn)以Mtb培養(yǎng)陽性為金標準時，Xpert Ultra及Xpert診斷TBM的敏感度分別為59.5%及55.3%，而以臨床診斷為金標準時，兩者的敏感度分別為47.2%及37.6%，均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學差異。因此，Xpert Ultra技術(shù)在診斷TBM中是否優(yōu)于Xpert技術(shù)尚需要進一步研究及薈萃分析。

7 宏基因組二代測序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)技術(shù)

mNGS技術(shù)是目前應用最為廣泛的基因測序技術(shù)，具有成本低、通量高、速度快等特點，能夠檢測樣本中微生物的全部遺傳信息。這種檢測技術(shù)不需要制備特異性的分子引物，無差別的對樣本中所含的全部病原體進行篩查，通過與基因庫信息比對，確定潛在的致病菌。理論上，mNGS在TBM的診斷中具有一定的應用前景。2019年，邢小微[23]在關(guān)于mNGS診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，當以Mtb培養(yǎng)或Xpert為金標準時，mNGS診斷TBM的敏感度為60%、特異度為96%。在同年的另一項相關(guān)的研究中，Wang等[24]得到了類似的結(jié)果，在該研究中mNGS診斷TBM的敏感度為66%。但是，mNGS在TBM診斷的應用中還存在諸多問題。首先，mNGS的檢測結(jié)果并不唯一，?？稍跈z測中發(fā)現(xiàn)其他致病微生物的存在，使得結(jié)果難以判讀；其次，標本提取、實驗室檢測等操作過程中可能帶來外源性核酸污染，使mNGS結(jié)果的可信性大為下降；再次，關(guān)于mNGS診斷TBM的研究不足，證據(jù)欠缺，也尚無相關(guān)指南及共識推薦。

近年來，隨著核酸擴增技術(shù)的發(fā)展與進步，應用于診斷TBM的分子檢測技術(shù)層出不窮。這些檢測技術(shù)具有快速、可重復及高通量等優(yōu)點，但是也存在很多問題亟待解決。首先，CSF的低含菌量問題不僅影響傳統(tǒng)檢測方法的Mtb檢出率，也影響分子檢測技術(shù)的Mtb檢出率。增加CSF樣本含量并在檢測前離心處理可能對于提高分子檢測技術(shù)的敏感性有一定作用，但尚需相關(guān)研究證實。其次，診斷TBM的金標準尚有爭議，而且相關(guān)研究對金標準的選擇并不一致。不同的金標準選擇會得到分子檢測技術(shù)不同的診斷效能。比如，應用Mtb培養(yǎng)為金標準時，可能會高估分子檢測技術(shù)的敏感度并低估其特異度；而應用臨床診斷為金標準時，則可能會低估分子檢測技術(shù)的敏感度并高估其特異度。第三，分子檢測技術(shù)較傳統(tǒng)的Mtb檢測方法更為昂貴，而且在基層醫(yī)院難以開展。

雖然存在以上不足，但是分子檢測技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展已將Mtb的檢測從細胞水平提升至分子水平。在今后的研究中，如何降低檢測費用并提高分子檢測技術(shù)的診斷效能將成為相關(guān)領(lǐng)域的熱點問題。另外，建立一套全面的臨床應用綜合評價系統(tǒng)也將有助于分子檢測技術(shù)在TBM臨床診斷中的進一步應用與開展。