侯 寵 劉一品

濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(264100)

幽門(mén)螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)是一種革蘭陰性微需氧螺旋桿狀細(xì)菌，感染性強(qiáng)，可特異性定植于胃黏膜表面，與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤、胃癌等上消化道疾病密切相關(guān)[1]。Maastricht Ⅴ/Florence共識(shí)已將Hp根除治療的范圍擴(kuò)展至無(wú)癥狀感染者[2]。目前針對(duì)Hp的根除治療主要包括圍繞抗菌藥物為主的標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法(質(zhì)子泵抑制劑+兩種抗菌藥物)和鉍劑四聯(lián)療法(質(zhì)子泵抑制劑+鉍劑+兩種抗菌藥物)。目前，Hp在全球的感染率已過(guò)半。在我國(guó)，由于抗菌藥物濫用等一系列原因，Hp感染率已超過(guò)世界平均水平，臨床上對(duì)抗菌藥物的耐藥菌株越來(lái)越多見(jiàn)[3]。甲硝唑、克拉霉素以及左氧氟沙星的耐藥率分別已高達(dá)40%～70%、20%～50%以及20%～50%，且存在明顯的地域差異，雙重、三重、四重耐藥率逐年上升[4]。因此，解決抗菌藥物耐藥的問(wèn)題已成為成功根除Hp的關(guān)鍵。本文就Hp抗菌藥物耐藥分子機(jī)制的研究進(jìn)展作一綜述。

一、Hp的抗菌藥物耐藥機(jī)制

目前，用于根除Hp的抗菌藥物主要包括大環(huán)內(nèi)酯類(如克拉霉素)、硝基咪唑類(如甲硝唑)、氟喹諾酮類(如左氧氟沙星)、阿莫西林、呋喃唑酮、四環(huán)素以及利福平。部分抗菌抗物可阻斷細(xì)菌核酸的合成如甲硝唑、利福平、左氧氟沙星；部分可阻斷細(xì)菌核糖體的合成如克拉霉素、四環(huán)素；部分可影響細(xì)菌細(xì)胞壁的合成如阿莫西林[5]。而抗菌靶基因發(fā)生突變、細(xì)胞屏障或外排系統(tǒng)發(fā)生改變、細(xì)菌球形變、誘導(dǎo)自噬以及與耐藥相關(guān)的酶或毒力因子的分泌等一系列原因均可使細(xì)菌逃避抗菌藥物的活性而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。

1.靶基因發(fā)生突變

①DNA促旋酶基因突變：DNA促旋酶屬細(xì)菌裂解酶，維持著細(xì)胞內(nèi)正常的DNA螺旋結(jié)構(gòu)，與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組以及修復(fù)密切相關(guān)。有研究[6]表明，氟喹諾酮類藥物是有效的DNA促旋酶抑制劑，可導(dǎo)致不可逆性的細(xì)菌DNA損傷。DNA促旋酶基因由GyrA和GyrB兩個(gè)亞基構(gòu)成，Hp DNA促旋酶基因突變，尤其是GyrA基因突變，可阻止氟喹諾酮類藥物與酶特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。GyrB突變亦可導(dǎo)致Hp對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥，但通常與GyrA突變同時(shí)存在。GyrA耐藥決定區(qū)最常見(jiàn)的點(diǎn)突變?yōu)榈?7和第91位密碼子的突變[7]，其中第87位突變可能與Hp對(duì)氟喹諾酮類藥物高水平耐藥相關(guān)。此外，GyrA基因中第88和97位密碼子的突變、新發(fā)現(xiàn)的GyrA突變位點(diǎn)(如A129T、R140K、D192N、D34N、D161N、D34Y、R140K)以及GyrB基因突變(如D484K、F438S)均與氟喹諾酮耐藥密切相關(guān)[8-9]。

②RNA聚合酶基因突變：RNA聚合酶是一種由多個(gè)蛋白質(zhì)亞基組成的復(fù)合酶，以Hp DNA為模板，與RNA轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。RNA聚合酶基因突變使RNA聚合酶上的抗菌藥物靶位發(fā)生構(gòu)象改變，抗菌藥物無(wú)法與酶特異性結(jié)合，從而喪失抗菌作用。RNA聚合酶Pro基因編碼的B亞基突變是導(dǎo)致Hp對(duì)利福平耐藥的主要原因。目前發(fā)現(xiàn)第526～545、585、586、701以及149位密碼子突變均可使Hp對(duì)利福平耐藥，其中第526～545位突變起主導(dǎo)作用[10]。

③氧化還原酶編碼基因突變：氧化還原酶作為生物體內(nèi)氧化還原體系中重要的催化酶，通過(guò)傳遞電子等一系列反應(yīng)，在細(xì)菌的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。部分抗菌藥物如甲硝唑，可從氧化還原反應(yīng)中搶奪電子而發(fā)揮其抗菌活性，而氧化還原酶相關(guān)基因突變中斷了這一過(guò)程，使Hp逃避了抗菌藥物活性導(dǎo)致耐藥。在Hp中，氧化還原酶編碼基因主要包括rdxA、frxA以及fdxB[11]。rdxA編碼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)亞硝基還原酶，frxA編碼NADPH黃素氧化還原酶，fdxB編碼類鐵氧體蛋白。其中rdxA基因突變是引起Hp對(duì)甲硝唑耐藥的主要原因，該基因突變使NADPH亞硝基還原酶活性降低，導(dǎo)致還原硝基的能力下降，不能取得足夠低的氧化還原電位，使甲硝唑無(wú)法還原生成具備殺菌活性的代謝產(chǎn)物[12]。然而相關(guān)研究[13]顯示，僅存在rdxA基因突變似乎不足以引起甲硝唑耐藥，可能需要其他因素協(xié)同作用。此外，有研究[14]發(fā)現(xiàn)frxA基因可增強(qiáng)rdxA突變株的耐藥性。

④核糖體RNA(ribosomal RNA,rRNA)編碼基因突變：rRNA是生物細(xì)胞中主要的核糖核酸之一，是一種具有催化能力的核糖酶，是參與生物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成的重要結(jié)構(gòu)。Hp作為一種原核生物，其rRNA分為5S rRNA、16S rRNA以及23S rRNA，Hp的耐藥性與16S rRNA和23S rRNA編碼基因突變有關(guān)。大環(huán)內(nèi)酯類藥物的抗Hp機(jī)制是其與23S rRNA的Ⅴ結(jié)構(gòu)域中的肽基轉(zhuǎn)移酶環(huán)可逆性結(jié)合，從而阻止肽鏈的延伸。而細(xì)菌23S rRNA編碼基因Ⅴ區(qū)的點(diǎn)突變會(huì)使核糖體構(gòu)象改變，使抗菌藥物與核糖體的親和力減弱，核糖體內(nèi)肽鏈得以延伸，細(xì)菌可完成蛋白質(zhì)合成工作而抗菌藥物無(wú)法發(fā)揮完全的抗菌作用[15]。目前最常見(jiàn)的3個(gè)V區(qū)點(diǎn)突變?yōu)锳2143G、A2142G以及A2142C[16]。多項(xiàng)研究[17-18]發(fā)現(xiàn)A2146C、A2146G、A2147G等一些新的突變位點(diǎn)與克拉霉素耐藥相關(guān)。同樣，16S rRNA編碼基因初始結(jié)合位點(diǎn)點(diǎn)突變可導(dǎo)致四環(huán)素耐藥，其主要的突變位點(diǎn)位于926～928位，AGA～TTC的三堿基發(fā)生變化[19]。此外，抗菌藥物耐藥水平與這3個(gè)堿基的突變數(shù)量有關(guān)，堿基替換數(shù)量越多，耐藥性越高[11,20]。

⑤細(xì)菌青霉素結(jié)合蛋白(penicillin-binding proteins,PBPs)編碼基因突變：PBPs是存在于細(xì)菌表面的一類膜蛋白，參與Hp細(xì)胞壁中肽聚糖的合成，在細(xì)菌生長(zhǎng)、繁殖中發(fā)揮重要作用。通常情況下，阿莫西林與PBPs中的多溴聯(lián)苯共價(jià)結(jié)合，阻斷肽聚糖的合成，細(xì)菌細(xì)胞壁發(fā)生缺陷使細(xì)菌失去保護(hù)屏障而膨脹、破裂，從而發(fā)揮阿莫西林的抗菌作用。PBPs編碼基因突變使阿莫西林與PBPs的親和力減弱而發(fā)生耐藥。目前已鑒定出4種PBPs，分別為PBP1、PBP2、PBP3以及PBP4。其中PBP1A基因點(diǎn)突變是阿莫西林耐藥的主要機(jī)制[21]，這些點(diǎn)突變主要位于PBPs 3個(gè)結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)區(qū)域中，分別是保守的殘基402～404和555～557，突變位點(diǎn)包括A369T、S414R、N562Y、D535N、S543R等[22-24]。此外，在PBP1突變的基礎(chǔ)上，PBP2和PBP3突變可發(fā)揮更強(qiáng)大的耐藥性[25]。

2.細(xì)胞屏障或外排系統(tǒng)發(fā)生改變使胞質(zhì)內(nèi)抗菌藥物濃度降低

①外膜蛋白(OMPs)發(fā)生改變：細(xì)菌的外膜是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的特有結(jié)構(gòu)，位于細(xì)菌質(zhì)膜(內(nèi)膜)和肽聚糖層的外側(cè)，包裹著整個(gè)細(xì)菌，是細(xì)菌重要的保護(hù)屏障。OMPs是細(xì)菌外膜的主要成分，包括脂蛋白、孔蛋白、鐵調(diào)節(jié)蛋白、泵蛋白等，在細(xì)菌的生命活動(dòng)中起有重要作用。OMPs不僅可介導(dǎo)Hp黏附，是Hp感染致病的關(guān)鍵蛋白，而且與Hp耐藥密不可分[26]。研究[27]表明，Hp受抗菌藥物刺激后，可上調(diào)OMPs基因表達(dá)，OMPs高表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)菌外膜屏障的保護(hù)作用，使抗菌藥物的滲透性進(jìn)一步減弱，此是阿莫西林發(fā)生難治性耐藥和克拉霉素耐藥的另一種機(jī)制。OMPs基因HopB和HopC可使阿莫西林發(fā)生難治性耐藥，HopB、HofC以及OMP31可使克拉霉素發(fā)生耐藥[28]。

②細(xì)菌生物膜的形成：Hp感染人體后，附著于胃黏膜表面進(jìn)行繁殖、分化，并向胞外分泌多糖基質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)、核酸以及一些保護(hù)性底物，菌體群落在這些胞外基質(zhì)中互相黏附形成細(xì)菌聚集體膜狀物，稱為細(xì)菌生物膜。不同于浮游細(xì)菌，形成生物膜結(jié)構(gòu)的菌群對(duì)外界惡劣環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，其中包括對(duì)抗菌藥物的抵抗防御。研究[29]顯示，有生物膜形成的菌體對(duì)抗菌藥物的耐藥性會(huì)增長(zhǎng)10～1 000倍。此種高水平的耐藥可能與生物膜介導(dǎo)的多種耐藥機(jī)制相關(guān)：a.與OMPs高表達(dá)類似，生物膜的形成會(huì)給細(xì)菌提供更強(qiáng)的屏障保護(hù)作用。且有相關(guān)研究[30]表明生物膜的形成會(huì)促進(jìn)OMPs的改變，進(jìn)一步加強(qiáng)細(xì)菌對(duì)外界的防御能力。b.位于生物膜深層的細(xì)菌由于缺少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣會(huì)處于休眠狀態(tài)。一般情況下，抗菌藥物僅對(duì)處于活動(dòng)期的細(xì)菌有良好的抑菌、殺菌作用，而位于生物膜深層的休眠期細(xì)菌不易被殺滅。c.細(xì)菌生物膜可與外排泵聯(lián)合作用將進(jìn)入生物膜中的抗菌藥物泵出，如克拉霉素[30]。d.此外，有研究[31]顯示生物膜的形成可能會(huì)誘導(dǎo)抗菌靶基因發(fā)生點(diǎn)突變以及生物膜胞外基質(zhì)的一些酶水解抗菌藥物，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步明確。

③外排泵的參與：細(xì)菌的外排泵是位于細(xì)胞膜上的一類多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可將進(jìn)入菌體的抗菌藥物泵出胞外，使菌體胞內(nèi)抗菌藥物濃度降低而發(fā)揮耐藥作用。外排泵系統(tǒng)能參與多種抗菌藥物的泵出如阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素、四環(huán)素等，細(xì)菌發(fā)生雙重或多重耐藥的概率顯著增加[32]。Hp外排泵家族分為5類：耐藥結(jié)節(jié)分化(resistance nodulation-division,RND)家族、主要易化子超家族(major facilitator superfamily,MFS)、ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette,ABC)超家族、小多重耐藥(small multidrug resistance,SMR)家族以及多藥和毒性化合物外排(multidrug and toxic compound extrusion,MATE)家族[33]。RND家族中的AcrAB-TolC外排泵是Hp最主要的多重耐藥外排系統(tǒng)。hefABC、hefDEF以及hefGHI是3種編碼AcrAB-TolC外排泵系統(tǒng)的同源基因[34]。安瑩等[35]研究了敲除hefABC、hefDEF、hefGIH基因?qū)p在克拉霉素耐藥中的影響，與野生株Hp26695相比，敲除基因后的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)明顯降低，證實(shí)了hef外排泵系統(tǒng)在克拉霉素耐藥中的作用。Kutschke等[36]測(cè)定了野生株和基因突變株對(duì)12種抗菌藥物的MIC值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%的hefC基因突變株抗菌藥物MIC值出現(xiàn)下降，其中克林霉素、四環(huán)素、頭孢噻肟MIC值降低了8～16倍，證實(shí)了外排泵與細(xì)菌多藥耐藥的相關(guān)性。此外，有研究[37]顯示，有生物膜形成的菌株中外排泵基因Hp605、Hp971、Hp1327的表達(dá)明顯高于浮游株，提示外排泵與生物膜可發(fā)揮協(xié)同作用，以增加耐藥性。

3.Hp球形變：通常情況下，Hp是一種革蘭陰性螺旋桿菌，當(dāng)外界環(huán)境不利于Hp的生長(zhǎng)繁殖時(shí)，如缺少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或氧氣、pH值改變、抗菌藥物干預(yù)等，螺旋形Hp會(huì)發(fā)生球形變，成為L(zhǎng)形Hp[38]。球形Hp以兩種形式存在：一種已死亡或變性，另一種處于非活動(dòng)期，致病力相對(duì)減弱且對(duì)抗菌藥物不敏感。目前認(rèn)為處于非活動(dòng)期的球形Hp在抗菌藥物治療期間啟動(dòng)了耐藥逃逸機(jī)制，使抗菌藥物的滅菌活性顯著減弱。在停用抗菌藥物2～4周后球形Hp可恢復(fù)原有的形態(tài)和活性，故球形變是Hp耐藥、Hp長(zhǎng)期慢性感染以及根除后復(fù)發(fā)的重要原因之一[39]。

4.誘導(dǎo)自噬：一般情況下，Hp感染人體后黏附于胃上皮細(xì)胞表面，是一種非侵襲性病原體。而有研究[40]顯示在完全清除細(xì)胞外的細(xì)菌后，細(xì)菌會(huì)重新出現(xiàn)于細(xì)胞外環(huán)境中。Wang等[41]的研究發(fā)現(xiàn)，Hp可在胃上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及樹(shù)突細(xì)胞內(nèi)存活和繁殖，提示Hp可介導(dǎo)自噬的發(fā)生。這些由于誘導(dǎo)自噬而存在于宿主細(xì)胞內(nèi)的Hp可完美地避開(kāi)細(xì)胞外抗菌藥物的清除作用，且在慢性感染期在自噬體內(nèi)繼續(xù)存活繁殖造成持續(xù)或終身感染，提示在慢性感染期使用針對(duì)細(xì)胞內(nèi)作用的抗菌藥物或許會(huì)為治療Hp持續(xù)感染提供新的思路。

5.細(xì)菌分泌酶使抗菌藥物失去活性：目前發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶由Hp等分泌，可使β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物(如阿莫西林)失活，這種酶能特異性打開(kāi)β-內(nèi)酰胺環(huán)，使阿莫西林失去其抗菌活性從而增加耐藥性[42]。而Hp是否亦分泌其他酶以抵抗藥物的滅菌作用仍待進(jìn)一步研究。

6.毒力因子的參與：在Hp感染過(guò)程中，有多種毒力因子參與其中，如細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(cytotoxin associated protein A,CagA)、空泡細(xì)胞毒素A(vacuolating cytotoxin A,VacA)等。通常認(rèn)為細(xì)菌分泌毒力因子與其致病性密切相關(guān)。而有研究[43]顯示，CagA+菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性較CagA-菌株更強(qiáng)，提示毒力因子亦參與Hp抗菌藥物的耐藥過(guò)程，且毒力較弱的菌株較毒力較強(qiáng)的菌株能夠更好地逃避抗菌藥物活性。Hussein等[44]亦發(fā)現(xiàn)毒力因子十二指腸潰瘍促進(jìn)因子A(dupA)與A2147G克拉霉素耐藥有顯著相關(guān)性。對(duì)細(xì)菌分泌的毒力因子與Hp耐藥機(jī)制之間的相關(guān)性研究有望為Hp的根除治療打開(kāi)一個(gè)新領(lǐng)域。

二、結(jié)語(yǔ)和展望

目前，雖然益生菌、中藥、抗菌肽等新的治療手段層出不窮，帶有抗菌藥物的三聯(lián)或四聯(lián)療法仍是未來(lái)一段時(shí)間內(nèi)根除Hp的主要手段，但關(guān)于Hp耐藥機(jī)制的研究仍不夠完善。因此，致力于尋找和剖析Hp對(duì)抗菌藥物耐藥的深層機(jī)制以改變Hp耐藥率在國(guó)內(nèi)顯著增長(zhǎng)的嚴(yán)峻現(xiàn)狀顯得尤為重要。本文從病原體的角度闡述了目前Hp抗菌藥物耐藥的主要分子機(jī)制，旨在為進(jìn)一步降低Hp對(duì)抗菌藥物的耐藥率提供新的理論基礎(chǔ)和思路。