p53 基因敲除對小鼠神經(jīng)行為及桶狀皮層神經(jīng)元數(shù)目的影響

焦翠王儉妹周雪穎況海霞劉輝保柳濤

(1. 南昌大學第一附屬醫(yī)院兒科,南昌 330006; 2. 新余市婦幼保健院兒科,江西 新余 338025)

p53 基因位于人類染色體17p13.1,可調控多種基因和microRNA 的表達,在細胞應對各種應激如DNA 損傷和缺氧等過程中起著關鍵作用,對維持生物的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關重要[1]。自1979年被發(fā)現(xiàn)以來,p53 作為一種抑癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。近年來,越來越多的研究開始關注p53 基因在神經(jīng)精神性疾病中的作用,機制與調控神經(jīng)管發(fā)育[2]、突觸可塑性[3]、神經(jīng)元分化和軸突再生[4]等有關。研究發(fā)現(xiàn),孤獨癥患兒外周血單核細胞p53 基因復制比率增高[5];阿爾茨海默病患者的成纖維細胞和血細胞中p53 蛋白構象改變,使蛋白功能受損、生長相關蛋白43(GAP-43)水平降低,導致神經(jīng)元死亡[6-7];帕金森小鼠黑質紋狀體系統(tǒng)中多巴胺能神經(jīng)元p53 基因缺失時,通過下調促凋亡基因-Bax、Puma表達,增加神經(jīng)元存活,產(chǎn)生神經(jīng)保護作用[8]。雖然p53 基因在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用已經(jīng)被初步認識,但是對其研究多集中于體外培養(yǎng)的神經(jīng)細胞及分子機制,而p53 基因缺失對動物神經(jīng)行為學的影響的研究較少,且結果存在分歧。如Amson 等[9]研究發(fā)現(xiàn),p53 基因敲除(KO)小鼠存在焦慮樣行為,而Campana 等[10]研究結果則相反。因此,我們利用p53 基因敲除小鼠,探討了p53基因缺失對小鼠的焦慮樣行為和工作記憶能力等神經(jīng)行為學及相關腦區(qū)神經(jīng)元數(shù)目的影響,以期為深入研究p53 基因在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

8 ～12周齡SPF 級p53 基因純合敲除(KO)(C57BL/6-Trp53tm1/Bcgen)小鼠45 只及野生型(WT)小鼠(C57BL/6)38 只,雌雄不拘,體重18 ～25 g,均為C57BL/6 背景,購于北京百奧賽圖公司【SCXK(京)2019-0001】,飼養(yǎng)于我校動物中心【SYXK(贛)2015-0001】。動物房維持12 h:12 h 的晝夜循環(huán)(7:00 ～19:00),室溫23 ～25℃,濕度50%,可自由獲取食物和飲水。實驗動物操作嚴格遵守《南昌大學實驗動物管理辦法》及《南昌大學實驗動物實驗倫理審查》(倫理審批號2017(009))。

1.1.2 主要試劑與儀器

尼式染色液(Solarbio,中國)。曠場、Y 迷宮、紋理辨別實驗裝置(自制), 石蠟切片機(Leica RM2245,德國),包埋機(Leica GE1150H,德國),機械對流烤箱(Thermo scientific 51028873,美國),圖像導航掃描儀(Olympus FSX100,日本),Matlab R2016b 分析軟件(MathWorks,美國),Image-Pro Plus 6.0 分析軟件(Media Cybernetics,美國)。

1.2 方法

1.2.1 曠場實驗(open field test,OF)

本實驗用于評測焦慮情緒與自發(fā)活動。開闊曠場大小為50 cm × 50 cm × 25 cm(長× 寬×高)[11],攝像頭置于盒子正上方,光照強度為300 Lux 左右。隨機選取野生型小鼠18 只、p53 基因敲除14 只小鼠進行該實驗。測試時將小鼠放置于曠場中心(中心點至各邊15 cm 以內(nèi)),任其自由活動10 min。觀察指標為小鼠在曠場中心活動的時間及運動總路程。用Matlab R2016b 軟件進行數(shù)據(jù)析。測試室溫度23 ～25℃,時間為8:00 ～17:00,每組測試結束后,用酒精擦洗盒子后再進行下一只實驗鼠的檢測。

1.2.2 Y 迷宮實驗(Y-maze test,YM)

本實驗用于檢測工作記憶能力。測試盒為臂長40 cm、寬10 cm、高25 cm 的三臂水平迷宮[12],攝像頭置于盒子正上方,光照強度為300 Lux 左右。隨機選取野生型小鼠12 只、p53 基因敲除14 只小鼠進行該實驗。測試時將小鼠放置在其中一臂末端,并使其鼻側朝向迷宮的中心,自由活動5 min。觀察指標為小鼠進入臂的總次數(shù)及自發(fā)交替率。用Matlab R2016b 軟件進行數(shù)據(jù)析。小鼠按順序依次進入三個臂為交替一次,計算公式為:交替率=交替次數(shù)/(進入臂的總次數(shù)-2)×100%。分析軟件、測試條件及處理同1.2.1。

1.2.3 紋理辨別實驗(texture discrimination task,TDT)

本實驗用于評估觸須敏感性[13]。測試盒與曠場實驗相同,但測試時盒子底部覆蓋以2 cm 厚的常規(guī)墊料,另有目標物a、b、c、d,0.5 cm × 15 cm × 4 cm(厚× 長× 寬),固定于4 cm × 4 cm 底座上。氧化鋁砂紙覆蓋在目標物底座上方2 cm 處,覆蓋高度為7.5 cm,繞目標物一周。a、b、c 的砂紙為80 目,d 的砂紙為100 目[13]。為盡量減少不同砂紙之間的視覺差異,光照強度調弱為50 Lux 左右。隨機選取野生型小鼠12 只、p53 基因敲除7 只小鼠進行該實驗。實驗分為適應期和測試期,共3 d。適應期(2 d)每天把小鼠放入不含目標物、覆蓋墊料的測試盒中,自由適應10 min。測試期(第3天)包括兩個階段—學習階段和測試階段。測試當天,先在盒子底部覆蓋墊料,再放入目標物a 和b,目標物底部埋入墊料中。將實驗動物鼻側背離目標物放入盒中,自由探索5 min,此為學習階段。然后將實驗小鼠移至一個覆蓋干凈墊料的中轉籠中過渡5 min,與此同時將目標物a 和b 換成c 和d,再次將動物鼻側背離目標物放入盒中,測試3 min,此為測試階段?！疤剿鳌倍x為小鼠的鼻觸碰到物體或者鼻與物體的距離＜2 cm,人工計數(shù)小鼠主動探索每個目標物的時間。在學習階段未探索目標物、在測試階段只探索一個目標物或者在兩個階段中總探索時間小于2 s 的小鼠因先天探索能力缺乏而被剔除。觀察指標為在學習階段探索兩個相同紋理目標物(a 和b)的總時間及在測試階段探索熟悉紋理(c)與新紋理(d)時間的百分比。測試條件及處理同1.2.1。

1.2.4 尼氏染色

小鼠予腹腔注射烏拉坦(1.2 g/kg)深度麻醉后,用30 mL 4℃生理鹽水心臟灌流,斷頭取腦。將腦組織放入10%中性福爾馬林中固定,脫水后進行石蠟包埋,制備3 μm 冠狀切片(前囟-0.94 ～-1.28 mm)。尼氏染色時將切片浸入裝有Cresyl violet Stain 試劑的染缸中,于機械對流烤箱56℃浸染1 h。然后用去離子水沖洗數(shù)次,隨后置于Nissl Differentiation 液中分化數(shù)秒至2 min(背景接近于無色)。最后無水乙醇迅速脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。對照組和實驗組各取3 只小鼠的腦組織標本,從每個標本中隨機選取≥3 張不同切面的切片于40 × 鏡下觀察,選取≥3 個不重疊視野計數(shù)桶狀皮層II/III 層每個視野下的神經(jīng)元數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)均以平均值± 標準誤差(±)表示,采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析。本研究統(tǒng)計方法均選用獨立樣本t檢驗,P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 曠場實驗結果

小鼠在曠場中的運動軌跡及熱圖的代表圖如圖1A 所示。野生型小鼠和p53 基因敲除小鼠在曠場中心區(qū)域活動的時間分別為(67.51 ± 6.92)s 和(57.42 ± 8.50)s,無顯著差異(P=0.360)(圖1B);總運動路程分別為(3914.52 ± 401.64) cm 和(4637.91 ± 323.37)cm,無統(tǒng)計學差異(P=0.166)(圖1C),表明p53 基因缺失對小鼠的焦慮樣行為和自發(fā)活動無顯著影響。

2.2 Y 迷宮實驗結果

小鼠在Y 迷宮中的運動軌跡圖和熱圖的代表圖如圖2A 所示。野生型小鼠和p53 基因敲除小鼠在Y 迷宮中的自發(fā)交替率(野生型小鼠:53.33% ±3.03%,p53 基 因 敲 除: 48.25% ± 3.94%,P=0.320)(圖2B)和進入臂的總次數(shù)(野生型小鼠:33± 4 次,p53 基因敲除(28 ± 4)次,P=0.379)(圖2C)均無顯著差異,表明敲除p53 基因不影響小鼠的工作記憶能力。

2.3 紋理辨別實驗結果

紋理辨別實驗操作示意圖如圖3A 所示。測試當天,在學習和測試階段,兩種小鼠對相同紋理目標物(野生型小鼠(21 ± 5)s,p53 基因敲除(22 ± 7)s,P=0.892)和不同紋理目標物(野生型小鼠(19 ± 4)s,p53 基因敲除(14 ± 2)s,P=0.383)的總探索時間均相似(圖3B),但p53 基因敲除小鼠對新紋理目標物探索時間與總探索時間的百分比較野生型小鼠更低(野生型小鼠: 59.98% ± 3.76%,p53 基因敲除:41.56% ± 3.55%,P=0.005)(圖3C),說明敲除p53 基因可損傷小鼠對新紋理的辨別能力,即觸須敏感性降低。

2.4 尼氏染色結果

尼式染色代表圖如圖4A 所示。p53 基因敲除小鼠桶狀皮層第II/III 層神經(jīng)元數(shù)目較野生型小鼠顯著減少(野生型小鼠(68 ± 1)個,p53 基因敲除(61 ± 1)個,P=0.002)(圖4B),說明敲除p53 基因可影響神經(jīng)元的生長。

圖1 曠場實驗測試結果(±s)Note. A. Representative tracks and heat maps of mice movements in the open field test. B. Histogram indicating the center time calculated from the open field test. C. Histogram indicating the total distance moved in the open field test.Figure 1 The results of the open field test(±s)

圖2 Y 迷宮實驗測試結果(±s)Note. A. Representative tracks and heat maps of mice movements in the Y-maze test. B. Histogram indicating the percentage of spontaneous alternation in the Y-maze test. C. Histogram indicating the number of arms entries in the Y-maze test.Figure 2 The results of the Y-maze test(±s)

圖3 紋理辨別實驗測試結果(±s)Note. A. Histogram indicating the total time spend to investigate the textures object. B. Histogram indicating the percentage of time to investigate the novel textures in the texture discrimination task. Compared with the WT mice, ??P＜0.01. (The same in the following figure)Figure 3 The results of the texture discrimination task(±s)

圖4 尼氏染色結果(±s)Note. A. Representative photomicrographs of the barrel cortex sections (Nissl staining), white squares represent the areas for analysis. B. Histogram indicating the number of neurons in the layers II/III of the barrel cortex.Figure 4 The results of the Nissl staining(±s)

3 討論

在神經(jīng)系統(tǒng)中,p53 基因廣泛分布于海馬、丘腦和小腦等部位[14],它不僅可通過調控神經(jīng)元分化相關基因如GAP-43[15]和Map2[16]等的轉錄和表達影響神經(jīng)元分化和軸突再生,從而在神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育中發(fā)揮重要的功能;還參與調控神經(jīng)元凋亡相關基因[17],在癲癇發(fā)作后神經(jīng)元凋亡[18]和腦缺血再灌注損傷時細胞的自噬及凋亡[19]等病理情況下也具有重要的作用。

焦慮癥是一種常見的精神疾病,是當面對威脅或壓力時產(chǎn)生的持續(xù)存在的恐懼感。評估小鼠的焦慮樣行為的常用方法有高架十字迷宮和曠場實驗等,兩者對焦慮應變差異的檢測與曠場實驗敏感性相當,通?？梢韵嗷ヲ炞C。Amson 等[9]在圓形曠場實驗中發(fā)現(xiàn)p53 基因敲除小鼠具有焦慮樣行為,而Campana 等[10]在高架十字迷宮實驗中的結果與此相反。相比于圓形曠場,方形曠場更常用于嚙齒類動物焦慮樣行為的評估[11]。本研究中方形曠場實驗結果顯示p53 基因敲除小鼠無焦慮樣行為,與Campana 等[10]觀點一致。研究表明,開闊曠場的形狀、大小、材質、實驗持續(xù)時長、數(shù)據(jù)采集方式(攝像系統(tǒng)或紅外系統(tǒng))和測試時的光強等均可能對測試結果有一定的影響[20]。因此,上述結果不同可能與實驗裝置、照明條件、實驗時長、數(shù)據(jù)采集和分析系統(tǒng)均不同有關。此外,王維剛等[21]研究認為,相較于其他行為學實驗,如強迫游泳、水迷宮實驗等,曠場實驗對小鼠的影響較小,因此在同一批小鼠進行不同行為學實驗時,通常應先進行曠場實驗。Amson 等[9]在Morris 水迷宮實驗后進行曠場實驗也可能是導致其測試結果不同的原因。此外,Campana 等[10]通過曠場實驗、加速旋轉棒測試觀察到p53 基因敲除小鼠基礎運動能力正常且無共濟失調,但它們存在行走同步缺陷,可能與p53 基因缺失導致小腦發(fā)育異常有關。與Campana 等[10]一致,我們的結果表明p53 基因敲除小鼠活動能力正常,排除了因小鼠活動能力異常導致焦慮樣行為測試結果陰性的可能。

學習記憶力受損是認知功能障礙中較為常見的一種表現(xiàn),Morris 水迷宮和Y 迷宮是目前最常用的評估方法之一。前者側重于測試實驗動物對空間位置感和方向感(空間定位)的學習記憶能力,后者則主要觀察動物的注意力、短時記憶和對信息的處理等工作記憶能力。研究發(fā)現(xiàn)p53 基因敲除小鼠在水迷宮實驗中表現(xiàn)出空間學習記憶能力受損[9],可能由于p53 基因缺失后機體抗凋亡能力下降,從而導致p53 基因敲除小鼠神經(jīng)細胞減少和大腦發(fā)育異常。Morris 水迷宮對工作記憶的測試不如Y 迷宮敏感[22],本研究中,p53 基因敲除小鼠在Y 迷宮中的自發(fā)交替率和進入臂的總次數(shù)與野生型小鼠無差異,表明其工作記憶能力未受損。

嚙齒類動物的觸須是一種非常發(fā)達的感覺器官,觸須的感覺輸入與覓食、探索、感知危險等日?；顒酉⑾⑾嚓P。學者們通常通過刺激小鼠觸須或剪除觸須從而剝奪其觸須感覺輸入,進而觀察其中樞投射部位—大腦軀體感覺皮層桶狀區(qū)域(barrel field of the somatosensory cortex,S1BF)神經(jīng)元的可塑性,這是一種常用于感覺經(jīng)驗以及學習與記憶等任務研究的范式。桶狀皮層(barrel cortex)是S1BF 中的一個特殊區(qū)域,約占體感皮層的20%,共分為六層,其Ⅳ層可見“barrel”的桶狀結構,每個“barrel”與嚙齒類動物的面部觸須具有一一對應的關系。研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)觸須識別的信號到達桶狀皮層Ⅳ層神經(jīng)元后進一步向上投射至II/III 層,該區(qū)域也是小鼠紋理識別任務主要的研究部位[23-25]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)p53 基因敲除小鼠對新紋理辨別能力減弱,即觸須敏感性受損,并除外了先天探索缺陷、自身焦慮、工作記憶障礙及自發(fā)運動對其的影響。為進一步探究其機制,我們對p53 基因敲除小鼠大腦桶狀皮層II/III 層神經(jīng)元進行定量分析,結果顯示p53 基因敲除小鼠該區(qū)域神經(jīng)元數(shù)目較野生型小鼠顯著減少。由于腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其下游的GAP-43 因子對桶狀皮層神經(jīng)元生長至關重要[26],p53 基因缺失導致GAP-43 表達下調[7,15]可能是神經(jīng)元數(shù)目減少的原因之一,進一步研究該信號通路對明確p53 在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用具有重要的意義。

綜上所述,本研究觀察了p53 基因敲除小鼠的情緒、認知、感覺及運動方面的神經(jīng)行為學測試結果,并初步探討了其細胞機制。我們的結果首次揭示了p53 基因缺失可導致小鼠觸覺行為異常,并初步分析這種異常與桶狀皮層II/III 層神經(jīng)元數(shù)目減少有關,為后期進一步探討這一內(nèi)在機制及p53 基因對神經(jīng)系統(tǒng)的作用提供了理論基礎。