利用CRISPR/Cas9技術(shù)研究玉米ZmFKF1在開花過程中的作用

楊敏，胥華偉，王翠玲，楊護，魏岳榮

利用CRISPR/Cas9技術(shù)研究玉米在開花過程中的作用

楊敏1，胥華偉2，王翠玲2，楊護1，魏岳榮1

1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/農(nóng)業(yè)部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室，廣州 510640；2河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南洛陽 471000

【】是多種植物開花途徑中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵基因。為研究玉米功能，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將進行定點編輯，獲得編輯突變體。同時以此為材料，通過表型分析及關(guān)鍵開花基因的表達(dá)量變化分析，明確在玉米開花途徑中的作用，為玉米分子育種及遺傳改良提供理論依據(jù)。以玉米B104為材料，克隆，通過序列比對明確的基因結(jié)構(gòu)。以為靶標(biāo)基因，根據(jù)CRISPR/Cas9技術(shù)原理設(shè)計靶點，將設(shè)計的靶點序列在玉米參考基因組中進行比對分析，排除非特異性靶位點，最終篩選出在第1外顯子上的靶位點ZmFKF1-T1，構(gòu)建CRISPR/Cas9基因編輯表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，轉(zhuǎn)化玉米B104幼胚，通過抗性篩選獲得抗性愈傷組織，之后誘導(dǎo)出芽和生根，獲得T0代編輯陽性植株，并利用特異引物進行驗證。利用靶位點擴增測序法，明確T1代編輯植株在預(yù)期靶標(biāo)位點是否發(fā)生突變及突變的類型，篩選獲得定點突變純合株系。獲得這些材料后，以野生型B104為對照，統(tǒng)計和分析開花表型。同時，利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測上述材料中與玉米開花途徑相關(guān)的關(guān)鍵基因的表達(dá)量變化，對表型進行進一步的驗證。在玉米的第1外顯子上設(shè)計靶點構(gòu)建基因編輯表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因株系實現(xiàn)了對的定點突變，共獲得T0代編輯陽性株系18株，在預(yù)期靶標(biāo)位點上發(fā)生突變的有6株，2種不同的突變類型：單堿基插入和多堿基缺失。通過開花時間統(tǒng)計和分析，與野生型B104相較，3個T2代編輯純合突變體的開花時間延遲，顯著（<0.05）晚于B104。進一步對這些材料中的開花關(guān)鍵基因、和進行表達(dá)量檢測，發(fā)現(xiàn)突變體中這些基因的表達(dá)明顯（<0.05）低于野生型B104，與晚花表型相符。可利用CRISPR-Cas9技術(shù)對進行定點編輯獲得基因編輯突變體，且突變體開花時間明顯延遲。

CRISPR/Cas9；基因編輯；玉米；；開花時間

0 引言

【研究意義】玉米是中國重要的糧食和飼料作物，由于育種種質(zhì)局限這一問題，使其在優(yōu)良品種選育、產(chǎn)量提高等方面面臨巨大挑戰(zhàn)。開花是植物生長過程的關(guān)鍵階段，也是熱帶玉米引種溫帶種植迫切需要解決的關(guān)鍵問題[1]。因此，研究玉米開花途徑關(guān)鍵基因的功能對于玉米分子育種、遺傳改良具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】F-box蛋白FKF1（FLAVINBINDING KELCH REPEAT F-BOX1）屬于ZTLs藍(lán)光受體家族，是一個包含PAS（LOV）域，F(xiàn)-box motif和Kelch重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白[2-3]。已有研究表明，在多種植物開花過程中發(fā)揮重要作用。在模式植物擬南芥中，通過FKF1-GI-CDF1---CO-FT途徑發(fā)揮作用，即：FKF1的LOV結(jié)構(gòu)域與GI互作形成復(fù)合體，其穩(wěn)定性受藍(lán)光調(diào)控；CDF1（CYCLING DOF FACTOR 1）是的轉(zhuǎn)錄抑制子，直接與的啟動子結(jié)合，阻礙的表達(dá)，抑制開花；FKF1和GI都能與CDF1互作，使CDF1在泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的作用下降解，從而促進表達(dá)[4-6]。在長日照條件下，和表達(dá)同步，能形成足夠的FKF1-GI復(fù)合物，在白天即能激活的轉(zhuǎn)錄，CO蛋白的穩(wěn)定性依賴于光，在光的存在下，傍晚時CO的積累即可達(dá)到峰值[7-8]，作用于下游開花基因（），促進開花[9-10]。另外，F(xiàn)KF1也可不依賴于與GI互作，通過LOV域與CO互作，使CO保持穩(wěn)定。即在擬南芥中，可以通過多種途徑調(diào)控表達(dá)，促進表達(dá)，進而促進開花[11]。而在短日照條件下，和不能同時表達(dá)，形成的FKF1-GI復(fù)合物較少，直到午夜轉(zhuǎn)錄本的積累才達(dá)到較高水平，但此時沒有光，處于較低水平，下游的表達(dá)也處于較低水平[3]，因而不能促進開花。在短日照植物水稻中，可通過下調(diào)和上調(diào)的表達(dá)，進而上調(diào)的表達(dá)，再繼續(xù)上調(diào)/，促進開花[12]。與擬南芥和水稻相比，玉米中克隆的開花基因相對較少，且大多數(shù)候選基因都是從同源分析獲得。在玉米第10染色體的10.04區(qū)域、第9染色體的9.05區(qū)域和第4染色體的4.09區(qū)域存在與開花時間或是光周期相關(guān)的主效QTL[13-19]。目前，第10染色體10.04區(qū)域內(nèi)的能夠極大地縮短開花時間，有效減弱玉米的光周期敏感性[20-21]。趙淑靚[22]初步確定第9染色體9.05區(qū)域參與開花的候選基因。而第4染色體的4.09區(qū)域的相關(guān)研究還未見報道，其中，是位于該區(qū)域內(nèi)可能與玉米開花相關(guān)的重要候選基因。之前，劉玲[23]開展了玉米光周期途徑中藍(lán)光響應(yīng)節(jié)律基因的分子進化與關(guān)聯(lián)分析研究，但并未對的具體作用進行深入研究。新近發(fā)展起來的基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)為基因功能的研究提供了更為便捷有效的途徑。CRISPR/Cas9是繼TALLEN、ZFN之后的一種新型高效定點編輯基因的新技術(shù)，近年來已成為廣大科研工作者試圖進行深入研究基因功能的技術(shù)熱點。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已在擬南芥[24]、水稻[25]、小麥[26]、棉花[27]、番茄[28]、楊樹[29]、蘋果[30]、西瓜[31]、葡萄[32]、芥藍(lán)[33]和柑橘[34]等植物上成功應(yīng)用。在玉米中，F(xiàn)eng等[35]利用已知功能的證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可用于玉米的基因功能研究?！颈狙芯壳腥朦c】是多種植物開花途徑中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵基因，但在玉米開花途徑中的作用還未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以玉米B104幼胚為受體材料，以為靶點，利用CRISPR/Cas9技術(shù)進行定點編輯，并對獲得的純合突變體進行表型分析和相關(guān)基因表達(dá)檢測驗證，明確的生物學(xué)功能。以期為玉米分子育種及遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料、主要載體及菌株

以玉米B104幼胚為受體材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法進行遺傳轉(zhuǎn)化。試驗材料采用常規(guī)種植與田間管理。sgRNA中間載體pYLgRNA-U6b、CRISPR/Cas9雙元載體由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光院士惠贈，試驗所用引物及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。Ⅰ購置于NEB公司，T4 DNA ligase和PrimeSTAR GXL DNA Polymerase購置于寶生物工程（大連）有限公司、KOD FX購置于東洋紡（上海）生物科技有限公司，其余分子試劑主要購置于天根生化科技（北京）有限公司和生工生物工程（上海）股份有限公司。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自天根生化科技（北京）有限公司；農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105購自北京華越洋生物有限公司。

1.2 ZmFKF1的克隆、蛋白功能域預(yù)測、進化樹分析、靶點選擇和基因編輯載體的構(gòu)建

參考Maize GDB（https://www.maizegdb.org/）網(wǎng)站玉米B104的序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計引物ZmFKF1-F/ZmFKF1-R（表1），以B104的cDNA為模板進行編碼序列CDS的克隆，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，通過序列比對明確的結(jié)構(gòu)。同時從NCBI下載ZmFKF1氨基酸序列，在SMART（http://smart.embl.de/）網(wǎng)站在線預(yù)測ZmFKF1的功能域。另外，為研究在進化過程中與其他物種間的親緣關(guān)系，從NCBI下載水稻（）、高粱（）、擬南芥（）、小米（）、小麥（）、大麥（）、甘蔗（）、大豆（）8個物種的FKF1氨基酸序列，利用MEGA7.0軟件對這8個物種及玉米FKF1進行氨基酸序列比對，繪制分子進化樹。

根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)識別原型間隔序列毗鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM）上游約20個核苷酸序列的特點，結(jié)合在線網(wǎng)站CRISPR-GE（http://skl.scau.edu.cn/）進行靶位點選擇。將設(shè)計的靶點序列在玉米參考基因組中比對分析，排除非特異性靶位點，最終篩選出在第1外顯子上的一個靶位點，序列為：5′-AGGTGGACGCGGAGCCGG GA-3′，該序列無潛在脫靶位點，將其命名ZmFKF1- T1，PAM序列為5′-TGG-3′。參照曾棟昌等[36]方法構(gòu)建單靶點編輯表達(dá)載體pYLCRISPR/Cas9- ZmFKF1-T1：（1）構(gòu)建含ZmFKF1-T1靶點的pYLgRNA- U6b載體：將接頭引物（FKF-U6b-F/FKF- U6b-R）（表1）變性后冷卻至室溫完成退火，然后經(jīng)一步酶切連接反應(yīng)將其接連到pYLgRNA-U6b載體上，并以此為模板進行包含2個反應(yīng)的第一輪PCR擴增：反應(yīng)1以U-F/FKF-U6b-R（表1）為引物，反應(yīng)2以FKF-U6b-F/gR-R（表1）為引物進行擴增。繼續(xù)以這兩個PCR擴增產(chǎn)物為模板，用特異引物Pps-R/ Pgs-L（表1）進行擴增，獲得含有ZmFKF1-T1靶點的sgRNA表達(dá)盒ZmFKF1-T1-sgRNA；（2）將ZmFKF1- T1-sgRNA表達(dá)盒克隆到pYLCRISPR/Cas9載體上：將PCR擴增獲得的ZmFKF1-T1-sgRNA表達(dá)盒與pYLCRISPR/Cas9質(zhì)?；旌?，用Ⅰ酶、T4 DNA ligase在PCR儀中進行邊酶切邊連接反應(yīng)；（3）轉(zhuǎn)化及測序驗證：將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落進行菌落PCR陽性檢測（引物SP-L1/SP-R，表1），并將PCR陽性菌液進行測序驗證，獲得編輯表達(dá)載體pYLCRISPR/ Cas9-ZmFKF1-T1。之后提取質(zhì)粒，將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105中，獲得的農(nóng)桿菌用于后續(xù)玉米幼胚轉(zhuǎn)化。

1.3 玉米B104幼胚遺傳轉(zhuǎn)化及抗性植株獲得

將活化后的農(nóng)桿菌菌液過夜培養(yǎng)，調(diào)節(jié)菌液OD600為0.3—0.4。取授粉后9—12 d的玉米穗，去掉外苞葉，在70%的乙醇中滅菌1 min，然后放在超凈臺上吹干。用手術(shù)刀切除玉米籽粒胚乳的2/3，剝?nèi)∮着撸ü踩?00粒幼胚，分2次轉(zhuǎn)化）。在22°C黑暗條件下，將未成熟的玉米胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)3 d，之后置于28℃，黑暗條件下進行2輪抗性篩選，首先在含有頭孢霉素（250 mg·L-1）和PPT（5 mg·L-1）進行第一輪抗性篩選14 d；其次頭孢濃度不變，提高PPT濃度到10 mg·L-1進行第二輪抗性篩選14 d，獲得抗性愈傷組織，之后誘導(dǎo)出芽，待到小苗長出2—3片葉，并且有主莖時，將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中生根，獲得抗性再生苗，在6—7葉期用0.125%（V/V）草銨膦涂抹篩選，除去敏感性植株，獲得抗性好的再生株系。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

分別以B104野生型和抗性再生株系葉片為材料，利用CTAB法提取T0代植株的DNA，使用特異引物Cas9-F/Cas9-R（表1）進行載體特異片段擴增，能擴增出目的片段的植株即為T0代轉(zhuǎn)基因陽性植株。篩選得到的T0代突變株自交結(jié)實后得到T1代種子，將T1代種子播種成苗移栽后提取葉片基因組DNA，跨ZmFKF1-T1靶點設(shè)計靶點檢測引物ZmCri-F/ZmCri-R（表1），其中，ZmCri-F位于靶點上游197 bp（DNA序列），ZmCri-R位于靶點下游216 bp（DNA序列），使用該引物進行PCR擴增、測序及比對分析，確定編輯突變體的突變類型，并篩選純合突變單株。對上述篩選的純合突變體自交加代，獲得T2代編輯突變體進行表型分析。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株的表型分析及開花相關(guān)基因的表達(dá)量檢測

花期性狀統(tǒng)計與分析：采用隨機分區(qū)設(shè)計種植3個編輯純合突變體和野生型B104對照，3個重復(fù)，每個小區(qū)中各基因型株系種5行，每行6株。從每個轉(zhuǎn)基因株系和野生型中隨機選取10株，對抽雄、吐絲及散粉時間進行表型分析和統(tǒng)計，取平均值，并進行方差和值分析。抽雄時間表示播種后至雄穗尖端露出約2 cm的天數(shù)；散粉時間表示播種至雄穗開始散粉的天數(shù)；吐絲時間表示播種至植株花絲從苞葉突出的天數(shù)。

玉米開花關(guān)鍵基因的檢測：分別以編輯純合突變體、B104玉米材料的cDNA為模板，以玉米為內(nèi)參基因，利用實時熒光定量PCR檢測不同基因型材料中開花相關(guān)重要基因的表達(dá)情況，包括[37]、[38]和[39]，引物見表1。試驗重復(fù)3次。利用2-ΔΔCT方法計算基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 ZmFKF1的克隆與pYLCRISPR/Cas9-ZmFKF1表達(dá)載體的構(gòu)建

以玉米B104的cDNA為模板，以ZmFKF1-F/ ZmFKF1-R為引物，PCR擴增、測序獲得的cDNA序列，序列大小為1 857 bp。參考MaizeGDB上的序列，通過DNA與cDNA序列比對發(fā)現(xiàn)，含有1個內(nèi)含子和2個外顯子，長度分別為940、256和1 601 bp（圖1-A）。通過比對ZmFKF1和其他8個物種FKF1的氨基酸序列結(jié)果表明，ZmFKF1與高粱、甘蔗中的FKF1親緣關(guān)系最近（圖1-B）。

根據(jù)CRISPR/Cas9技術(shù)原理，結(jié)合的cDNA序列，利用在線網(wǎng)站CRISPR-GE（http://skl. scau.edu.cn/）進行靶位點選擇，最終在第1外顯子上篩選到一個靶位點ZmFKF1-T1。然后利用酶切連接、PCR擴增等方法將ZmFKF1-T1與sgRNA表達(dá)盒連接，再將連接成功的ZmFKF1-T1-sgRNA表達(dá)盒組裝到pYLCRISPR/Cas9表達(dá)載體上（圖1-C）。組裝好的ZmFKF1-T1-sgRNA表達(dá)盒由OsU6b啟動子驅(qū)動，Cas9由Ubi啟動子驅(qū)動（圖1-C）。

A：靶位點在ZmFKF1中的位置；B：9個物種的FKF1分子進化樹分析；C：pYLCRISPR/Cas9-ZmFKF1-T1質(zhì)粒T-DNA區(qū)示意圖

2.2 玉米B104幼胚遺傳轉(zhuǎn)化

分離獲得未成熟B104幼胚，將分離好的幼胚與攜帶pYLCRISPR/Cas9-ZmFKF1-T1表達(dá)載體的農(nóng)桿菌進行共培養(yǎng)3 d（圖2-A），之后轉(zhuǎn)入抗性培養(yǎng)基進行抗性篩選，獲得初生抗性愈傷組織（圖2-B），提高篩選試劑PPT濃度，進一步進行誘導(dǎo)篩選，獲得抗性愈傷組織（圖2-C），之后誘導(dǎo)出芽和生根（圖2-D和圖2-E），獲得抗性再生苗，待生長至6—7葉期，用草銨膦涂抹葉片，除去敏感性株系，共獲得18個抗性植株。

A：幼胚；B：初生愈傷組織；C：抗性愈傷組織；D：再生抗性芽；E：再生抗性苗

2.3 ZmFKF1編輯植株的分子鑒定

提取18株抗性植株及野生型B104葉片基因組DNA，利用載體特異引物Cas9-F及Cas9-R進行PCR擴增，結(jié)果顯示，野生型未擴增出目的片段，18株抗性植株都可以擴增出目的條帶。共選取了200粒幼胚進行遺傳轉(zhuǎn)化，所以陽性率為9.00%（圖3-A）。

收獲T0代種子大田種植，18個獨立株系各種植15株，分別提取葉片DNA，使用靶位點上下游特異引物ZmCri-F/ZmCri-R進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行測序。結(jié)果表明，在18個獨立株系中有6個在靶點位置發(fā)生不同類型的編輯，包括單堿基插入和多堿基缺失2種類型，編輯效率為33.33%，同時獲得了3個純合突變體（表2和圖3）。

2.4 ZmFKF1編輯突變體的氨基酸序列預(yù)測分析

為了更好地說明6個在靶點位置發(fā)生編輯的突變體對靶標(biāo)基因編碼蛋白的影響，對編輯突變體的氨基酸序列進行了預(yù)測分析。首先，對玉米ZmFKF1功能域進行了預(yù)測（圖4-A），ZmFKF1包含1個PAS（LOV）域，由第37—107位的氨基酸編碼；1個F-box域，由第205—253位的氨基酸編碼；4個Klech重復(fù)結(jié)構(gòu)域，分別由第300—351、352—405、415—466、517—566位氨基酸編碼。同時對C1-6、C2-12、C3-3、C5-7、C6-2和C7-1突變體編碼蛋白的氨基酸序列進行預(yù)測比對，發(fā)現(xiàn)C1-6、C3-3、C6-2和C7-1都在PAS（LOV）域起始位置前后發(fā)生了氨基酸突變或缺失；而C2-12和C5-7在該功能域發(fā)生氨基酸突變的同時還由于移碼突變造成了氨基酸編碼提前終止（圖4-B）。

2.5 ZmFKF1編輯突變體的表型分析及開花相關(guān)基因的檢測

為檢測編輯后對玉米開花的影響，選擇3個T2代編輯純合株系C2-12、C6-2和C7-1進行大田種植、花期表型記錄和分析。結(jié)果顯示，野生型B104的抽雄時間、散粉時間和吐絲時間分別為62.70、67.87和70.53 d；C2-12分別為63.43、69.13和72.57 d；C6-2分別為64.07、69.37和71.90 d；C7-1分別為63.96、69.04和72.33 d。即在開花的3個時期，C2-12、C6-2和C7-1都比野生型B104晚，初步確定正調(diào)控玉米的開花過程（圖5和表3）。

為了驗證這一結(jié)果，又檢測了C2-12、C6-2和C7-1中玉米開花關(guān)鍵基因、和的表達(dá)情況（圖5-C），在3個基因編輯突變體中，、和的表達(dá)量明顯下調(diào)（<0.05），在C2-12中分別下調(diào)4.7、3.4和1.7倍，在C6-2中分別下調(diào)1.6、2.1和1.5倍，在C7-1中分別下調(diào)1.5、1.6和1.6倍。說明發(fā)生基因編輯之后，下游基因、和的表達(dá)量均下調(diào)，這一結(jié)果與C2-12、C6-2和C7-1開花延遲的表型相吻合。

表2 ZmFKF1編輯突變體突變類型分析

加粗字體表示PAM序列，下劃線處表示插入的堿基，+表示堿基插入，-表示堿基缺失，---表示野生型，無變化

The bold font represented PAM sequence. The underlined base indicated the insertion base. + represented base insertion, - indicated base deletion, --- represented wild type (B104)

A：ZmFKF1編輯植株的陽性鑒定；B：ZmFKF1編輯純合體測序結(jié)果

A：ZmFKF1蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果；B：ZmFKF1編輯突變體的氨基酸序列預(yù)測分析及比對結(jié)果

表3 不同基因型植株玉米抽雄時間、吐絲時間和散粉時間的統(tǒng)計

采用隨機分區(qū)設(shè)計種植3個編輯純合突變體和野生型B104對照，3個重復(fù)，每個小區(qū)中各基因型株系種5行，每行6株。隨機選取各基因型株系0株進行表型統(tǒng)計分析，取平均值，并進行方差和值分析。*表示在0.05水平差異顯著

Threegene editing homozygous mutants and wild type B104 were planted in a random area design, with 3 replicates. There were 5 lines of each genotype in each plot, with 6 plants in each row. 10 strains of each genotype were randomly selected for phenotypic statistical analysis. The average value was taken, and the variance andvalue were analyzed. * indicate significant difference at 0.05 level

3 討論

玉米開花是由多基因控制的，表現(xiàn)數(shù)量性狀的遺傳特點。近年來，隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，數(shù)量性狀基因定位工作發(fā)展很快。研究者們在不同的環(huán)境、利用不同的材料、不同的世代群體在玉米第10染色體的10.04區(qū)域、第9染色體的9.05區(qū)域和第4染色體的4.09區(qū)域檢測到了開花時間或是光周期主效QTL的存在[13-19]，說明在這些區(qū)域很可能包含重要的反應(yīng)因子，與玉米開花性狀緊密相關(guān)。目前，第10染色體10.04區(qū)域是玉米光周期敏感性課題普遍關(guān)注的熱點，已有研究表明在這一區(qū)域內(nèi)含有參與光周期途徑的重要基因，該基因能夠極大地縮短開花時間，有效減弱玉米的光周期敏感性[20-21]。趙淑靚[22]開展了對第9染色體9.05區(qū)域主效QTL位點的精細(xì)定位及候選基因克隆，確定了該區(qū)域的重要候選基因。而第4染色體4.09區(qū)域的研究工作還未見報道，即位于該區(qū)域內(nèi)，編碼一個與擬南芥FKF1同源的蛋白。已有研究表明該基因在擬南芥和水稻的開花過程中發(fā)揮重要作用[3,12]，暗示可能在玉米開花途徑中發(fā)揮作用。

A：C7-1和B104在播種后67 d的表型；B：C7-1和B104在播種后70 d的表型；C：不同基因型材料中開花關(guān)鍵基因的表達(dá)情況，其中ZmUbi為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCT方法計算基因相對表達(dá)量結(jié)果

CRISPR/Cas9技術(shù)是目前最前沿的基因編輯技術(shù)，具有載體構(gòu)建簡便易行，靶點選擇廣泛，打靶效率高等優(yōu)勢，該系統(tǒng)在植物中已有深入研究，但在玉米中的應(yīng)用還不多。本研究以B104為材料，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對可能在玉米開花途徑中發(fā)揮重要作用的進行定點編輯，以B104幼胚為受體材料，獲得了18株抗性再生苗，陽性率為9.00%，18株陽性苗中有6個在靶標(biāo)位點編輯的株系，包括2種不同突變類型，編輯效率為33.33%，陽性效率與編輯效率與Feng等[35]報道的基本一致。之前的研究表明CRISPR/Cas9編輯效率與環(huán)境溫度和利用不同的特異啟動子有關(guān)[35,40]。從對的編輯效率結(jié)果來看本研究使用的遺傳轉(zhuǎn)化條件和啟動子的選擇都是合理且有效的，實現(xiàn)了對玉米的定點編輯。

在獲得玉米的定點編輯突變體后，本研究對獲得的6個在靶點位置發(fā)生編輯的突變體進行了氨基酸序列預(yù)測分析，并與野生型B104ZmFKF1氨基酸序列進行了比對，發(fā)現(xiàn)所有的突變體都在靠近ZmFKF1的PAS（LOV）功能域的位置發(fā)生了移碼突變或氨基酸缺失，其中C2-12和C5-7在靶點位置的編輯還導(dǎo)致了幾乎整個PAS區(qū)域的氨基酸突變及提前終止，而FKF1蛋白的PAS域被作為信號傳感器結(jié)構(gòu)域，在蛋白功能發(fā)揮及蛋白互作中發(fā)揮重要作用[3-5]。本研究選擇3個編輯純合株系C2-12、C6-2和C7-1進行表型分析，既有ZmFKF1 PAS域提前終止也有氨基酸突變的編輯類型，發(fā)現(xiàn)這3個純合體都表現(xiàn)出一定的晚花表型，雖然表型相對較弱。表型相對較弱可能與玉米開花受多基因調(diào)控，表現(xiàn)數(shù)量性狀遺傳的特點有關(guān)。同時，進一步檢測了在玉米開花途徑中發(fā)揮重要作用，且與擬南芥、和同源的3個關(guān)鍵基因、和的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)這些基因在3個突變體中明顯下調(diào)，與開花延遲的表型相符，進一步確定在玉米開花途徑中發(fā)揮作用。通過對3個純合突變體的表型分析，發(fā)現(xiàn)相較C6-2和C7-1突變體，C2-12突變體中關(guān)鍵開花基因的表達(dá)量變化更為顯著，這可能與C2-12在靶點位置的編輯導(dǎo)致了PAS幾乎整個區(qū)域的氨基酸突變及提前終止，從而使完全不能發(fā)揮作用有關(guān)。即的不同編輯方式可能造成了突變體表型強弱的不同。后續(xù)，筆者將以現(xiàn)有的其他幾種基因編輯突變體為材料，繼續(xù)篩選更多不同突變類型的純合系，解析不同位點突變對玉米開花時間的影響。

在長日照模式植物擬南芥中，受生物節(jié)律鐘的調(diào)控，F(xiàn)KF1蛋白可被藍(lán)光激活，與GI在光周期開花過程中通過FKF1-GI-CDF1---CO-FT這條途徑調(diào)控開花[3-11]。而在短日植物水稻中，OsFKF1也被發(fā)現(xiàn)并深入研究，有意思的是，OsFKF1可能是一種自主的開花激活因子，可以不依賴于光周期促進開花，其作用機制為：通過下調(diào)和上調(diào)的表達(dá)，進而上調(diào)表達(dá)，再通過上調(diào)/促進水稻的開花，但是并不影響（擬南芥的同源基因）和（擬南芥的同源基因）的表達(dá)，即：在水稻中，是通過-/這條途徑調(diào)控開花，而不是通過與擬南芥相似的這條經(jīng)典途徑。盡管在水稻中，也發(fā)現(xiàn)OsFKF1能與OsGI互作，但是激活的是（在擬南芥中不存在同源基因），而不是與擬南芥同源的，這說明水稻OsFKF1與OsGI的互作與擬南芥作用機制不同，應(yīng)該另有它用[12]。同時，從水稻OsFKF1的作用途徑來看，該基因所調(diào)控的、和在擬南芥中都是找不到同源基因的。這些結(jié)果說明，在短日照植物水稻和長日照植物擬南芥中的調(diào)控方式不同。而本文通過基因編輯玉米發(fā)現(xiàn)，突變后，在廣州短日照地區(qū)是晚花的，那么這些突變體在北方長日照地區(qū)是否也具有晚花表型，是否依賴光周期發(fā)揮作用，這些都是后續(xù)關(guān)注和研究的方向。進一步在突變體中檢測到、和的表達(dá)量下調(diào)，說明與這些玉米開花關(guān)鍵基因緊密相關(guān)，但是通過與擬南芥類似的信號通路調(diào)控開花，還是有其獨特的調(diào)控方式，這些詳細(xì)的作用機制需要繼續(xù)深入研究，這也是筆者后續(xù)研究的主要內(nèi)容。以上這些問題的逐步解析將為闡明的分子作用機制，豐富玉米開花途徑和生產(chǎn)實踐提供重要的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

利用CRISPR/Cas9技術(shù)對玉米材料B104的進行定點編輯，獲得不同類型的基因編輯突變植株，明確了在玉米開花過程中的正調(diào)控作用。利用CRISPR/Cas9技術(shù)研究玉米基因功能是一條非常高效的途徑。

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Using CRISPR/Cas9-mediated Targeted Mutagenesis ofDelayed Flowering Time in Maize

YANG Min1, XU Huawei2, WANG Cuiling2, YANG Hu1, WEI Yuerong1

1Institute of Fruit Tree Research, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/ Key Laboratory of South Subtropical Fruit Biology and Genetic Resource Utilization (MOA)/Guangdong Province Key Laboratory of Tropical and Subtropical Fruit Tree Research, Guangzhou 510640;2College of Agriculture, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471000, Henan

【】is a key gene that plays an important role in many plant flowering pathways. In order to study the function ofediting mutants were obtained by using CRISPR/cas9 technology. In this study, we used these mutants as materials to clarify the role of【】gene was cloned from B104, and its structure was determined by sequence alignment. The targeted sequences ofwere designed according to the principle of CRISPR/Cas9 technology, then these targeted sequences were compared and analyzed in maize reference genome, and the non-specific target site was excluded. Finally, ZmFKF1-T1 on exon 1 ofwas selected to construct CRISPR/cas9 gene editing expression vector. At the same time, B104 immature embryos were selected as explants to transform by-mediated genetic transformation, the resistant calli were obtained through resistance screening, and then buds and roots were induced. The T0generationgene editing positive plants were obtained and verified by using the specific primers of. The target site amplification and sequencing analysis was used to determine whether the T1transgenic lines had mutation at the expected target site ofand the type of mutation, and screened the homozygous lines ofsite mutation. After obtaining the above materials, the flowering phenotypes of these materials were statistically analyzed with wild type as control. At the same time, qRT-PCR was used to detect the expression of key genes that related to flowering pathway in the above materials and further verify the phenotype.【】The target sequence was designed on exon1 ofto construct gene editing expression vector. The transgenic lines were obtained by genetic transformation realized site directed mutagenesis of.A total of 18 T0generationgene-edited lines were obtained, and 6 of them were generated mutation on the exon1 with two different mutations types, including single base insertion and multiple bases deletion. The phenotype analysis shown that the flowering time of three T2generationhomozygous lines was delayed compared with wild type B104. Furthermore, the expression levels of three related flowering pathway genes (,and) in the mutants were significantly lower than those in the wild type B104 (<0.05), which was consistent with the late flowering phenotype of the mutants. 【】CRISPR/Cas9 technology can be used to editto obtain gene editing mutants, and the flowering time of these mutants is significantly delayed compared to wild type.

CRISPR/Cas9; gene editing; maize;; flowering time

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.04.003

2020-07-25；

2020-09-23

國家自然科學(xué)基金青年基金（31700252）、河南省高等學(xué)校重點科研項目（17A180002）、河南省重點研發(fā)與推廣專項（科技攻關(guān)）（202102110010）

楊敏，E-mail：minyang_0123@126.com。通信作者魏岳榮，E-mail：weid18@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）