李天聰，朱行，魏寧，龍鳳，武建穎，張燕，董金皋，申珅，郝志敏,2

玉米大斑病菌SC35同源基因表達(dá)規(guī)律與互作分析

1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071001；2“華北作物改良與調(diào)控”國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071001；3河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北保定 071001

【】獲得玉米大斑病菌（）SC35類(lèi)剪接因子的基因，并分析該基因家族之間的相互作用及在病菌不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期與侵染過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律，為明確剪接因子SC35家族與真菌生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系打下基礎(chǔ)。以擬南芥（）編碼的氨基酸序列為探針序列，在玉米大斑病菌全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源比對(duì)，獲得玉米大斑病菌中潛在的SC35蛋白；利用生物信息學(xué)方法對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析；分別收集接種在感病玉米葉片表面不同時(shí)間及玉米大斑病菌菌絲、分生孢子、芽管、附著胞及侵入絲等不同發(fā)育時(shí)期的材料，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)分析在對(duì)玉米葉片侵染不同時(shí)間及不同發(fā)育時(shí)期可變剪接因子的轉(zhuǎn)錄水平；利用酵母雙雜交技術(shù)明確玉米大斑病菌可變剪接因子之間的相互作用。在玉米大斑病菌中獲得了8個(gè)潛在的SC35類(lèi)蛋白基因，其編碼的氨基酸具有典型的SR蛋白（Ser-Arg rich protein）結(jié)構(gòu)域，而StSC1 C端具有2個(gè)RRM基序。8個(gè)基因位于染色體組的不同物理位置，不具有連鎖關(guān)系。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明8個(gè)剪接因子分布于不同進(jìn)化支，同源性較低。在病菌侵染寄主葉片過(guò)程中，、、、、、在侵染18 h時(shí)表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)，呈下調(diào)趨勢(shì)，在6—18 h表現(xiàn)出較高表達(dá)活性；不同生長(zhǎng)時(shí)期中，在病菌附著胞及侵染絲形成時(shí)期表達(dá)水平極顯著上調(diào)（＜0.001），是分生孢子時(shí)期的24.44、8.25倍，其余7個(gè)可變剪接因子在病菌的生長(zhǎng)過(guò)程中表達(dá)水平均呈下調(diào)趨勢(shì)。酵母雙雜交結(jié)果表明StSC4與StSC6、StSC3與StSC8、StSC3與StSC4、StSC8與StSC4有體外互作關(guān)系。在玉米大斑病菌侵染過(guò)程中及不同發(fā)育時(shí)期可變剪接因子的表達(dá)模式不同，在病菌整個(gè)侵染過(guò)程均活躍表達(dá)；、和對(duì)病菌附著胞和侵入絲的形成發(fā)揮比較重要的調(diào)控作用；StSC4與StSC6、StSC3與StSC8、StSC3與StSC4、StSC8與StSC4通過(guò)互作，調(diào)控剪接復(fù)合體的形成。

玉米大斑病菌；可變剪接因子；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；酵母雙雜交

0 引言

【研究意義】玉米大斑病菌（）是一種侵染玉米葉片的絲狀真菌。目前對(duì)玉米大斑病的防治主要以抗病品種利用為主，由于致病菌突變頻率高、生理分化明顯，給大斑病防治帶來(lái)較大難度[1-2]。前體mRNA的可變剪接（alternative splicing）可通過(guò)不同調(diào)控元件與剪接因子相互作用之后產(chǎn)生不同的剪切、拼接結(jié)果，是真核生物中一種比較靈活的基因表達(dá)調(diào)控方式[3]。明確玉米大斑病菌致病過(guò)程中剪接因子所發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用，將為尋找病害防控新策略提供思路?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】1977年，ROBERTS和SHARP首次發(fā)現(xiàn)基因是分裂而不連續(xù)的[4]。20世紀(jì)80年代初，MAKI等發(fā)現(xiàn)在真核生物小鼠編碼免疫球蛋白重鏈的基因中存在可變剪接現(xiàn)象[5]。在對(duì) RNA剪接的研究過(guò)程中，人們還發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)起重要作用的非snRNP剪切因子——SR蛋白[6]。隨后，可變剪接現(xiàn)象在植物和動(dòng)物中被廣泛發(fā)現(xiàn)，但在病原真菌中鮮有報(bào)道。隨著生物信息技術(shù)的發(fā)展，使得在植物病原真菌基因組和轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)研究可變剪接成為可能?，F(xiàn)在公認(rèn)的SR蛋白有12種，包括SRSF1（ASF/SF2）、SRSF2（SC35）、SRSF3（SRp20）、SRSF4（SRp75）、SRSF5（SRp40）、SRSF6（SRp55）、SRSF7（9G8）、SRSF2B（SRp46）、SRSF9（SRp30c）、SRSF13A（SRp38）、SRSF11（SRp54）、SRSF13B（SRrp35）[7]。剪切因子SC35最初是FU等在哺乳動(dòng)物細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)的一種非snRNP類(lèi)蛋白剪切組分，分子量為35 kD，其N(xiāo)端主要由具有結(jié)合RNA能力的RNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域組成（RNA-recognition motif，RRM）；其C端含有大量的SR/RS（S-絲氨酸、R-精氨酸）二肽重復(fù)序列，即RS結(jié)構(gòu)域[8]。關(guān)于SC35在動(dòng)物細(xì)胞的分布已得到了廣泛和深入的研究，體外實(shí)驗(yàn)表明，其在剪切位點(diǎn)的選擇及剪切復(fù)合體的組裝上起至關(guān)重要的作用，并在轉(zhuǎn)錄延伸過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用[9-11]。與正常組織相比，頭頸癌細(xì)胞中SFRS2（SC35）表達(dá)水平上調(diào)，促進(jìn)了腫瘤抑制基因——鈣黏附蛋白E（）前體mRNA第11個(gè)外顯子跳躍，從而造成E-cadherin前體mRNA錯(cuò)誤剪接[12]。在乳腺癌細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)有助于細(xì)胞膜糖蛋白CD44 C5-V6-C6亞型的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的侵染和轉(zhuǎn)移[13]。Yan等對(duì)擬南芥（）SC35編碼基因進(jìn)行了敲除，發(fā)現(xiàn)突變體的形態(tài)和生長(zhǎng)過(guò)程均受到影響，包括出現(xiàn)鋸齒狀葉片、延遲開(kāi)花、短根和異常的葉序；進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，SC35蛋白能夠結(jié)合在RNA序列的特定位點(diǎn)AGAAGA上，此外，敲除也影響著基因的轉(zhuǎn)錄，且SC35與RNA聚合酶Ⅱ的特定亞族NRPB4有相互作用[14]。目前，有關(guān)絲狀真菌中SC35的研究報(bào)道極少，僅在構(gòu)巢曲霉（）中發(fā)現(xiàn)SR蛋白（swoK）與菌絲的極性生長(zhǎng)和細(xì)胞壁的正常發(fā)育有關(guān)[15]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】剪切因子SC35是RNA轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)節(jié)因子。前期通過(guò)全基因組的同源搜索和分析發(fā)現(xiàn)在玉米大斑病菌中存在豐富的可變剪接調(diào)控蛋白，轉(zhuǎn)錄組學(xué)的初步分析也證實(shí)了玉米大斑病菌RNA可變剪接事件的存在，在此基礎(chǔ)上本研究對(duì)該病菌SC35家族的剪接因子進(jìn)行結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式及互作關(guān)系的分析。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用生物信息學(xué)手段從玉米大斑病菌全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取SC35，并對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行分析，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)SC35在病菌不同發(fā)育時(shí)期及在侵染寄主過(guò)程中的表達(dá)模式進(jìn)行系統(tǒng)檢測(cè)，并對(duì)其互作關(guān)系進(jìn)行分析，為深入探究剪切因子SC35在調(diào)控病菌致病力方面的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 供試菌株及寄主

玉米大斑病菌野生型菌株01-23、玉米自交系B73的抽雄期新鮮葉片、大腸桿菌（）DH5、酵母雙雜交試驗(yàn)用菌株釀酒酵母（）AH109及載體pGADT7（AD）、pGBKT7（BD）均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要培養(yǎng)基及試劑

PDA培養(yǎng)基、水瓊脂培養(yǎng)基、玻璃紙、YPD培養(yǎng)基、二缺培養(yǎng)基、三缺培養(yǎng)基、四缺培養(yǎng)基；總RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司。PrimeScript?RT reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒，SYBR? Premix Ex TaqTMII（Perfect Real Time）和T4 DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa（中國(guó)大連）公司，2×TransStart? FastPfu PCR SuperMix（-dye）購(gòu)自全式金（北京）公司，BM無(wú)縫克隆試劑盒（CL116-01）購(gòu)自博邁德（北京）公司，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 玉米大斑病菌SC35同源蛋白的生物信息學(xué)分析

利用網(wǎng)站（https://mycocosm.jgi.doe.gov/mycocosm/ home）上公布的玉米大斑病菌全基因組序列和相應(yīng)的注釋信息，與擬南芥中SC35蛋白（Q9FYB1）做同源比對(duì)，選取相似性較高的基因。利用在線(xiàn)工具SMART（http://smart.embl.de/）、NCBI CD-Search（https://www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對(duì)SC35蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，利用MEGA7.0軟件對(duì)玉米大斑病菌的SC35同源蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)，并采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.4 不同發(fā)育時(shí)期和侵染時(shí)間的病菌材料收集

玉米大斑病菌不同發(fā)育時(shí)期的材料收集參考賈慧等[16]的方法，將野生型菌株01-23接種于PDA培養(yǎng)基，25℃黑暗培養(yǎng)10 d后，輕輕刮取菌落表面收集菌絲；將在同樣培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)15 d后的菌株平皿中加入10 mL無(wú)菌水，然后輕輕刮取菌落表面，經(jīng)兩層紗布過(guò)濾后離心并收集分生孢子；將上述收集的分生孢子調(diào)整成濃度為104個(gè)/mL的孢子懸浮液，接種2 mL于在水瓊脂培養(yǎng)基表面平鋪的玻璃紙上，分別在接種后3 h（芽管時(shí)期）、12 h（附著胞時(shí)期）、24 h（侵入絲時(shí)期）離心收集菌體，此時(shí)80%以上的分生孢子發(fā)育到相應(yīng)時(shí)期。按照上述收集方法將濃度為104個(gè)/mL的病菌孢子懸浮液以20 μL/滴的液滴接種至玉米葉片表面，分別收集侵染后1、3、6、9、12、15和18 h的菌液，再次離心富集菌體。

1.5 SC35同源基因的表達(dá)規(guī)律分析

利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/）設(shè)計(jì)qRT-PCR的引物（表1），以為參照基因。用Trizol試劑盒提取各材料的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，以各時(shí)期cDNA為模板，AugeGreenTMqPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。根據(jù)基因相對(duì)表達(dá)量分析方法2-ΔΔCt，對(duì)不同發(fā)育時(shí)期及侵染寄主過(guò)程中的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每組數(shù)據(jù)重復(fù)3次。采用Excel 2010和IBM SPSS Statistics v20軟件制作圖表。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物序列

1.6 玉米大班病菌SC35同源蛋白互作分析

利用BioEdit軟件對(duì)各個(gè)基因序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，并通過(guò)NEBuilder（https://nebuilder.neb.com/）和Primer 5.0設(shè)計(jì)引物（表2），按照2×TransStart FastPfu PCR SuperMix試劑說(shuō)明擴(kuò)增目的基因。采用BM無(wú)縫克隆試劑盒構(gòu)建各個(gè)基因與pGADT7質(zhì)粒的表達(dá)載體。使用R I和H I分別對(duì)pGADT7載體的重組質(zhì)粒及pGBKT7原載體進(jìn)行雙酶切后，用T4 DNA連接酶構(gòu)建各基因與pGBKT7載體的重組質(zhì)粒。采用醋酸鋰法[17]制備酵母感受態(tài)并進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

表2 酵母雙雜交試驗(yàn)所用引物

2 結(jié)果

2.1 玉米大斑病菌SC35同源蛋白的獲取

通過(guò)對(duì)玉米大斑病菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https:// mycocosm.jgi.doe.gov/pages/blast-query.jsf?db =Settu1）同源比對(duì)，搜索出8個(gè)與擬南芥中SC35蛋白同源的玉米大斑病菌蛋白，分別命名為StSC1、StSC2、StSC3、StSC4、StSC5、StSC6、StSC7和StSC8，這8個(gè)基因分別位于染色體組的不同物理位置，不具有連鎖關(guān)系（表3）。

2.2 玉米大斑病菌SC35的生物信息學(xué)分析

2.2.1 SC35蛋白結(jié)構(gòu)分析 玉米大斑病菌的剪接因子SC35與其他物種SR蛋白結(jié)構(gòu)相似（圖1），N端具有1個(gè)典型的RNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域RRM1，C端具有隨機(jī)排列組成的SR/RS重復(fù)序列，此外有的蛋白內(nèi)部可能還存在亞結(jié)構(gòu)域RRM2。剪接因子StSC1與其他SR蛋白明顯不同的是它具有兩個(gè)靠近C端的RRM結(jié)構(gòu)域，類(lèi)似的結(jié)構(gòu)特征還未有研究報(bào)道。剪接因子StSC2 N端具有eIF-3G結(jié)構(gòu)域，eIF3參與細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的調(diào)控，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中由約13個(gè)亞基組成，分子量在550—700 kD，是一種非特異性RNA結(jié)合蛋白[18]，推測(cè)StSC2可能主要在玉米大斑病菌中某些蛋白質(zhì)翻譯起始過(guò)程發(fā)揮作用。

表3 玉米大斑病菌SC35的蛋白信息

圖1 玉米大斑病菌SC35蛋白結(jié)構(gòu)示意圖

2.2.2 SC35進(jìn)化分析 由于SR蛋白在真菌中的研究很少，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)發(fā)現(xiàn)除StSC3與StSC4有較近親緣關(guān)系外，其他剪接因子之間分支明顯，不具有同源性（圖2）。其中剪接因子StSC6與番茄匍柄霉（）中富含甘氨酸的RNA結(jié)合蛋白聚于同一分支，StSC2與穿孔陷球殼（）等多種真核生物翻譯起始因子eIF-3G同源，StSC8與鏈格孢（）中富含絲氨酸結(jié)構(gòu)域（RNPS1）的RNA結(jié)合蛋白聚于同一分支；StSC1和StSC7分別與小麥核腔菌（）和禾谷鐮孢（）聚于同一分支，與代表RNA結(jié)合的蛋白同源；StSC5與裂殖酵母（）中具有RRM結(jié)構(gòu)域的RNA結(jié)合蛋白親緣關(guān)系較近；StSC3與粗糙脈孢菌（）中注釋為U2 snRNP功能的蛋白同源且親緣關(guān)系較近，StSC4與裂殖酵母中假定的U1 snRNP具有同源性，說(shuō)明它們可能是剪接體復(fù)合物的一部分，可能會(huì)在某個(gè)階段影響U1或U2蛋白對(duì)mRNA的識(shí)別。

2.3 病菌不同發(fā)育時(shí)期和侵染寄主不同時(shí)間SC35基因表達(dá)規(guī)律

2.3.1 不同發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)量分析 統(tǒng)計(jì)分析玉米大斑病菌各生長(zhǎng)時(shí)期可變剪接因子的表達(dá)量，定義菌絲生長(zhǎng)時(shí)期各個(gè)基因的表達(dá)量為1，發(fā)現(xiàn)各基因在分生孢子、芽管、附著胞和侵入絲時(shí)期均有表達(dá)（圖3）。整體來(lái)說(shuō)、、、、、、表達(dá)量呈下調(diào)趨勢(shì)，轉(zhuǎn)錄活性低于菌絲時(shí)期；呈現(xiàn)下調(diào)-上調(diào)-下調(diào)的趨勢(shì)，在附著胞時(shí)期表達(dá)量最高，是分生孢子時(shí)期的24.44倍，在侵入絲形成時(shí)期表達(dá)量極顯著下調(diào)（＜0.001），但仍高于其他時(shí)期，和表達(dá)量極顯著上調(diào)（＜0.001），但稍低于菌絲時(shí)期；和在侵入絲時(shí)期比較活躍，說(shuō)明它們可能參與病菌侵染結(jié)構(gòu)的形成，對(duì)致病性具有重要調(diào)控作用。

2.3.2 侵染寄主不同時(shí)間基因表達(dá)量分析 在玉米大斑病菌的分生孢子侵染玉米葉片過(guò)程中，定義侵染1 h時(shí)的表達(dá)量為1，此時(shí)分生孢子未萌發(fā)（圖4）。其中、、和表達(dá)模式一致，呈現(xiàn)下調(diào)-上調(diào)-下調(diào)-上調(diào)-下調(diào)-上調(diào)的趨勢(shì)，在侵染后期18 h時(shí)表達(dá)最活躍（＜0.001），分別是分生孢子時(shí)期的1.72、3.90、6.32、16.00倍，此時(shí)分生孢子開(kāi)始產(chǎn)生侵入絲，說(shuō)明這4個(gè)可變剪接因子對(duì)侵入絲的形成具有重要的調(diào)控作用，雖然、和在侵染過(guò)程中表達(dá)量一直在改變但變化幅度很??；和表達(dá)變化水平和趨勢(shì)一致，呈現(xiàn)上調(diào)-下調(diào)-上調(diào)-下調(diào)-上調(diào)的趨勢(shì)，5、和在侵染前期3 h時(shí)表達(dá)量最高（＜0.001），分別是分生孢子時(shí)期的13.60、13.60和2.94倍，此時(shí)分生孢子開(kāi)始萌發(fā)產(chǎn)生芽管，說(shuō)明這3個(gè)剪接因子在芽管發(fā)育初期發(fā)揮重要作用；6 h時(shí)芽管頂端開(kāi)始生成附著胞，、和表達(dá)量下調(diào)，的表達(dá)量極顯著升高（＜0.001）到分生孢子時(shí)期的12.46倍，同時(shí)在侵染中期9—15 h時(shí)也表現(xiàn)出較高水平的轉(zhuǎn)錄活性，說(shuō)明它在病菌整個(gè)侵染過(guò)程中具有重要調(diào)控作用。在此次侵染過(guò)程中呈降低趨勢(shì)，在整個(gè)侵染過(guò)程中不活躍。

2.4 病菌可變剪接因子SC35蛋白間的互作

2.4.1 酵母雙雜交載體構(gòu)建 利用RⅠ和HⅠ對(duì)各個(gè)基因重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，分別得到大小為1 434、468、1 032、915、408、8 000 bp和1 434、468、1 032、915、408、7 300 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖5），說(shuō)明酵母雙雜交載體構(gòu)建成功。

圖2 玉米大斑病菌SC35類(lèi)可變剪接因子與其他真菌同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.4.2 酵母雙雜交試驗(yàn)驗(yàn)證 在酵母雙雜交試驗(yàn)中，重組質(zhì)粒pGADT7/pGBKT7-與pGADT7/ pGBKT7-、pGADT7/pGBKT7-與pGADT7/ pGBKT7-、pGADT7/pGBKT7-與pGADT7/ pGBKT7-、pGADT7/pGBKT7-與pGADT7/ pGBKT7-組合的轉(zhuǎn)化子在二缺板上能正常生長(zhǎng)，而在四缺板上也都能生長(zhǎng)，說(shuō)明剪接因子StSC4與StSC6、StSC3與StSC8、StSC3與StSC4、StSC8與StSC4有明顯的互作，并且這種互作是特異性的（圖6），推測(cè)StSC4、StSC6、StSC3、StSC8可能通過(guò)組合成不同的復(fù)合體對(duì)前體mRNA形成不同的剪接結(jié)果，進(jìn)而編碼不同蛋白質(zhì)。

***: P＜0.001

***: P＜0.001

1: StSC4-BD; 2: StSC6-BD; 3: StSC8-BD; 4: StSC3-BD; 5: StSC7-BD

3 討論

SR蛋白家族數(shù)量龐大，種類(lèi)多樣，其中RNA識(shí)別基序（RRM）介導(dǎo)SR蛋白與前體mRNA上的特定RNA序列結(jié)合；RS結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)SR蛋白與其他剪接因子和剪接體蛋白（snRNP）的相互作用，通過(guò)調(diào)控剪接體的組裝進(jìn)而協(xié)同完成對(duì)前體mRNA剪接位點(diǎn)的選擇。最早在裂殖酵母中發(fā)現(xiàn)兩種編碼SR蛋白的基因（、），Srp1是首個(gè)在裂殖酵母中發(fā)現(xiàn)的具有典型SR蛋白特征的酵母蛋白，它雖然不是裂殖酵母生長(zhǎng)發(fā)育所必需的基因，但是分別過(guò)表達(dá)RBD和RS結(jié)構(gòu)域，裂殖酵母均停止生長(zhǎng)，且前體RNA大量聚集，剪接受到抑制；Srp2蛋白是N端含有兩個(gè)RBD結(jié)構(gòu)域的SR蛋白，其中RS結(jié)構(gòu)域可以影響其在細(xì)胞核中的定位，并且兩者能夠相互作用構(gòu)成一個(gè)蛋白復(fù)合體[19-22]。裂殖酵母中Srp1和Srp2的相互作用也受蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)，Dsk1蛋白激酶介導(dǎo)的Srp1磷酸化抑制了Srp1/Srp2二聚體的形成，但是目前還不清楚Dsk1磷酸化調(diào)控Srp蛋白功能的機(jī)制[22]。釀酒酵母中雖然沒(méi)有Srp1的同源蛋白，但是發(fā)現(xiàn)了Srp2的同源蛋白Npl3p，Dsk1的同源蛋白Sky1。1999年，Yeakley等發(fā)現(xiàn)Sky1的缺失不僅抑制了RS結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的SR蛋白間的相互作用，而且SR蛋白的核轉(zhuǎn)運(yùn)功能也被抑制，同時(shí)細(xì)胞核中含有RS結(jié)構(gòu)域的蛋白定位也出現(xiàn)異常[23]。大量研究表明，SR蛋白R(shí)S結(jié)構(gòu)域中的絲氨酸殘基廣泛地被磷酸化，這種磷酸化影響SR蛋白的亞細(xì)胞定位及SR蛋白之間的相互作用，兩者均可能改變SR蛋白在剪接中起作用的能力[24]。Lorkovic等在擬南芥中鑒定出SR蛋白家族兩種新蛋白CypRS64和CypRS92，其N(xiāo)端含有肽基-脯氨酰順/反異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域，C端含有SR/SP二肽組成的結(jié)構(gòu)域，研究發(fā)現(xiàn)親環(huán)蛋白具有肽基-脯氨酰順/反異構(gòu)酶活性，其與蛋白質(zhì)折疊、組裝和運(yùn)輸有關(guān)[25]。Cavarec等發(fā)現(xiàn)果蠅（）和人類(lèi)（）中含RS結(jié)構(gòu)域的親環(huán)蛋白Moca-cyp和SRcyp分別與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子p300/CBP和RNA聚合酶II（PolⅡ）的C端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，表明它們可能參與了p300/CBP對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和對(duì)PolⅡ前體mRNA的處理[26-27]。1997年，CHANDLER等發(fā)現(xiàn)SF2/ASF的非典型RRM結(jié)構(gòu)域不僅具有剪接的功能，而且可以對(duì)N端RRM的剪接特異性進(jìn)行調(diào)控。因此，SR蛋白中的多個(gè)RRM協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)了前體mRNA的底物特異性[28]。LEE等從釀酒酵母中克隆了一個(gè)RNA結(jié)合蛋白基因——葡萄糖抑制基因（），RBP1蛋白序列也包含兩個(gè)RNA識(shí)別基序，其功能的破壞使細(xì)胞在對(duì)數(shù)早期的生長(zhǎng)速度加快，RBPI基因產(chǎn)物的具體功能尚不清楚，推測(cè)RBP1可能通過(guò)改變RNA代謝過(guò)程，參與了對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)[29]。在對(duì)玉米大斑病菌剪接因子蛋白結(jié)構(gòu)的分析中，筆者也發(fā)現(xiàn)在StSC1中距離N端較遠(yuǎn)處具有兩個(gè)RRM結(jié)構(gòu)域，但其具體作用還不清楚。2017年，張藝美克隆出禾谷鐮孢中與裂殖酵母Srp1和Srp2同源的蛋白FgSrp1和FgSrp2，發(fā)現(xiàn)FgSrp1是生長(zhǎng)發(fā)育所必需的，這與裂殖酵母正好相反，F(xiàn)gSrp1功能的喪失使得菌體生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量、致病性都降低，而對(duì)FgSrp1/2雙缺失突變體的研究發(fā)現(xiàn)其他SR蛋白可以彌補(bǔ)這個(gè)缺陷，也證明真菌體內(nèi)SR蛋白功能存在冗余[30]?？傮w來(lái)說(shuō)，SR蛋白在植物與動(dòng)物領(lǐng)域研究廣泛，而在絲狀真菌中的研究還很少。

A

A：8個(gè)剪接因子間相互作用關(guān)系The interaction of 8 alternative splicing factors；B：-AD/BD與-AD/BD-AD/BD and-AD/BD； C：-AD/BD與-AD/BD-AD/BD and-AD/BD；D：-AD/BD與-AD/BD-AD/BD and-AD/BD；E：-AD/BD與-AD/BD-AD/BD and-AD/BD

○：未驗(yàn)證not verified；√：互作interacted；×：不互作not interacted

圖6 酵母雙雜交驗(yàn)證玉米大斑病菌可變剪接因子間的互作

Fig. 6 Verification of the alternative splicing factor interaction through yeast two-hybrid

筆者通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)StSC2與真核翻譯起始因子eIF3有密不可分的關(guān)系，同時(shí)StSC4也與裂殖酵母的親環(huán)蛋白R(shí)ct1具有同源性，推測(cè)StSC2參與了RNA轉(zhuǎn)錄后的翻譯起始過(guò)程。根據(jù)病菌侵染寄主表面過(guò)程6 h的qRT-PCR結(jié)果，推測(cè)StSC4對(duì)芽管生長(zhǎng)后期細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的加工有重要調(diào)控作用。StSC6與番茄匍柄霉中富含甘氨酸的RNA結(jié)合蛋白（GRP）的序列覆蓋率為57%，相似度為95.65%，已有研究發(fā)現(xiàn)GRP可能參與植物體細(xì)胞壁及細(xì)胞骨架的構(gòu)成[31]；而StSC8與多種真菌中富含絲氨酸的RNA結(jié)合蛋白具有相似性。筆者發(fā)現(xiàn)在病菌侵染寄主表面過(guò)程中StSC5、StSC6和StSC8在分生孢子萌發(fā)3 h即芽管形成初期表達(dá)活躍，推測(cè)StSC5、StSC6和StSC8在芽管萌發(fā)中發(fā)揮重要作用，StSC6可能同時(shí)參與調(diào)控真菌細(xì)胞壁的發(fā)育。StSC1在附著胞時(shí)期相對(duì)表達(dá)量最高，與小麥核腔菌中和核糖體翻譯功能相關(guān)的蛋白聚于同一支，筆者推測(cè)StSC1可能在將mRNA運(yùn)輸?shù)骄z尖端的過(guò)程中起作用，也可能通過(guò)抑制細(xì)胞頂端核糖體翻譯功能的發(fā)生，影響細(xì)胞的極性生長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化，使其腫脹膨大進(jìn)而形成附著胞。LORKOVIC等研究表明，擬南芥的剪接因子之間具有密切的同源性[32]，但是本研究通過(guò)發(fā)育樹(shù)的建立發(fā)現(xiàn)玉米大斑病菌中SC35剪接因子間的同源性比較低，這與動(dòng)物類(lèi)似。

SC35蛋白對(duì)于依賴(lài)ATP的U1 snRNP和U2 snRNP與前體mRNA之間的組合是不可缺少的[7]。20世紀(jì)末已經(jīng)證明哺乳動(dòng)物剪接因子SC35和SF2/ASF能夠與U1 snRNP蛋白相互作用[33-34]。2002年，Lopato等在擬南芥中發(fā)現(xiàn)一種新的富含RS的蛋白質(zhì)AtRSZ33，同時(shí)發(fā)現(xiàn)SCL家族的另外兩個(gè)蛋白SCL30a和AtSC35均與AtRSZ33相互作用，因?yàn)镾F2/ASF和SC35蛋白的功能之一是識(shí)別5′剪接位點(diǎn)，并且AtRSZ和AtSCL蛋白均與U1 snRNP蛋白結(jié)合，推測(cè)AtRSZ33最有可能在5′剪接位點(diǎn)附近并參與剪接體裝配[35]。SC35不僅可以招募其他SR蛋白在相同的剪接位點(diǎn)形成剪接復(fù)合體，也可能和其他SR蛋白相互作用幫助5′和3′剪接位點(diǎn)接觸進(jìn)而完成對(duì)前體mRNA的剪切和連接[33,36]。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌剪接因子StSC3與粗糙脈孢菌中所明確的U2 snRNP蛋白具有51.92%的同源性，StSC4與裂殖酵母中U1 snRNP相關(guān)蛋白USP101具有26.85%的同源性，有體外研究證明過(guò)量的SR蛋白可以彌補(bǔ)剪接復(fù)合體中U1 snRNP的缺少[15]，因此筆者推測(cè)StSC3可能在3′剪接位點(diǎn)附近參與剪接體裝配；StSC4可能在5′剪接位點(diǎn)附近參與裝配。通過(guò)酵母雙雜交驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)StSC4、StSC6、StSC3、StSC8之間能夠相互作用，推測(cè)它們可能通過(guò)組合成不同的復(fù)合體發(fā)揮功能，參與玉米大斑病菌中某些剪接復(fù)合體對(duì)5′和3′剪接位點(diǎn)的選擇，綜合兩者，筆者推測(cè)這些剪接因子有兩種作用方式：一種是剪接因子StSC6和StSC8可能在5′剪接位點(diǎn)與StSC4共同參與剪接復(fù)合體的組裝，然后StSC3通過(guò)與StSC8或StSC4的互作關(guān)系將3′和5′剪接位點(diǎn)連接在一起，完成對(duì)前體mRNA的剪接；另一種可能是StSC8與StSC3在3′剪接位點(diǎn)參與剪接復(fù)合體的組裝，StSC4與StSC6在5′剪接位點(diǎn)參與組裝，然后StSC3通過(guò)與StSC4的互作關(guān)系將3′和5′剪接位點(diǎn)連接在一起。但是不能排除四者共同參與更復(fù)雜的剪接復(fù)合體的構(gòu)成。

4 結(jié)論

獲得了玉米大斑病菌的8個(gè)可變剪接因子，發(fā)現(xiàn)在玉米大斑病菌的不同發(fā)育時(shí)期及侵染過(guò)程中可變剪接因子的表達(dá)模式不同。、、、、在病菌侵染感病玉米葉片18 h時(shí)表達(dá)活躍，在整個(gè)過(guò)程中不活躍，、和在侵染前期即分生孢子萌發(fā)初期發(fā)揮重要作用，在病菌整個(gè)侵染過(guò)程中具有重要調(diào)控作用；菌絲、分生孢子、芽管、附著胞及侵入絲時(shí)期的表達(dá)規(guī)律分析表明，、和對(duì)病菌的附著胞和侵入絲形成有比較明顯的調(diào)控作用；酵母雙雜交試驗(yàn)證明剪接因子StSC4與StSC6、StSC3與StSC8、StSC3與StSC4、StSC8與StSC4有互作關(guān)系，促使剪接復(fù)合體在5′或3′剪接位點(diǎn)進(jìn)行裝配和剪接。

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The Expression Pattern and Interaction Analysis of the Homologues of Splicing Factor SC35 in

LI TianCong1, ZHU Hang1, WEI Ning1, LONG Feng1, WU JianYing1, ZHANG Yan1, DONG JinGao2,3, SHEN Shen1, HAO ZhiMin1,2

1College of Life Sciences/Key Laboratory of Hebei Province for Plant Physiology and Molecular Pathology, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei;2State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation, Baoding 071001, Hebei;3College of Plant Protection, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei

【】The objective of this study is to obtain the homologous genes of the splicing factor SC35 in, and to analyze the interaction among them and the expression profiles during the different growth and development stages and infection process of the pathogen. It would lay the foundation for illustrating the relationship between the SC35 family members and fungal pathogenicity.【】Based on amino acid sequences of SC35 protein inas probe sequences, online Blastp alignment was carried out in thegenome database to obtain candidate SC35 homologues. Then they were analyzed for conserved domain and phylogenetic relationship through bioinformatics procedures. The materials ofwere collected at different infection stages on maize leaves and multiple developmental stages, such as hyphae, conidia, germ tubes, appressorium and penetration hyphae, to analyze the transcription levels of SC35 homologues through real-time quantitative PCR (qRT-PCR). And their interactions were verifiedby the yeast two-hybrid test.【】Eight SC35 genes ofwere obtained, named as,,,,,,, and, respectively. All of them owned typical SR protein domains, besides StSC1 showed two RRM domains. They located at different physical locations of the genome and had no linkage.Phylogenetic analysis showed that the eight alternative splicing factors were distributed in different clades, with low homology. In the process of infection on maize leaves, gene,,,,,andwere up-regulated, whilewas down-regulated at 18 h after inoculation.showed high expression activity at 6-18 h. In different development periods, the expression levels ofwere extremely significant up-regulated (＜0.001) in the appressorium and the formation of penetration hyphae, which were 24.44 and 8.25 times higher than those in the conidial period, but the others were down-regulated during the development. The yeast two-hybrid proved that StSC4 interacted with StSC6, StSC3 with StSC8, StSC3 with StSC4, and StSC8 with StSC4. 【】The expression patterns ofare different in the infection process and multiple developmental stages of.is actively expressed throughout the infection process.,andplay important regulatory roles during the formation of appressorium and penetration hyphae. StSC4 and StSC6, StSC3 and StSC8, StSC3 and StSC4, StSC8 and StSC4 interact to regulate the formation of splicing complexes.

; alternative splicing factor; qRT-RCR; yeast two-hybrid

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.04.006

2020-05-12；

2020-05-28

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-02-25）、河北省自然科學(xué)基金（C2018204120）、河北省高等學(xué)校青年拔尖人才科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（BJ2014349Y）

李天聰，E-mail：905351819@qq.com。朱行，E-mail：1175593328@qq.com。李天聰和朱行為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者申珅，E-mail：shenshen0428@163.com。通信作者郝志敏，E-mail：haozhimin@hebau.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）