王小咪 呂欣然 白鳳翎

(1. 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121013；2. 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；3. 國(guó)家魚糜及魚糜制品加工技術(shù)研發(fā)分中心，遼寧 錦州 121013)

真菌是一類可引起植物、動(dòng)物和人類疾病的真核微生物。根據(jù)美國(guó)農(nóng)業(yè)部[1]估計(jì)，世界25%糧食作物在生長(zhǎng)或貯藏期間受到霉菌污染。最常用的控制真菌技術(shù)是熱處理和酸基防腐劑處理，控制烘焙產(chǎn)品中霉菌生長(zhǎng)常采用紫外線或紅外輻射[2]。一些果汁和茶飲料常采用巴氏殺菌技術(shù)和通過(guò)添加丙酸鈣、脫氫乙酸鈉等控制霉菌污染。傳統(tǒng)抗真菌劑被認(rèn)為是導(dǎo)致真菌耐受性的主要原因，因此，新型生物類抗真菌劑的研發(fā)與制備備受關(guān)注。

抗菌肽是一類廣泛存在于自然界具有抗菌活性的小肽類物質(zhì)，許多抗菌肽具有很強(qiáng)的抗真菌活性，即抗真菌肽(Antifungal peptides, AFPs)。根據(jù)結(jié)構(gòu)將AFPs分為4類，第1類是在疏水環(huán)境中形成α-螺旋的線性肽，簡(jiǎn)稱α-螺旋肽；第2類是β-片狀結(jié)構(gòu)的肽，簡(jiǎn)稱β-片狀肽；第3類是半胱氨酸穩(wěn)定的α-螺旋和β-片層折疊肽，簡(jiǎn)稱CSαβ肽；第4類是包含大量的特定殘基和隨機(jī)結(jié)構(gòu)小肽的線性肽，簡(jiǎn)稱線性肽[3]。依據(jù)來(lái)源將其分為植物源性、動(dòng)物源性和微生物源性AFPs。植物源性AFPs來(lái)源植物的塊莖、種子等植物組織中，種類豐富，具有廣譜性、高效性、安全性等特點(diǎn)。

1 植物源性抗真菌肽

目前，學(xué)者們已從不同植物中分離純化出一些具有活性的AFPs，表1概括了近20年有關(guān)植物源AFPs結(jié)構(gòu)、抑制對(duì)象及作用機(jī)制等內(nèi)容。

1.1 α-螺旋肽

α-螺旋肽主要包括脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白、α-發(fā)夾蛋白和蛻皮素類抗菌肽。脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(Lipid transfer protein, LTP) 是一類由4個(gè)α-螺旋組成的小分子量堿性蛋白質(zhì)。LTP來(lái)源廣泛，已從玉米、大麥、菠菜、擬南芥、洋蔥、豇豆、水稻等多種植物中獲得了具有抗真菌活性LTP。Ace-AMP1是一種分離于洋蔥種子的LTP，對(duì)番茄早疫病菌、棉花枯萎病菌和棉花黃萎病菌等多種植物真菌具有高效的拮抗活性[26]。Gonorazky等[27]從向日葵種子中分離出一種非特異性LTP (nsLTPs)，命名為Ha-AP10，具有抗茄病鐮刀菌(Fusariumsolanum)的活性，可通過(guò)靜電吸附與真菌膜上的磷脂相互作用，滲透進(jìn)入真菌孢子，達(dá)到抗真菌作用。

α-發(fā)夾蛋白是一類含有特征性半胱氨酸的環(huán)螺旋肽。Nolde等[8]從稗草中分離出一種α-發(fā)夾蛋白，命名為EcAMP1，其可進(jìn)入茄病鐮刀菌細(xì)胞內(nèi)并積累在分生孢子(液泡或脂質(zhì)體)囊泡中，從而抑制鐮刀菌的生長(zhǎng)。此外，Slavokhotova等[7]從金縷草種子中得到的Sm-AMP-X是一種有效的抗真菌α-發(fā)夾蛋白，其在微摩爾范圍內(nèi)抑制了曲霉(Aspergillus)或尖孢菌霉(Fusariumoxysporium)等植物病原真菌的分生孢子萌發(fā)和菌絲伸長(zhǎng)。

表1 植物源AFPs的抗菌活性和作用方式

蛻皮素是一類由1個(gè)雙α-螺旋結(jié)構(gòu)、6個(gè)穩(wěn)定的二硫鍵和1個(gè)必需的C-末端(可確保肽的生物活性和穩(wěn)定性)組成的堿性蛋白，分子量約7 kDa。Segura等[9]從馬鈴薯塊莖中首次分離出一種蛻皮素，命名為Snakin-1，該肽含有63個(gè)氨基酸殘基，其在低濃度(<10 μmol/L)時(shí)對(duì)馬鈴薯和其他植物中的細(xì)菌和真菌病原體(如茄病鐮刀菌)均具有拮抗活性。此外，馬鈴薯塊莖組織發(fā)生降解或受到侵襲時(shí)，其能表達(dá)一種肽Snakin-2，與Snakin-1序列同源性僅為38%。雖然Snakin-2和Snakin-1序列具有顯著性差異，但其抑菌譜相似，對(duì)鐮刀菌屬、黑曲霉(Aspergillusniger)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等幾種植物病原菌均具有拮抗活性，Snakin-2的作用靶點(diǎn)是在細(xì)胞膜上形成孔洞。其他植物中還發(fā)現(xiàn)了蛻皮素Snakin-Z[10]和Sn2[11]。

1.2 β-片狀肽

β-片狀肽是由多個(gè)二硫鍵組成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)肽，具有兩親性，可與真菌細(xì)胞膜相互作用。Knottin肽是一種β-片狀肽，含有30個(gè)半胱氨酸殘基，具有穩(wěn)定的“打結(jié)”拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。Gao等[13]從美洲商陸種子中分離并克隆了一種新的抗真菌肽PAFP-S，序列分析表明PAFP-S屬于Knottin型抗菌肽，具有廣譜的抗真菌活性，如對(duì)尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)和稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)均具有較強(qiáng)的抑制作用。此外，分離自紫茉莉種子中的抗真菌肽Mj-AMP1和Mj-AMP2與PAFP-S具有相同的半胱氨酸結(jié)構(gòu)[12]，具有57%的序列同源性，并分別含有36，37個(gè)氨基酸殘基，其中4個(gè)氨基酸殘基不同，3個(gè)差異發(fā)生在C-末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域代表了1個(gè)β-發(fā)夾序列，稱為γ-核心，常被認(rèn)為是肽活性的必要結(jié)構(gòu)。

1.3 CSαβ肽

植物防御素是一類CSαβ肽，富含二硫鍵，分子量在5 kDa 左右，由45～54個(gè)氨基酸組成，其中含有8個(gè)保守的半胱氨酸殘基，其三維結(jié)構(gòu)呈小球形，包括1個(gè)α-螺旋和3個(gè)反平行的β-折疊片層結(jié)構(gòu)，存在于多種植物組織(種子)中，是生物免疫系統(tǒng)中的重要調(diào)節(jié)因子。

胡蘿卜種子的植物防御素Rs-AFP2是最具特征性的防御素之一，對(duì)絲狀真菌具有較強(qiáng)的抑制活性[28]。Thevissen等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Rs-AFP2可作用于白色念珠菌(CandidaAlbicans)細(xì)胞壁葡萄糖神經(jīng)酰胺(GlcCer)，增大細(xì)胞壁壓力，使胞裂蛋白(septin)錯(cuò)誤定位和神經(jīng)酰胺積累，抑制其菌絲生長(zhǎng)。苜蓿防御素MsDef1也有類似GlcCer抑制禾谷鐮刀菌生長(zhǎng)的作用[16]。此外，大麗花防御素Dm-AMP1與真菌膜上甘露糖苷二肌醇磷脂酰神經(jīng)酰胺[M(IP)2C]結(jié)合，可增加敏感真菌膜的通透性，導(dǎo)致鈣離子和鉀離子泄露，達(dá)到抑制真菌生長(zhǎng)的作用效果[17]。植物防御素不但可以作用于真菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，還可作用于胞內(nèi)的一些靶點(diǎn)。

1.4 線性肽

線性肽主要包括具有特定氨基酸殘基的小分子橡膠素和硫蛋白，其具有α和β隨機(jī)結(jié)構(gòu)。橡膠素以橡膠蛋白命名，通常由29～45個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為4.7 kDa，含有6，8，10個(gè)半胱氨酸，其中8個(gè)半胱氨酸是最常見的形式。橡膠素具有幾丁質(zhì)結(jié)合特性，因此其作用方式是干擾細(xì)胞壁生物合成。Huang等[20]從銀杏葉中分離的一種新型橡膠素銀杏內(nèi)酯GAFP與幾丁質(zhì)相互作用后可抑制多種鐮刀菌生長(zhǎng)，如禾谷鐮刀菌和串珠鐮刀菌等。Koo等[23]研究發(fā)現(xiàn)，源自日本牽牛花的Pn-AMP1是一種4.3 kDa半胱氨酸/甘氨酸豐富的抗菌肽，對(duì)細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)和缺乏幾丁質(zhì)的真菌均具有較強(qiáng)的抑制活性。其能定位于真菌的隔膜和菌絲頂端，并快速滲透進(jìn)入真菌菌絲中，使菌絲頂端爆裂，內(nèi)容物泄露，導(dǎo)致真菌死亡。此外，來(lái)自芥末的Wj-AMP1[29]、蘇鐵的Cy-AMP1[30]、紡錘樹的Ee-CBP[31]、杜仲的EAFP2[22]和小麥種子中的WAMP-1(a/b)[21]等橡膠素也具有抗真菌活性。

硫蛋白由兩個(gè)反平行α-螺旋和一個(gè)反平行雙鏈β-片組成，由3個(gè)或4個(gè)二硫鍵橋連接，形成一個(gè)特征穩(wěn)定的γ折疊，分子量約5 kDa，含有高比例的精氨酸、賴氨酸和半胱氨酸，且在中性pH下帶正電荷，廣泛分布在大麥、豇豆等多種植物組織中。硫蛋白是疏水性的，通過(guò)疏水性和/或極性殘基與膜元件的相互作用顯示其抗真菌活性，導(dǎo)致真菌細(xì)胞膜的溶解[32]。Taveira等[24-25]從辣椒中分離出對(duì)念珠菌和釀酒酵母具有抑制作用的抗菌肽CaThi與釀酒酵母質(zhì)膜成分相互作用，改變質(zhì)子梯度，抑制介質(zhì)酸化，增加活性氧，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上，目前分離純化得到的植物源AFPs主要對(duì)鐮刀菌屬、釀酒酵母屬、念球菌屬及曲霉屬等真菌具有拮抗活性，其作用方式主要通過(guò)膜滲透作用，其中植物防御素類抗菌肽研究得較為深入。

2 植物源性抗真菌肽的作用機(jī)理

目前，已從多種植物中獲得具有抗真菌作用的活性多肽。由圖1可知，根據(jù)作用位點(diǎn)的不同，植物源AFPs作用機(jī)理大致可以分為以下3類。

2.1 對(duì)真菌細(xì)胞壁的作用

真菌細(xì)胞壁主要由糖基化蛋白、β-葡聚糖及幾丁質(zhì)等成分組成，是AFPs識(shí)別真菌細(xì)胞的靶點(diǎn)。植物源AFPs作用方式：① 通過(guò)與真菌細(xì)胞壁最外層的糖基化蛋白相互作用以抑制細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致細(xì)胞壁不能維持正常的細(xì)胞形態(tài)，如結(jié)構(gòu)多樣化甘露糖蛋白是AFPs準(zhǔn)確識(shí)別病原菌的靶點(diǎn)。Ibeas等[34]研究表明，煙草抗菌肽osmotin可與細(xì)胞壁甘露聚糖相互作用，以促進(jìn)跨細(xì)胞壁的擴(kuò)散，誘導(dǎo)信號(hào)級(jí)聯(lián)并激活釀酒酵母中的信息素反應(yīng)MAPK和應(yīng)激反應(yīng)途徑，致使真菌細(xì)胞受到損傷。② 通過(guò)抑制真菌細(xì)胞壁中葡聚糖及幾丁質(zhì)的合成來(lái)破壞真菌細(xì)胞壁的合成，達(dá)到殺菌目的。α-硫蛋白是源自大麥和小麥的一種抗菌肽，可與細(xì)胞壁幾丁質(zhì)和β-1,3-葡聚糖結(jié)合，使真菌生長(zhǎng)受到抑制。一些植物類thaumatin型肽被證明具有β-1,3-葡聚糖酶活性，可以水解細(xì)胞壁中的葡聚糖成分，使細(xì)胞壁合成受阻，導(dǎo)致真菌細(xì)胞溶解和死亡。橡膠蛋白中包含幾丁質(zhì)結(jié)合域，可與含有幾丁質(zhì)的真菌相互作用，抑制幾丁質(zhì)的合成，從而破壞細(xì)胞壁的完整性。與橡膠蛋白類似的hevein型肽也能抑制含有幾丁質(zhì)的真菌生長(zhǎng)。

2.2 對(duì)真菌細(xì)胞膜的作用

細(xì)胞膜是真菌細(xì)胞的第二道防線，也是AFPs普遍的作用靶點(diǎn)。大多數(shù)陽(yáng)離子型AFPs都可作用于真菌細(xì)胞膜，從而達(dá)到抑菌作用。細(xì)胞質(zhì)膜帶有負(fù)電荷，有助于AFPs通過(guò)靜電作用吸附于細(xì)胞膜上，使細(xì)胞膜發(fā)生去極化反應(yīng)，增大細(xì)胞膜的通透性，使其形成孔洞，導(dǎo)致鉀離子以及細(xì)胞內(nèi)容物外滲而死亡。結(jié)合圖1可知，AFPs可通過(guò)“桶式模型”“環(huán)狀孔道模型”“毯式模型”作用于真菌細(xì)胞膜。但在實(shí)際抗真菌時(shí)，植物源AFPs可能同時(shí)采用幾種不同機(jī)制或者各種機(jī)制漸次發(fā)生的方式破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)殺菌的目的[35]。

圖1 植物源AFPs的作用機(jī)制[33]

2.2.1 桶式模型 AFPs與細(xì)胞膜通過(guò)靜電作用吸附后，AFPs積聚形成多聚體，垂直插入細(xì)胞膜磷脂層內(nèi)，形成類似于木桶的離子孔道，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物和鉀離子外流，細(xì)胞膜分布不均，引起細(xì)胞裂解[36]。許多植物防御素的作用方式是桶式模型，其抗菌作用可分為3個(gè)階段：① 通過(guò)靜電作用與帶負(fù)電荷的真菌膜脂層結(jié)合；② 作用于膜上形成穩(wěn)定的多個(gè)通道，帶正電荷的防御素分子或其多聚體則與真菌膜上帶負(fù)電荷的磷脂頭部和水分子相互作用，顯著增加生物膜的通透性。③ 通道形成后，防御素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的同時(shí)，其他胞外分子也伴隨進(jìn)入(如肽、蛋白質(zhì)或無(wú)機(jī)離子)，而靶細(xì)胞的重要物質(zhì)(如鹽離子和大分子)滲出，細(xì)胞內(nèi)容物外泄致使靶細(xì)胞發(fā)生不可逆損傷而死亡。

2.2.2 環(huán)狀孔道模型 環(huán)狀孔道模型也稱蟲孔模型，是指AFPs的疏水部分與磷脂膜疏水頭部相結(jié)合，隨后AFPs移動(dòng)引導(dǎo)細(xì)胞膜磷脂移動(dòng)。AFPs疏水端和磷脂頭部一直相結(jié)合，使細(xì)胞膜表面疏水區(qū)域產(chǎn)生裂縫，磷脂單分子層逐漸向內(nèi)流動(dòng)彎曲，形成孔道，改變細(xì)胞膜穩(wěn)定性，使細(xì)胞無(wú)法維持正常的滲透壓，進(jìn)而凋亡。與桶式模型不同的是，AFPs始終與磷脂膜頭部相結(jié)合，兩者共同形成跨膜孔道。如源自番茄中的一種抗菌肽Sn2，其對(duì)釀酒酵母具有拮抗活性，主要作用方式是通過(guò)在靶細(xì)胞膜上形成孔，使真菌細(xì)胞失穩(wěn)，進(jìn)而凋亡[11]。

2.2.3 毯式模型 毯式模型是AFPs平行排布于細(xì)胞膜表面，在電荷作用下以地毯形式覆蓋在磷脂層表面，隨著AFPs積聚增多，被覆蓋區(qū)域細(xì)胞膜穩(wěn)定性下降，逐漸變形彎曲，最后導(dǎo)致細(xì)胞膜瓦解。Alfred等[37]研究發(fā)現(xiàn)，puroindolines是13 kDa的小麥胚乳堿性蛋白，具有豐富的色氨酸結(jié)構(gòu)域和5個(gè)二硫鍵。其在真菌膜上產(chǎn)生孢子，可能是通過(guò)地毯狀的機(jī)制抑制真菌活性[37]。由于毯式模型主要是在電荷作用下吸附AFPs與真菌膜相互作用，而大部分AFPs都是陽(yáng)離子性多肽，所以該模型基本上都是與其他作用機(jī)制一起作用。

2.3 與真菌細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)的作用

一些AFPs與真菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜相互作用后，還可與胞內(nèi)多種靶點(diǎn)作用，包括啟動(dòng)脅迫基因、絮凝細(xì)胞內(nèi)含物、抑制DNA或蛋白質(zhì)合成、調(diào)控線粒體等細(xì)胞器代謝等方式來(lái)發(fā)揮抗菌活性。通常內(nèi)化過(guò)程發(fā)生前，AFPs先與細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜相互作用，因此，AFPs作用于細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)時(shí)，也與真菌細(xì)胞壁或細(xì)胞膜發(fā)生作用。煙草防御素NaD1和豌豆防御素PsD1可進(jìn)入真菌細(xì)胞并與細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)相互作用。NaD1是煙草花組織的一種高水平表達(dá)防御素，主要作用于真菌細(xì)胞質(zhì)，使其呈顆粒狀，抑制尖孢鐮刀桿菌、灰霉菌和念珠菌等真菌生長(zhǎng)[18]。PsD1的抗真菌活性基于阻斷細(xì)胞核上的周期蛋白合成，終止真菌細(xì)胞周期，導(dǎo)致真菌細(xì)胞凋亡[19]。

綜上，AFPs可通過(guò)作用位點(diǎn)的不同使真菌細(xì)胞生物活性降低或直接導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡，以達(dá)到抑菌作用。然而，目前關(guān)于植物源AFPs的作用機(jī)制研究主要集中于細(xì)胞膜上，其他靶點(diǎn)的作用機(jī)制還有待深入研究。

3 植物源性抗真菌肽的應(yīng)用

目前，一些植物源AFPs已被應(yīng)用于食品和農(nóng)作物等領(lǐng)域，馮林慧[38]將對(duì)黑曲霉具有拮抗活性的大豆多肽GAP以食品添加劑的形式應(yīng)用到海綿蛋糕中，發(fā)現(xiàn)隨著GAP添加量的增加，海綿蛋糕的感官特性和理化特性有一定程度的下降，但抗菌特性顯著增加。此外，更多的學(xué)者利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將AFPs轉(zhuǎn)入到小麥、玉米和水稻等農(nóng)作物中，以提高農(nóng)作物對(duì)病原真菌的抗性。該策略不僅減少了農(nóng)藥的大量使用，且比傳統(tǒng)的育種方法效率更高。蔣雯等[39]將源自馬鈴薯塊莖的抗菌肽SN1的基因編碼序列克隆至載體pGEX-4T-1上，發(fā)現(xiàn)克隆表達(dá)的抗菌肽SN1可顯著抑制禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealis)和平臍蠕孢菌(Bipolaris)菌絲的生長(zhǎng)，其可作為小麥病害抗性育種的潛在基因。Zhang等[40]在玉米泛素啟動(dòng)子的控制下，將源自小麥胚乳的puroindoline蛋白PINA和PINB導(dǎo)入玉米基因中，可使玉米對(duì)異旋孢腔菌(Cochliobolusheterostrophus)產(chǎn)生一定的耐受性，并將癥狀的發(fā)生率降低42%。Chen等[41]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，將苜蓿防御素基因(alfAFP)、水稻幾丁質(zhì)酶基因(CHI)及其結(jié)合基因(CHI-AFP)導(dǎo)入番茄微生態(tài)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)病原菌感染的抗性高于非轉(zhuǎn)基因植株，增強(qiáng)了番茄對(duì)灰霉病的抗菌性。

4 結(jié)論

植物源抗真菌肽具有來(lái)源廣泛、結(jié)構(gòu)多樣、作用機(jī)制復(fù)雜等特點(diǎn)，是控制食品和農(nóng)作物等產(chǎn)品感染真菌的重要資源。目前，不同來(lái)源的植物源抗真菌肽研究主要集中于抗真菌肽的分離、表達(dá)、純化及活性分析方面，有關(guān)抗真菌肽的作用機(jī)制方面的研究還不夠深入，同時(shí)造成其在食品和農(nóng)作物等領(lǐng)域的應(yīng)用產(chǎn)生了局限性。對(duì)于存在的這些問(wèn)題，期望未來(lái)更多的研究集中于植物源抗真菌肽的作用機(jī)制和應(yīng)用等方面，使新型、高效、低毒、廣譜的植物源性抗真菌肽在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。