王希江 譚云洪 賀文從 歐喜超 劉東鑫 趙雁林

耐藥結(jié)核病的廣泛流行是結(jié)核病有效防控的巨大挑戰(zhàn)。WHO[1]報告顯示，2019年全球約50萬例利福平耐藥(rifampicin resistance tuberculosis, RR-TB)新發(fā)結(jié)核病患者，其中78%為耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistance tuberculosis，MDR-TB)患者。據(jù)估計，在這部分患者中，僅51%的患者被檢測發(fā)現(xiàn)，30%的患者獲得治療，治療成功率為56%[1]，這在很大程度上導(dǎo)致了RR/MDR-TB的傳播和流行。目前，結(jié)核病的防控主要依賴于快速診斷和有效治療，尤其是對耐藥性的及時正確診斷是確定有效治療方案、提高治愈率，進而阻斷傳播的基礎(chǔ)。表型藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)價格昂貴、耗時較長，且對設(shè)備要求較高。目前包括GeneXpert?(Cepheid, USA)、GenoType MTBDR plus V2 (Hain Life science GmbH, Nehren, DE)及AID TB Resistance Line Probe Assay (AID GmbH, Strassberg, DE)等的一系列分子生物學(xué)檢測方法，雖然可以實現(xiàn)快速檢測，但僅針對某些特定的耐藥基因，無法識別全部的耐藥突變位點。全基因組測序(whole genome sequencing, WGS)基于整個4.4 Mb 結(jié)核分枝桿菌基因組進行檢測，在提供全面的耐藥突變位點同時，還可識別異質(zhì)性耐藥，很大程度上彌補了靶向分子方法的缺陷。

利福平(RFP)和異煙肼(INH)作為治療結(jié)核病的基石，其耐藥突變位點多樣性已有報道[2-3]，進一步研究表明不同的突變位點及突變方向可能導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)不同，而不同的MIC值可能會引起治療效果的差異。因此，本研究以新疆維吾爾自治區(qū)(簡稱“新疆”)和湖南省國家耐藥監(jiān)測點的菌株為例，采用WGS全面了解RFP及INH耐藥菌株分子特征的同時，將反映耐藥水平高低的MIC值與耐藥突變位點相結(jié)合，探究耐藥突變基因型與耐藥水平的量化關(guān)系，以期為我國相關(guān)分子生物學(xué)診斷方法的研發(fā)和臨床用藥方案及劑量的確定提供依據(jù)。

資料和方法

一、 菌株來源

2016—2017年新疆(柯坪縣、岳普湖縣和疏勒縣)和湖南(懷化市、永順縣、祁東縣、桃江縣和耒陽市)國家耐藥監(jiān)測點的所有痰涂片陽性肺結(jié)核患者的痰標本進行分離培養(yǎng)，獲得陽性培養(yǎng)物。最終獲得785株結(jié)核分枝桿菌，新疆193株，湖南592株。

二、 實驗方法

(一)菌株培養(yǎng)

將含有菌液的凍存管放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中復(fù)蘇。吸取0.1～0.15 ml菌液均勻接種于培養(yǎng)管的羅氏培養(yǎng)基上，每株菌接種2支培養(yǎng)管。將培養(yǎng)管放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。具體操作參考《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[4]。培養(yǎng)基購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

(二)藥敏試驗

藥敏試驗采用TREK Sensititre?MYCOTBI藥敏板(美國 Thermo公司)，測定結(jié)核分枝桿菌對RFP和INH兩種抗結(jié)核藥物的MIC[5-7]。利福平和異煙肼均按倍比含量以凍干粉的形式固著于微孔板上，藥物濃度分別為0.12～16 μg/ml和0.03～4 μg/ml。操作過程按照生產(chǎn)企業(yè)操作手冊進行。采用超聲磨菌儀(體必康生物科技有限公司)制備0.5麥氏單位的菌懸液，取100 μl制備好的菌懸液加至10 ml的Middlebrook 7H9肉湯培養(yǎng)基(OADC生長添加劑濃度為10%)中，混勻后，通過SensititreTM接種儀(Thermo Fisher, Scientific Inc., USA)接種，每孔100 μl。接種完成后，用黏性貼膜將藥敏板密封，置于37 ℃含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，由VizionTM數(shù)字觀察系統(tǒng)輔助讀板。MIC定義為與陽性對照孔相比較沒有明顯可見的細菌菌落生長的最低濃度。

藥敏試驗均采用結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv (ATCC 27294)作為藥物敏感菌株對照。每塊藥敏板含有兩個陽性對照孔(不含抗結(jié)核藥物)，如果兩個陽性對照孔中均存在可見的或可接受的細菌生長，且該藥對應(yīng)的孔中沒有污染、蒸發(fā)和跳孔現(xiàn)象時，則MIC結(jié)果認為是可讀且有效的。由2名實驗員分別通過VizionTM數(shù)字觀察系統(tǒng)讀取結(jié)果，并對結(jié)果進行復(fù)核，不一致的結(jié)果進行重新讀取。

臨界值濃度參考CLSI MA-24，INH臨界濃度為0.2 μg/ml，RFP臨界濃度為1 μg/ml,菌株的MIC值>臨界值，則結(jié)核分枝桿菌對該藥耐藥，如果MIC值≤臨界值，則為敏感。788株結(jié)核分枝桿菌，3株因藥敏試驗結(jié)果無效而被排除，最終785株結(jié)核分枝桿菌獲得有效的藥敏試驗結(jié)果。

(三)全基因組測序及耐藥預(yù)測

785株結(jié)核分枝桿菌經(jīng)藥敏試驗判定為RFP和(或)INH耐藥124株，對124株菌采用CTAB/NaCl法提取其全基因組。利用Nanodrop ND-1000核酸分析儀測定核酸樣本的濃度及純度，保證樣本滿足光密度260/280=1.8～2.0，光密度260/230=2.0～2.2，濃度>50 ng/μl。合格樣本由中國科學(xué)院微生物所利用Illumina公司的NextSeq500測序儀，使用2×150 bp雙端測序?qū)Y(jié)核分枝桿菌DNA完成測序。

(四)生物信息學(xué)分析

124株結(jié)核分枝桿菌完成測序后使用Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore)及FastQC對原始FASTQ序列進行過濾。選取Reads平均深度超過60 ×(“×”指測序深度)，覆蓋度超過97%的樣本用于后續(xù)分析。將質(zhì)控合格的FASTQ測序文件上傳到TB Profiler (Version 2.7.4)進行基因型耐藥分析[8]。

(五)統(tǒng)計學(xué)處理

采用Excel 2016建立原始數(shù)據(jù)庫，采用統(tǒng)計描述對耐藥菌株的分子特征進行對比分析。

結(jié) 果

一、 表型藥敏試驗結(jié)果

124株檢測為RFP和(或)INH耐藥，包括RFP單耐藥菌株13株，INH單耐藥菌株50株，對兩者同時耐藥(MDR-TB)61株，耐多藥率為7.77%(61/785)。

二、 耐藥相關(guān)基因突變分布

122株RFP和INH耐藥菌株獲得全基因組測序數(shù)據(jù)(2株因建庫失敗或者質(zhì)控不合格而被排除)，并納入最終分析，包括59株MDR菌株，50株單耐INH菌株，13株單耐RFP菌株。

1. 利福平耐藥相關(guān)基因突變分布：72株RFP耐藥菌株中， 70株(97.22%)檢測出rpoB基因耐藥相關(guān)位點突變，其中98.57%(69/70)的突變出現(xiàn)在利福平耐藥決定區(qū)(RRDR)。WGS分析共檢測到23種錯義突變形式，除一種突變形式(rpoBLeu430Pro)對應(yīng)的表型藥敏試驗結(jié)果為敏感外，其他均表現(xiàn)為耐藥(表1)。RFP耐藥菌株的相關(guān)基因突變主要位于rpoB450、rpoB445以及rpoB435密碼子，占81.43%(57/70)，其中rpoBSer450Leu為最常見的突變(45.71%，32/70)，其次是rpoB445密碼子的多種錯義突變(28.57%, 20/70)，主要包括His445Tyr(9株)、His445Leu(5株)和His445Asp(4株)。2.86%(2/70)的耐藥菌株同時存在rpoC補償性突變(表1)。耐藥突變以單密碼子突變?yōu)橹?78.57%，55/70)，組合突變(指一株菌中出現(xiàn)多個耐藥位點)出現(xiàn)的頻率為21.43%(15/70)，其中以rpoB(His445Tyr+Asp435Phe)組合最為常見(5/15)(表1)。

2. 異煙肼耐藥相關(guān)基因突變分布：109株INH耐藥菌株中，102株(93.58%)存在耐藥相關(guān)基因突變，7株(6.42%)未檢測到耐藥相關(guān)位點突變(表2)。TB profiler分析結(jié)果顯示，共檢測到18種耐藥突變形式，突變涉及katG、ahpC、inhA、fabG1基因及其上游調(diào)控區(qū)域，其中以katG(81.37%，83/102)基因突變?yōu)橹鳌?5.29%(87/102)的INH耐藥突變位于katG315密碼子以及fabG1啟動子區(qū)，其中katGSer315Thr為最常見的耐藥突變(57.84%,59/102)，包括57株單基因突變和2株組合突變菌株。有8株(7.34%，8/109)INH耐藥菌株在katG基因的非315密碼子區(qū)發(fā)生突變。fabG1-inhA啟動子區(qū)C-15T的核苷酸改變是INH耐藥相關(guān)的第二大突變(16.67%,17/102)，inhA基因編碼區(qū)突變頻率僅為0.91%(1/109)(表2)。INH耐藥突變以單基因突變?yōu)橹?87.25%，89/102)，組合突變僅占11.93%(13/109)。

表1 利福平耐藥相關(guān)基因突變分布情況

三、 耐藥基因突變與MIC分布

比較122株RFP和INH耐藥菌株的耐藥基因突變與MIC的分布情況(圖1)，不同的耐藥基因突變導(dǎo)致的耐藥水平的高低不同。對于RFP，rpoBS450X、rpoBH445Y、rpoBH445D、rpoBD435V及rpoBS441L突變導(dǎo)致的耐藥為高水平耐藥(MIC均≥16 μg/ml)，ropBH445L突變導(dǎo)致的耐藥水平對應(yīng)的MIC值在2～8 μg/ml之間浮動，rpoBL452P突變導(dǎo)致的耐藥水平較低 (2 μg/ml)。大多數(shù) (93.33%，14/15)組合突變(指一株菌出現(xiàn)多個耐藥突變位點)導(dǎo)致的耐藥為高水平耐藥,而rpoBL430P突變菌株的MIC值僅為0.25 μg/ml,表型藥敏結(jié)果為敏感株，2株野生型菌株(wild-type，wt)的MIC值>16 μg/ml，表現(xiàn)為高水平耐藥。對于INH、katGS315T、katGS315N及ahpC(C-81T)突變引起的耐藥水平較高(MIC≥2 μg/ml)，ahpC(G-48A)引起的耐藥水平高低不等，MIC值跨度范圍較大(0.5～4 μg/ml)。而fabG1(C-15T)突變導(dǎo)致的耐藥水平較低，多在臨界值鄰近位置波動 (0.2 μg/ml)。多位點組合基因突變以及其他突變引起的耐藥水平高低不等。7株野生型菌株為表型耐藥菌株，其耐藥水平差異較大(圖1)。

討 論

結(jié)核分枝桿菌耐藥的主要機制是DNA突變[9]，使得通過檢測基因突變診斷耐藥性成為可能。WGS基于結(jié)核分枝桿菌全基因組(4.4 Mb)的檢測分析提供了關(guān)于多態(tài)性、插入和缺失(indels)的準確信息，彌補了靶向分子檢測手段的缺陷，已成為預(yù)測耐藥性的有力診斷工具[10]。本研究通過采用WGS對RFP和(或)INH耐藥菌株的分子特征進行全面闡述，并將耐藥基因突變與MIC相結(jié)合進行分析，以明確耐藥突變與耐藥水平的關(guān)系，進一步豐富和完善了對RFP和INH基因型是否為耐藥基因型的解釋。

表2 異煙肼相關(guān)耐藥基因突變分布情況

MIC是指小孔內(nèi)完全抑制細菌生長的最低藥物濃度，如果在藥物最高濃度的孔內(nèi)仍有細菌生長則判讀為>最高濃度，微孔板內(nèi)利福平最高濃度為16 μg/m，異煙肼最高濃度為4 μg/ml。 不同顏色表示不同耐藥位點，每個點代表一株菌株，虛線表示臨界濃度值(RFP 1 μg/ml, INH 0.2 μg/ml)，為避免點過度重合，點可能在測定MIC值的上下小范圍浮動。rpoB (S450X)包括:rpoB(S450L)(31株)， rpoB(S450F) (1株)，rpoB(S450W)(1株)；組合突變表示一株菌中含2種及以上的突變；RFP中其他包括rpoB (I491F)(1株)，rpoB (S441L) (2株), rpoB (L430P)(1株)，rpoB(D435Y)(3株); INH中其他包括katG (146_147insTGCA)(1株)，katG (V1A)(1株)，ahpC(C-54T)(1株)，ahpC(C-52T)(1株)，katG (A109V)(1株), ahpC(C-81T)(2株);野生型表示不存在耐藥基因突變(耐異煙肼菌株7株)

本研究結(jié)果顯示，WGS對RFP耐藥菌株的檢出率為97.22%，與Kardan-Yamchi等[11]的研究結(jié)果基本一致，其中2株RFP耐藥菌株(MIC>16 μg/ml)未檢測到耐藥相關(guān)基因突變，重復(fù)藥敏試驗證實表型藥敏試驗結(jié)果可靠，提示可能存在如細胞壁通透性降低、藥物外排泵改變等其他耐藥機制[12]。大量研究表明，超過95%的RFP耐藥菌株的耐藥突變發(fā)生于rpoB基因長度為81bp的熱點區(qū)域(編碼密碼子426～452位)，即利福平耐藥決定區(qū)(RRDR)[13]。本研究檢測到一種發(fā)生在RRDR區(qū)以外的與RFP耐藥相關(guān)的罕見突變rpoBI491F[14]，此發(fā)現(xiàn)提示，僅以檢測rpoB基因RRDR區(qū)的突變位點作為RFP耐藥篩查會導(dǎo)致該類耐藥患者的漏診，進而可能引起攜帶罕見突變的菌株在該地區(qū)的擴散和流行。與以往研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)RFP耐藥相關(guān)位點突變主要出現(xiàn)在rpoBRRDR區(qū)的450、445及435密碼子[15-16]，且最常見的突變類型為S450L(45.71%)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)rpoB450密碼子突變、rpoBH445Y、rpoBH445D突變與RFP高水平耐藥相關(guān)，而rpoBL452P突變?yōu)榈退侥退?，該結(jié)果與Jamieson等[16]研究結(jié)果吻合。值得注意的是，本研究結(jié)果顯示當(dāng)rpoBL452P突變菌株伴有rpoC補償性突變(rpoCI885V)時，其耐藥水平明顯升高(MIC>16 μg/ml)，提示補償性突變可能與耐藥水平的積累效應(yīng)有關(guān)，但由于本研究代償性突變菌株量較少，相關(guān)結(jié)論需要進一步增加菌株量證明。目前，rpoBL430P突變與RFP耐藥相關(guān)已有報道[12,17]，但WHO仍將rpoBL430P列為可信度較低的RFP耐藥突變，且與低水平耐藥相關(guān)[18]，本研究中WGS檢測出的rpoBLeu430Pro突變菌株為表型敏感菌株(重復(fù)藥敏試驗證實藥敏結(jié)果準確)，得出的結(jié)論與WHO的結(jié)論相似，不建議將rpoBL430P突變列為RFP耐藥相關(guān)突變。

與RFP耐藥機制相比，INH的耐藥突變更為復(fù)雜，涉及多個基因[19]。在全球范圍內(nèi)，INH耐藥主要與katG和inhA啟動子的突變有關(guān)，尤其是katG中的密碼子315和inhA啟動子中的-15[20]，本研究兩者組合后INH耐藥菌株的檢出率為85.29%。INH耐藥菌株中，katG315突變的發(fā)生率存在明顯的地理差異[3]，其頻率從42%至90%不等[21]， Zhang等[22]針對華東5省的137株耐INH菌株的研究結(jié)果顯示，katG315突變發(fā)生率為64.4%，而本研究katG315的突變率為81.37%，提示不同區(qū)域katG315突變可能存在差異，但是由于本研究樣本量及區(qū)域代表性均不足，要證明katG315突變區(qū)域性差異需要進一步增加樣本量及采樣點。有研究表明，INH耐藥菌株在katG中發(fā)現(xiàn)315密碼子以外區(qū)域的突變頻率低于1%[3]，但本研究中突變頻率為7.34%，提示我國katG基因突變的多樣性較高。本研究發(fā)現(xiàn)katG密碼子315的突變表現(xiàn)為INH高水平耐藥，而fabG1C15T突變表現(xiàn)為低水平耐藥(MIC≤1 μg/ml)，與來自烏干達的研究報道一致[23]，但多重組合突變無明顯耐藥累積效應(yīng)。另有研究證明，高劑量INH (16～18 mg·kg-1·d-1)可以顯著縮短MDR-TB患者痰培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰時間及改善預(yù)后[24]，由此提示以基因型耐藥量化耐藥水平可以為INH劑量的選擇或藥物的更換提供理論依據(jù)。

研究表明細菌MIC值的高低與疾病治療效果及復(fù)發(fā)有著密切關(guān)系，部分MIC較低的耐藥菌株采用高濃度異煙肼和利福平治療可以達到較好的治療效果，而高濃度耐藥可能達不到預(yù)期的治療效果[25]，同樣敏感菌株中MIC值較高的細菌容易導(dǎo)致患者復(fù)發(fā)[26]，而目前以PCR為基礎(chǔ)的快速分子診斷技術(shù)僅能診斷細菌耐藥與否，不能明確給出突變位點位置及突變方向，本研究提示不同的耐藥位點與MIC值存在一定的關(guān)聯(lián)性，可以為后續(xù)更為精確的快速耐藥分子生物學(xué)診斷技術(shù)的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

本研究的局限性是未將納入的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進行分析，可能潛在的成簇菌株會影響MIC值及耐藥基因的分布。盡管如此，本研究對了解我國部分地區(qū)RFP和INH耐藥基因突變譜有較大貢獻，同時提供了關(guān)于結(jié)核分枝桿菌耐藥基因型和MIC相關(guān)的數(shù)據(jù)，為闡明基因型耐藥與表型耐藥的量化關(guān)系提供了線索，有利于新型診斷技術(shù)的開發(fā)和臨床決策的指導(dǎo)。