劇毒性Ⅱ型核糖體失活蛋白蓖麻毒素和相思子毒素的檢測鑒定方法研究進(jìn)展

梁龍輝, 夏俊美, 劉昌財(cái)*, 劉石磊*

(1. 國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102205; 2. 防化研究院分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102205)

核糖體失活蛋白(RIPs)是一類N-糖苷酶家族的特征毒蛋白,基于蛋白結(jié)構(gòu),RIPs被分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型共3類[1]。Ⅰ型RIPs由單亞基或兩個(gè)亞基通過非肽鍵相連構(gòu)成,相對分子質(zhì)量約為30 kDa,具有RNA-N-糖苷酶活性,例如商陸植物(Phytolaccaacinosa)的PAP蛋白和玉米黍的Maize b-32蛋白等[2,3]。Ⅲ型RIPs全部由單亞基構(gòu)成,相對分子質(zhì)量約為25 kDa,通常以前體形式存在,包括N-糖苷酶活性區(qū)和未知功能區(qū),經(jīng)酶切加工轉(zhuǎn)換生成有活性的ⅡI型RIPs,目前,僅在大麥中分離檢測出Ⅲ型RIP蛋白JIP60[4]。Ⅱ型RIPs是兩個(gè)亞基通過二硫鍵連接構(gòu)成的異二聚體蛋白,含有A、B鏈,其中A鏈為功能鏈,具N-糖苷酶活性;B鏈為結(jié)合鏈,具半乳糖結(jié)合的凝集素活性。與I型和Ⅲ型RIPs相比,Ⅱ型RIPs多了具有凝集素活性的B鏈,導(dǎo)致其毒性遠(yuǎn)高于I型和Ⅲ型RIPs[3]。目前,除在少數(shù)幾種細(xì)菌和真菌中發(fā)現(xiàn)以外,Ⅱ型RIPs主要存在于一些有毒植物中,并且具有明顯的組織特異性,普遍發(fā)現(xiàn)植物成熟種子中Ⅱ型RIPs活性相對較高[2]。3種類型的RIPs結(jié)構(gòu)及代表蛋白質(zhì)如圖1所示。

表 1 劇毒Ⅱ型RIPs及其毒性[2]

圖 1 3種類型核糖體失活蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖[1]Fig. 1 Structure diagram of the three types of ribosome-inactivating proteins (RIPs)[1]

Ⅱ型RIPs發(fā)揮毒性作用的分子機(jī)理是能夠特異、不可逆地催化脫去真核細(xì)胞核糖體的28S rRNA中保守GAGA-莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的第一個(gè)腺苷上的腺嘌呤,導(dǎo)致核糖體失去進(jìn)行正常的蛋白質(zhì)合成功能,從而引起細(xì)胞死亡[5,6]。表1列舉了代表性劇毒Ⅱ型RIPs蛋白的來源及毒性[2]。在已發(fā)現(xiàn)的劇毒Ⅱ型RIPs毒素中,蓖麻毒素和相思子毒素的毒性最強(qiáng)、危害最大。由于分布廣泛、易于獲得、致命性強(qiáng)等特點(diǎn),Ⅱ型RIPs被一些國家軍方深入研究并制作為化學(xué)武器[7],第一次世界大戰(zhàn)期間,美軍曾對蓖麻毒素開展過深入研究,并開展了蓖麻毒素作為吸入劑的測試試驗(yàn)。在第二次世界大戰(zhàn)期間,英國軍方研發(fā)了一種含有蓖麻毒素的復(fù)合炸彈,只是由于難以將大劑量的蓖麻毒素原體轉(zhuǎn)化為氣溶膠狀態(tài),這類武器還未在正式戰(zhàn)爭中使用[4]。但是,蓖麻毒素經(jīng)常被作為生物恐怖戰(zhàn)劑用于恐怖襲擊以及政治暗殺等活動中[7]。1978年在倫敦的國際間諜人員曾用裝有蓖麻毒素的傘尖在公開場所行刺,造成保加利亞作家及持不同政見者喬治·馬可夫中毒身亡。2013年和2020年,美國時(shí)任總統(tǒng)奧巴馬和特朗普都收到了含有蓖麻毒素粉末的信件。此外,Ⅱ型RIPs毒素來源廣泛,易于制備,一旦被不法分子掌握其制備技術(shù),將會成為嚴(yán)重的安全隱患。

因此,無論是化學(xué)武器核查還是生物恐怖防御,對劇毒Ⅱ型RIPs毒素開展檢測研究十分重要,也是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。目前國際禁止化學(xué)武器組織(OPCW)正在組織國際相關(guān)領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)室開展毒素分析演練工作,旨在形成技術(shù)體系完善的檢測能力,并將毒素分析結(jié)果根據(jù)獲得的信息分為4級,分別是:唯一性鑒定(unambiguous)、確證(confirmed)、臨時(shí)性確證(provisional)和未確證(unconfirmed)。由于Ⅱ型RIPs毒素的高度敏感性,OPCW要求對樣品必須實(shí)現(xiàn)最高級別的唯一性鑒定[8],這包括必須提供:1)應(yīng)用質(zhì)譜或電泳檢測的毒素分子量信息;2)應(yīng)用酶解-串聯(lián)質(zhì)譜檢測至少兩條分別來源于A鏈和B鏈肽段標(biāo)志物的質(zhì)譜鑒定結(jié)果;3)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)檢測的毒素定量分析結(jié)果;4)應(yīng)用脫嘌呤或體外細(xì)胞毒性檢測方法對Ⅱ型RIPs毒素A鏈的脫嘌呤活性以及可選的B鏈凝集素活性的鑒定結(jié)果。本課題組所在的防化研究院分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)室作為OPCW指定實(shí)驗(yàn)室代表中國持續(xù)參加該毒素分析演練任務(wù),研究并構(gòu)建了包括酶解質(zhì)譜結(jié)構(gòu)鑒定、ELISA定量檢測以及體外脫嘌呤活性檢測等Ⅱ型RIPs毒素唯一性鑒定技術(shù)體系[9-12]。本文綜述了典型Ⅱ型RIPs蓖麻毒素和相思子毒素的理化性質(zhì)、毒理作用及其檢測鑒定方法研究進(jìn)展,以期為開展相關(guān)科學(xué)研究提供參考依據(jù)。

1 Ⅱ型RIPs的毒性作用機(jī)理

1.1 毒理作用

Ⅱ型RIPs毒素的A鏈具N-糖苷酶活性,特異性水解真核細(xì)胞核糖體60S大亞基28S rRNA保守莖環(huán)結(jié)構(gòu)頂部四核苷酸GA4324GA的腺嘌呤殘基;Ⅱ型RIPs毒素的B鏈具凝集素特性,通過兩個(gè)球狀結(jié)構(gòu)域發(fā)揮活性,每個(gè)結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)半乳糖結(jié)合位點(diǎn),與細(xì)胞表面的半乳糖結(jié)合,介導(dǎo)A鏈進(jìn)入細(xì)胞[13],導(dǎo)致核糖體失活,從而抑制蛋白質(zhì)合成,最終引起細(xì)胞死亡[9-11]。研究[14]顯示,蓖麻毒素與HeLa細(xì)胞具較強(qiáng)的相互作用,在每個(gè)細(xì)胞上檢測到約3.3×107個(gè)毒素結(jié)合位點(diǎn),結(jié)合常數(shù)達(dá)到2.6×107mol-1。然而,Ⅱ型RIPs對植物細(xì)胞展現(xiàn)的毒性遠(yuǎn)不如動物細(xì)胞,原因可能是植物細(xì)胞壁表面的半乳糖結(jié)合位點(diǎn)較少[2]。

Ⅱ型RIPs毒性強(qiáng),相思子毒素和蓖麻毒素的小鼠靜脈注射毒性是神經(jīng)性毒劑維埃克斯(Vx)的2 885倍和385倍。同時(shí),研究[15,16]發(fā)現(xiàn),序列高度同源的Ⅱ型RIPs毒素以及毒素不同亞型之間的毒性具有較大差異。例如,同樣來源于植物蓖麻子中的蓖麻凝集素(RCA120)具有與蓖麻毒素相似的糖苷酶活性,其氨基酸序列與蓖麻毒素A鏈和B鏈的同源性分別達(dá)到了93%和84%,但其細(xì)胞毒性不足蓖麻毒素的十分之一[17]。相思子毒素存在a、b、c和d 4種亞型,同源性高達(dá)78%,但毒性差異較大,其中相思子毒素-b和相思子毒素-c由于其B鏈的凝集素活性較低而只有較弱的細(xì)胞毒性,反之相思子毒素-a與相思子毒素-d具有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性[15,18]。RIPs細(xì)胞毒性產(chǎn)生巨大差異的原因主要與細(xì)胞表面的受體數(shù)量、受體親和力以及RIPs本身的抗降解能力等因素有關(guān)。

1.2 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑

對于Ⅱ型RIPs毒素在細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑,目前公認(rèn)的機(jī)理是[19]: Ⅱ型RIPs毒素通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞膜,一部分返回細(xì)胞膜表面,另一部分進(jìn)入初級內(nèi)體(early endosomes)后被轉(zhuǎn)運(yùn)至次級內(nèi)體(late endosomes);次級內(nèi)體中的毒素大部分進(jìn)入溶酶體中進(jìn)行降解,僅約5%的毒素原體到達(dá)高爾基體反面網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),經(jīng)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER);在蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶和分子伴侶的作用下,Ⅱ型RIPs毒素A鏈和B鏈解離,暴露出疏水區(qū)域的A鏈從ER釋放到細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮毒理作用(見圖2)[7]。此A、B鏈解離代謝途徑在酵母中得到了證實(shí),研究[20]表明進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蓖麻毒素A鏈(RTA)通過誤折疊激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白質(zhì)降解途徑(ERAD),將A、B鏈解離并使RTA穿過ER膜進(jìn)入胞漿后在完整核糖體誘導(dǎo)下重新折疊,恢復(fù)活性,催化28S rRNA脫去腺嘌呤,破壞核糖體結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

圖 2 Ⅱ型RIPs毒素進(jìn)入細(xì)胞及在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸途徑的示意圖[7]Fig. 2 Pathway of type Ⅱ RIP toxins entering cells and transporting in cells[7]ER: endoplasmic reticulum.

2 Ⅱ型RIPs的檢測鑒定方法

由于Ⅱ型RIPs毒素的特點(diǎn)及毒害作用,使得此類致命毒素在化生防護(hù)、化武履約核查和防反化生恐怖等工作中備受關(guān)注。利用分析檢測技術(shù)準(zhǔn)確鑒定環(huán)境及生物醫(yī)學(xué)等樣本中的Ⅱ型RIPs毒素,可為Ⅱ型RIPs毒素的使用取證、核查分析以及染毒人員的救治提供重要技術(shù)依據(jù)?；诮Y(jié)構(gòu)與活性,我們將劇毒性Ⅱ型RIPs毒素的檢測方法分為3大類,第一類是基于免疫等原理的特異性識別檢測方法分析方法,第二類是生物質(zhì)譜分析方法,前兩類均屬于毒素非活性定性定量分析方法;第三類是基于脫嘌呤反應(yīng)活性和細(xì)胞毒性的毒素活性體外檢測分析法。

2.1 特異性識別檢測方法

2.1.1酶聯(lián)免疫吸附檢測

ELISA是將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體專一性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。ELISA方法種類較多且具有敏感度高、特異性強(qiáng)、操作簡便等特點(diǎn),使其在Ⅱ型RIPs毒素的檢測中應(yīng)用最為廣泛。隨著增強(qiáng)比色法和化學(xué)發(fā)光技術(shù)的出現(xiàn),進(jìn)一步提高了ELISA方法的靈敏度[21,22]。Shyu等[23]建立了尿液和血清樣品中蓖麻毒素的雙抗體夾心ELISA定量檢測方法,檢出限達(dá)到了5.0 ng/mL。王晨宇等[24]利用蓖麻毒素單克隆抗體(MAb)3D74和標(biāo)記的小鼠抗-蓖麻毒素單克隆抗體4C13辣根過氧化物酶(HRP),建立了定量檢測血清和大鼠組織樣品中蓖麻毒素的雙夾心ELISA方法,檢出限為1.25 ng/mL,方法應(yīng)用于蓖麻毒素組織分布的定量測定,在靜脈染毒大鼠的心、肝、脾、肺、腎、腸和脂肪等組織中均成功檢測出蓖麻毒素。Leith等[25]應(yīng)用親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法(avidin-biotin-peroxidase complex method, ABC法),建立了動物組織樣本中蓖麻毒素的競爭ELISA檢測方法,檢出限達(dá)到0.2 ng/mL。ELISA方法的缺點(diǎn)是對抗體的要求極為苛刻,一旦出現(xiàn)抗體對同源性抗原間的交叉反應(yīng),極容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。同源蛋白干擾(如蓖麻毒素與蓖麻凝集素RCA120,相思子毒素與相思子凝集素(abrus agglutinin))一直是ELISA方法檢測Ⅱ型RIPs毒素的技術(shù)瓶頸,隨著樣品基質(zhì)復(fù)雜程度的提高,出現(xiàn)假陽性結(jié)果的可能性也大大提高。為了區(qū)分Ⅱ型RIPs同源蛋白蓖麻毒素和RCA120,德國Robert Koch研究中心[26]開發(fā)了蓖麻毒素和RCA120的專屬雙夾心ELISA方法。蓖麻毒素-ELISA雙抗體夾心方法應(yīng)用單抗R18(抗蓖麻毒素A鏈)與單抗R109(抗蓖麻毒素B鏈),對蓖麻毒素的最低檢出限達(dá)到2 pg/mL,定量范圍為5～708 pg/mL,在蓖麻毒素定量線性檢測范圍內(nèi),該方法與同源蛋白RCA120基本不發(fā)生交叉反應(yīng);RCA120-ELISA雙抗體夾心方法應(yīng)用RCA120單抗ARK4和多抗IGY RC22,對RCA120的最低檢出限達(dá)到1 pg/mL,定量范圍為3.00～1 549 pg/mL,在RCA120的線性檢測范圍內(nèi),該方法對同源蛋白蓖麻毒素基本不發(fā)生交叉反應(yīng)。該中心[27]應(yīng)用這兩個(gè)方法,在2013年國際“復(fù)雜基質(zhì)中蓖麻毒素定性和定量檢測”能力考試中,準(zhǔn)確鑒定出9個(gè)樣品中添加的蓖麻毒素或蓖麻凝集素,定量檢測結(jié)果準(zhǔn)確度均達(dá)到90%以上。2017年,He等[28]從7種相思子毒素新型單克隆抗體中分別篩選出專屬相思子毒素A鏈和B鏈的單克隆抗體,并建立了相思子毒素夾心ELISA檢測方法,該方法能夠區(qū)分相思子毒素和其同源蛋白相思子凝集素,對牛奶等基質(zhì),相思子毒素檢出限達(dá)為1 ng/mL。隨著抗體技術(shù)的不斷發(fā)展,ELISA分析法在專屬性方面取得了很大的進(jìn)步,然而,要想獲得專屬性強(qiáng)的抗體,制備成本非常高,而且需要忍受較短的儲存期限和苛刻的保存條件。

2.1.2蛋白質(zhì)免疫印跡法

蛋白質(zhì)印跡法(western blot, WB)是將經(jīng)過凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到固相膜載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,再利用抗原抗體結(jié)合專一性進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。近年來,WB也常應(yīng)用于Ⅱ型RIP毒素的檢測,Lang等[29]采用抗RTA的兔血清作為抗體,建立了蓖麻毒素的WB檢測方法,最低檢出限可達(dá)1 ng。該方法已成功應(yīng)用于兔血清、肝臟組織樣品中蓖麻毒素的檢測,能夠分別在最低加標(biāo)水平為0.67 μg/mL的兔血清、肝臟組織勻漿樣本中檢測出蓖麻毒素。

2.1.3免疫磁性微球及生物傳感檢測

免疫磁性微球(immunomagnetic microspheres, IMMS)檢測將目標(biāo)蛋白抗體與磁性微球進(jìn)行偶聯(lián),特異性捕獲復(fù)雜基質(zhì)中的目標(biāo)蛋白,從而達(dá)到分離純化和檢測目的。免疫磁性微球捕獲具分離速度快、效率高、操作簡單、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),結(jié)合熒光、化學(xué)發(fā)光或電化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù),極大地提升了檢測速率,使檢測時(shí)間由8 h縮短至2～4 h[30,31]?；诿庖咴戆l(fā)展的生物傳感檢測技術(shù),其最大優(yōu)點(diǎn)是能夠通過微型芯片的設(shè)計(jì),實(shí)現(xiàn)多種毒素的同時(shí)快速檢測,是事故現(xiàn)場快速檢測的有效手段。Delehanty等[32]使用配備電荷耦合原件的抗體微陣列免疫芯片,在15 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了霍亂毒素、葡萄球菌腸毒素B(SEB)、蓖麻毒素和芽孢桿菌的同時(shí)檢測,其中蓖麻毒素的檢出限為10 ng/mL。Ligler等[33]對免疫芯片進(jìn)一步優(yōu)化設(shè)計(jì),實(shí)現(xiàn)了6種毒素的同時(shí)檢測。Mu等[34]發(fā)展了一種基于隧道磁阻(TMR)生物傳感器的蓖麻毒素快速檢測新方法,將磁免疫色譜試紙與TMR磁敏傳感器信號檢測有效地結(jié)合在一起,通過檢測功能化磁信號探針在免疫色譜試紙上產(chǎn)生的磁場強(qiáng)度,實(shí)現(xiàn)蓖麻毒素的快速檢測,定量檢測的線性范圍為1 ng/mL～200 μg/mL。該方法克服了復(fù)雜環(huán)境干擾物對毒素檢測的影響,可以滿足水、土壤、食物、血液等復(fù)雜樣品的分析要求。Nasirahmadi等[35]以含有9個(gè)氨基酸的肽段分子印跡聚合物作為模板,在紫外光作用下,在功能單體和表位之間的氫鍵作用下形成分子印跡聚合物,然后使用2.5%的十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.6%乙酸對聚合物進(jìn)行衍生,最終得到生物傳感芯片;將設(shè)計(jì)的納米生物傳感器應(yīng)用于血漿和尿樣等樣品中槲寄生蛋白毒素的快速檢測,檢出限分別為0.5和1.25 ng/μL。

2.1.4適配體分析法

目前已報(bào)道的基于抗體識別原理的免疫分析法具有靈敏度高、專屬性好、耗時(shí)短、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)中Ⅱ型RIPs蛋白蓖麻毒素和相思子毒素的檢測。存在的不足是:方法依賴親和力強(qiáng)、效價(jià)高的抗體,對實(shí)驗(yàn)室抗體制備能力要求較高,且抗體的貯存穩(wěn)定性較差。Shu等[36]通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX),結(jié)合PCR體外擴(kuò)增,經(jīng)過數(shù)輪反復(fù)的體外篩選、擴(kuò)增得到與蓖麻毒素抗體親和力和特異性相當(dāng)?shù)墓押塑账徇m配體,建立了基于適配體識別的多納米孔檢測技術(shù),實(shí)現(xiàn)了蓖麻毒素的有效檢測。Tang等[37,38]使用SELEX技術(shù)篩選出了蓖麻毒素和相思子毒素的適配體并應(yīng)用于兩種毒素的定量檢測,定量限分別為1 μg和0.3 μg。與免疫識別法相比,適配體的最大優(yōu)勢在于穩(wěn)定性好、可反復(fù)使用,但存在篩選過程復(fù)雜、靈敏度較差等問題。因此Ⅱ型RIPs毒素的特異性識別技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)制備穩(wěn)定性好、靈敏度高的適配體。

2.2 生物質(zhì)譜分析

20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的基質(zhì)輔助激光解吸附離子化(MALDI)和電噴霧離子化(ESI)技術(shù),為分析穩(wěn)定性差、難揮發(fā)的生物大分子樣品提供了優(yōu)越的分析手段,越來越多的科學(xué)家將質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于核酸、蛋白質(zhì)等大分子的檢測與鑒定。如今,生物質(zhì)譜法已成為復(fù)雜樣品中蛋白質(zhì)鑒定的基本方法。利用生物質(zhì)譜技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)大分子蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定,2000年,Despeyroux等[39]使用ESI-四極桿(Q)質(zhì)譜對蓖麻毒素進(jìn)行鑒定,蓖麻毒素原體經(jīng)電噴霧離化產(chǎn)生多電荷離子,將數(shù)據(jù)進(jìn)行解卷積計(jì)算,最終得到平均相對分子質(zhì)量為63 kD的質(zhì)譜峰簇,即為蓖麻毒素的相對分子質(zhì)量。高分辨質(zhì)譜的發(fā)展可以提供更為準(zhǔn)確的相對分子質(zhì)量信息,從而有效提升鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性。例如MALDI-飛行時(shí)間(TOF)高分辨質(zhì)譜被報(bào)道用于鑒定完整蓖麻毒素原體,該方法檢測到的蓖麻毒素的相對分子質(zhì)量為62 766 Da[40]。然而,在實(shí)際應(yīng)用中,相對分子質(zhì)量測定法仍無法給出Ⅱ型RIPs毒素的準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)信息[41]。隨后,人們[42]嘗試在分析前將毒素進(jìn)行酶解,再應(yīng)用LC-MS分析肽指紋圖譜或LC-MS/MS靶向測定特異性肽段,通過酶解肽段氨基酸序列的鑒定,鑒定蛋白毒素的序列結(jié)構(gòu),依據(jù)這種策略發(fā)展出了酶解質(zhì)譜分析法。

2.2.1酶解質(zhì)譜鑒定法

與免疫分析方法相比,酶解質(zhì)譜法具有很多優(yōu)勢:1)能夠準(zhǔn)確鑒定毒素特異性肽段的氨基酸序列,從而實(shí)現(xiàn)高度同源蛋白間的差異性鑒定;2)準(zhǔn)確識別毒素蛋白分子內(nèi)的二硫鍵位置及翻譯后修飾信息;3)通過靶向特異性肽段的定量檢測從而實(shí)現(xiàn)Ⅱ型RIPs毒素原體的定量檢測。此外,酶解質(zhì)譜技術(shù)可以與各種分離純化技術(shù)(如凝膠親和、免疫磁珠、一維及二維電泳等)結(jié)合,在質(zhì)譜分析前對目標(biāo)蛋白進(jìn)行富集純化,降低基質(zhì)干擾,實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中Ⅱ型RIPs毒素專一、靈敏的檢測。酶解質(zhì)譜法的分析策略如圖3所示[42]。

圖 3 酶解質(zhì)譜法分析蛋白策略[42]Fig. 3 Strategy of protein analysis by mass spectrometry following enzyme digestion[42]SDS-PAGE: sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis.

酶解質(zhì)譜法將大分子蛋白質(zhì)酶解生成多肽混合物,然后使用高分辨質(zhì)譜技術(shù)(LC-Q-TOF MS或MALDI-TOF MS)分析肽指紋圖譜(PMF)或LC-ESI-MS/MS靶向測定特異性肽段,從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的鑒定。2001年,Darby[40]首次將PMF法應(yīng)用于蓖麻毒素的鑒定,分別使用LC-Q-TOF MS和MALDI-TOF MS對蓖麻毒素的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析,結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索,成功鑒定出蓖麻毒素的14條肽段。Sousa等[43]采用加速溶劑萃取(ASE)技術(shù)處理含有蓖麻毒素的復(fù)雜樣品,經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)、胰蛋白酶解后采用MALDI-TOF MS對酶解的肽段進(jìn)行鑒定,通過PMF數(shù)據(jù)庫檢索,鑒定出蓖麻毒素的19條肽段,然后對其中3條唯一性肽段進(jìn)行MALDI-TOF MS/MS二級質(zhì)譜檢測,實(shí)現(xiàn)了蓖麻毒素的唯一性鑒定。

這些方法雖然準(zhǔn)確度高,但在酶解前需要變性、還原和烷基化等步驟,整個(gè)過程步驟多、周期長。為解決這一問題,有機(jī)溶劑輔助直接酶解蛋白質(zhì)原體的方法被開發(fā)并應(yīng)用于蓖麻毒素的分析鑒定,例如在酶解樣品中使用甲醇等能夠有效促進(jìn)胰蛋白酶解效率、縮短酶解時(shí)間,這些方法在蓖麻毒素的鑒定與高靈敏檢測等方面都取得了較好的結(jié)果。目前,T7A、T11A、T6B和T18B是蓖麻毒素的胰蛋白酶解肽段中使用最多的代表性肽段標(biāo)識物,被廣泛應(yīng)用于粉末、蓖麻子粗提物、牛奶、飲料等復(fù)雜基質(zhì)中痕量蓖麻毒素的唯一性鑒定[41,44-49]。但是,該方法存在酶解效率較低、易發(fā)生漏切等缺點(diǎn)。本課題組[11]研究發(fā)現(xiàn)乙腈有助于胰蛋白酶準(zhǔn)確酶解毒素原體、高效生成標(biāo)識性肽段,并開發(fā)和建立了一種乙腈輔助胰蛋白酶直接酶解蓖麻毒素原體的方法,顯著提高了酶解效率,將酶解反應(yīng)時(shí)間從18 h減至4 h。

隨著技術(shù)的不斷發(fā)展,近年來,免疫磁珠、凝膠親和等技術(shù)常作為高效的樣品制備手段被應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)物的分離與純化,與質(zhì)譜等技術(shù)相結(jié)合,在蛋白質(zhì)鑒定等方面發(fā)揮著重要的作用。2011年,美國疾控中心(CDC)的McGrath等[46]通過制備修飾蓖麻毒素抗體的免疫磁珠,對飲用水、牛奶、果汁等基質(zhì)中的蓖麻毒素進(jìn)行富集,經(jīng)胰蛋白酶酶解,利用液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜靶向鑒定蓖麻毒素A鏈和B鏈的標(biāo)志性肽段(T7A和T18B),最終實(shí)現(xiàn)了蓖麻毒素的高靈敏鑒定與定量分析,最低檢出限達(dá)到0.64 ng/mL。2015年,Fredriksson等[50]采用半乳糖凝膠樹脂填充柱,對飲用水,飲料、粉末以及擦拭樣品中的典型劇毒Ⅱ型RIPs毒素(蓖麻毒素、相思子毒素、蓖麻凝集素)進(jìn)行選擇性富集,結(jié)合胰蛋白酶解和高分辨質(zhì)譜靶向檢測技術(shù),實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜樣品中Ⅱ型RIPs毒素準(zhǔn)確鑒定。Feldberg等[51]采用瓊脂糖凝膠親和富集結(jié)合三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了復(fù)雜環(huán)境樣品中痕量蓖麻毒素的檢測方法;該方法對從不同地理區(qū)域獲取的60種不同環(huán)境樣本(例如土壤、瀝青和植被)進(jìn)行測定,蓖麻毒素的最低檢出限達(dá)到1 ng/mL(g)。

除了使用胰蛋白酶解以外,近年來,科學(xué)工作者們還探索了其他酶解方法。本課題組[12]系統(tǒng)研究了蓖麻毒素在不同蛋白酶解(糜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶/胞內(nèi)蛋白酶(Glu-C)串聯(lián)酶解)體系中的最優(yōu)酶解條件,采用LC-ESI-Q/TOF MS高分辨質(zhì)譜對酶解產(chǎn)生的肽段進(jìn)行鑒定,結(jié)合美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫檢索比對,對所有肽段的專屬性進(jìn)行確認(rèn)與分類,最終篩選鑒定出專屬性強(qiáng)且質(zhì)譜響應(yīng)好的肽段作為蓖麻毒素的肽段標(biāo)志物,大大豐富了唯一性鑒定蓖麻毒素肽段標(biāo)志物的選擇范圍。此外,本課題組[52]通過離子交換、HPLC等方法對我國東北槲寄生植物(Viscum.OloratumNakai)中的槲寄生毒素進(jìn)行分離純化,使用Glu-C酶解槲寄生毒素,然后采用MALDI-TOF MS對酶解的肽段進(jìn)行測定,首次鑒定出含有四對二硫鍵的槲寄生毒素B7。Braun等[53]報(bào)道了使用糜蛋白酶蓖麻毒素進(jìn)行酶解過夜,使用高分辨液相色譜-質(zhì)譜對糜蛋白酶酶解產(chǎn)生的兩條蓖麻毒素肽段進(jìn)行靶向鑒定,成功實(shí)現(xiàn)了植物提取物和土壤樣品中蓖麻毒素的準(zhǔn)確鑒定。

近年來,酸消解技術(shù)也被用于Ⅱ型RIPs毒素的分析鑒定。Chen等[54]采用微波輔助-熱酸消解方法選擇性水解蓖麻毒素氨基酸序列中的天冬氨酸殘基,水解時(shí)間僅需要15 min,大大提高了反應(yīng)效率,結(jié)合MALDI-TOF MS檢測,成功鑒定出蓖麻毒素中的二硫鍵肽段,為蓖麻毒素的物證鑒定提供了一種可靠的技術(shù)手段。

2.2.2質(zhì)譜定量檢測

隨著LC-MS技術(shù)的發(fā)展,目前除了實(shí)現(xiàn)痕量毒素的定性檢測外,更多的努力被放在定量分析研究中。液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(LC- QQQ MS)的多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)和液相色譜-四極桿-軌道離子阱質(zhì)譜(LC-Q-Orbitrap MS)的平行反應(yīng)監(jiān)測模式(PRM)在較寬的動態(tài)范圍內(nèi)具有很好的線性響應(yīng),在Ⅱ型RIPs毒素的定量分析方面得到了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。質(zhì)譜定量離不開同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo),目前的研究大多基于同位素標(biāo)記多肽為內(nèi)標(biāo)的絕對定量策略(absolute quantitation peptide strategy, AQUA):在質(zhì)譜分析前,向樣品中添加已知濃度的同位素標(biāo)記的多肽內(nèi)標(biāo),由于內(nèi)標(biāo)肽段與目標(biāo)肽段標(biāo)識物具有相同的色譜和質(zhì)譜特征,通過比較定量肽段和內(nèi)標(biāo)肽段的絕對豐度,實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品中目標(biāo)蛋白質(zhì)的定量檢測。Schieltz等[49]采用AQUA方法和酶解質(zhì)譜策略,對18種不同產(chǎn)地植物蓖麻子中的蓖麻毒素和RCA120進(jìn)行定量檢測,該研究揭示了不同產(chǎn)地蓖麻子中兩種Ⅱ型RIPs毒素的含量差異信息。McGrath等[46]以同位素內(nèi)標(biāo)肽段建立了飲用水、牛奶、果汁等食源性基質(zhì)中蓖麻毒素的免疫捕獲-酶解質(zhì)譜定量檢測方法,線性范圍在10～10 000 fmol/mL。2017年,Hansbauer等[18]應(yīng)用胰蛋白酶解結(jié)合液質(zhì)檢測不同亞型相思子毒素肽段標(biāo)志物,首次實(shí)現(xiàn)了不同亞型相思子毒素和相思子總蛋白的定量檢測。

AQUA定量方法雖然顯著提高了復(fù)雜樣品中目標(biāo)蛋白質(zhì)的定量準(zhǔn)確度,但是由于內(nèi)標(biāo)肽段無法兼容復(fù)雜樣品的前處理程序,只能在樣品制備后加入內(nèi)標(biāo),導(dǎo)致定量結(jié)果仍然存在偏差。針對以上問題,科學(xué)家[55,56]提出了以穩(wěn)定同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)為內(nèi)標(biāo)的蛋白質(zhì)內(nèi)標(biāo)絕對定量(protein standard absolute quantification, PSAQ)策略。基于無細(xì)胞快速表達(dá)系統(tǒng),在體外表達(dá)合成穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)蛋白質(zhì),由于PSAQ內(nèi)標(biāo)與目標(biāo)蛋白質(zhì)具有相近的生化性質(zhì),因此可以在分析的最初階段將蛋白質(zhì)標(biāo)樣加入樣品中,在樣品制備及酶解過程中發(fā)生的蛋白質(zhì)損失將不會影響蛋白質(zhì)定量的準(zhǔn)確性。Dupré等[57]使用單鏈PSAQ內(nèi)標(biāo)標(biāo)記法結(jié)合Q-Orbitrap高分辨質(zhì)譜定量研究體液、食品等復(fù)雜基質(zhì)中的蓖麻毒素A鏈、金黃葡萄球菌毒素B和產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素(clostridium perfringens)3種毒素,檢出限均達(dá)到1 ng/mL。該方法的主要是缺點(diǎn)是PSAQ內(nèi)標(biāo)的合成制備難度大、成本高昂,僅適用于Ⅱ型RIPs毒素單鏈的定量檢測。全毒素內(nèi)標(biāo)的設(shè)計(jì)與制備,將是實(shí)現(xiàn)Ⅱ型RIPs毒素絕對定量檢測的關(guān)鍵,然而,目前應(yīng)用無細(xì)胞體外表達(dá)和細(xì)胞表達(dá)技術(shù)均未實(shí)現(xiàn)具鏈間二硫鍵的Ⅱ型RIPs全蛋白毒素同位素內(nèi)標(biāo)的生物合成。

2.3 毒性活性的體外檢測

免疫分析法和酶解質(zhì)譜法成功應(yīng)用于Ⅱ型RIPs毒素的定性定量檢測,但無法鑒定毒素是否還保持毒性。Ⅱ型RIPs毒素的活性鑒定在反應(yīng)機(jī)理評估、酶學(xué)性質(zhì)研究、尋找抑制劑以及毒素的檢測診斷等方面具有重要意義。由于該類毒素的高度敏感性,禁止化學(xué)武器組織在核查分析中,不僅要求對其進(jìn)行定性定量檢測,同時(shí)還要求對其活性進(jìn)行準(zhǔn)確表征。目前,對于Ⅱ型RIPs毒素的活性鑒定一般選擇脫嘌呤活性的間接測定法和細(xì)胞毒性測定法。

2.3.1脫嘌呤活性體外檢測

1987年Endo等[58]開發(fā)的苯胺裂解測定法是最早用于檢測Ⅱ型RIPs毒素的脫嘌呤活性的分析方法;結(jié)果表明,28S rRNA經(jīng)Ⅱ型RIPs處理后遷移率發(fā)生變化,對核糖核酸酶產(chǎn)生了抗性,實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明,Ⅱ型RIPs以水解方式剪切了28S rRNA中A4324位的N-糖苷鍵;脫去A4324后,28S rRNA的第50和30個(gè)磷酸二酯鍵變得不穩(wěn)定,聚丙烯酰胺凝膠染色結(jié)果顯示,苯胺處理后釋放出約400個(gè)核苷酸的RNA片段,實(shí)現(xiàn)蓖麻毒素的活性鑒定。

2010年,Melchior等[59]開發(fā)了一種定量實(shí)時(shí)PCR檢測方法,該方法利用逆轉(zhuǎn)錄酶將一個(gè)腺嘌呤插入模板rRNA中發(fā)生脫嘌呤反應(yīng)的堿基位點(diǎn)上,使該位點(diǎn)從T轉(zhuǎn)化為A;在55 ℃、pH 5.0條件下,蓖麻毒素與模板RNA相互作用,然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA;使用定量PCR法對突變和未突變的RNA進(jìn)行定量檢測,實(shí)現(xiàn)蓖麻毒素對RNA底物的脫嘌呤活性鑒定。該方法被應(yīng)用于檢測環(huán)境樣品和食品基質(zhì)中的低濃度蓖麻毒素的脫嘌呤活性,方法靈敏度高、重復(fù)性好。

1989年,Zamboni等[60]首次使用HPLC檢測到真核生物核糖體經(jīng)脫嘌呤反應(yīng)釋放的腺嘌呤:將蓖麻毒素等Ⅱ型RIPs蛋白與真核生物核糖體進(jìn)行孵育反應(yīng),經(jīng)乙醇提取、氯乙醛衍生,最終使用熒光檢測器通過HPLC檢測腺嘌呤,氯乙醛衍生大大提高了HPLC對腺嘌呤的檢測靈敏度,蓖麻毒素的檢測限為100 ng。后來的研究發(fā)現(xiàn),Ⅱ型RIPs毒素還可以對DNA、RNA及poly(A)底物發(fā)生脫嘌呤作用[61,62]。Chen等[63]采用HPLC方法研究RTA對莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA底物脫嘌呤反應(yīng)機(jī)理及動力學(xué),結(jié)果表明,RTA對RNA底物的催化速率在pH 4.0條件下達(dá)到最高。HPLC分析法的缺點(diǎn)是,氯乙醛衍生物必須進(jìn)一步用飽和的乙醚萃取,并通過0.45 μm過濾等操作才能用于HPLC分析,導(dǎo)致該方法步驟復(fù)雜,耗時(shí)較長。

為了避免HPLC分析法操作繁瑣的衍生步驟,質(zhì)譜、表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)等技術(shù)被引入,用于毒素的脫嘌呤活性檢測。Becher等[64]將抗體磁珠富集后的蓖麻毒素與人工合成的RNA底物在體外特定的條件下孵育,使用LC-MS檢測樣品中的腺嘌呤,對蓖麻毒素的最低檢出限達(dá)到0.1 ng/mL。Suzanne等[65]應(yīng)用抗體磁珠富集純化復(fù)雜樣品中的蓖麻毒素,然后與人工合成的單鏈DNA底物進(jìn)行體外脫嘌呤反應(yīng),最后利用MALDI-TOF/MS檢測DNA底物在反應(yīng)前后相對分子質(zhì)量的變化,實(shí)現(xiàn)樣品中活性蓖麻毒素的鑒定。Tang等[66]提出了一種基于SERS檢測的蓖麻毒素活性檢測方法,將連接單鏈DNA底物多聚A(21dA)的金納米探針組裝在二氫硫辛酸修飾的硅晶片(SH-Si)上,組成SERS芯片,蓖麻毒素與SERS芯片進(jìn)行反應(yīng),通過監(jiān)測脫嘌呤反應(yīng)引起的腺嘌呤SERS信號的衰減實(shí)現(xiàn)活性蓖麻毒素的快速檢測。最近,研究人員[67]還發(fā)展了脫嘌呤活性分析與熒光納米探針技術(shù)的聯(lián)用分析方法,并應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)中活性Ⅱ型RIPs毒素的現(xiàn)場檢測。

脫嘌呤分析法成功實(shí)現(xiàn)了痕量Ⅱ型RIPs毒素的活性鑒定,但是,此類方法使用的脫嘌呤DNA及RNA底物在酸性條件下都會發(fā)生不同程度的自水解反應(yīng),陰性對照具有較高的響應(yīng),導(dǎo)致方法靈敏度降低。目前在實(shí)際樣品檢測中,一般以高于10倍陰性對照響應(yīng)作為檢出標(biāo)準(zhǔn)。通過底物序列的設(shè)計(jì)優(yōu)化,篩選出不易自水解的最適底物以提高檢測方法的靈敏度和專屬性,是此類方法迫切需要解決的技術(shù)難題和未來的發(fā)展趨勢。

2.3.2體外細(xì)胞毒性檢測

對于Ⅱ型RIPs毒素的活性,常采用基于實(shí)驗(yàn)動物和細(xì)胞的毒性分析法。董娜等[68]采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮bai唑溴鹽(MTT)比色法探索了蓖麻毒素對不同細(xì)胞以及小鼠各主要組織臟器的毒性作用;細(xì)胞活性檢測結(jié)果表明,不同濃度的蓖麻毒素對Caco-2、MDCK、MDCK-MDR1、HepG2和H1299細(xì)胞均有一定的毒性,毒素濃度與細(xì)胞毒性呈現(xiàn)明顯的效量關(guān)系,MDCK細(xì)胞對蓖麻毒素最為敏感;病理學(xué)檢測結(jié)果表明,在經(jīng)灌胃方式中毒的小鼠血清中發(fā)現(xiàn)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、甘油三酯(TG)、肌酐(CREA)均有升高趨勢,表明小鼠中毒3 h內(nèi)肝功能和腎功能已出現(xiàn)一定程度的損傷。

2005年,Zhao等[69]開發(fā)了一種基于螢光素酶表達(dá)的非放射性測定方法,使用半衰期短的編碼熒光素酶不穩(wěn)定衍生物的cDNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞;熒光素酶cDNA通過腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞中,并利用熒光素酶的光輸出來測量蛋白質(zhì)的合成水平,從而實(shí)現(xiàn)Ⅱ型RIPs毒素的毒性測定。此外,該團(tuán)隊(duì)[69]還開發(fā)出一種基于96和384孔的高通量篩選方法,用于檢測不同細(xì)胞對Ⅱ型RIPs毒素的敏感性;使用此分析方法篩選了針對Ⅱ型RIPs毒素的14 000個(gè)小分子文庫,發(fā)現(xiàn)兩種化合物在Ⅱ型RIPs毒素的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)步驟中起抑制作用,該方法證明了使用非放射性分子篩選Ⅱ型RIPs毒素抑制劑的可行性。Wahome等[70]在2010年開發(fā)了一種簡化的細(xì)胞熒光素酶測定法,該方法不需要用熒光素酶cDNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞,將Vero細(xì)胞接種在384孔板中,孵育過夜,加入螢光素酶以及螢光素底物,隨后進(jìn)行蓖麻毒素處理;螢光素酶的熒光信號強(qiáng)度與細(xì)胞ATP水平成正比,從而可以反映細(xì)胞的活力水平。該方法用于Ⅱ型RIPs毒素的活性測試靈敏度和信噪比均較高,并且具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

綜上,雖然脫嘌呤分析法和體外細(xì)胞毒性檢測方法能夠?qū)崿F(xiàn)Ⅱ型RIPs毒素的活性鑒定,但是目前此類方法無法區(qū)分Ⅱ型RIPs毒素的種類,需要結(jié)合酶解質(zhì)譜等分析方法才能實(shí)現(xiàn)Ⅱ型RIPs毒素的唯一性鑒定。

3 結(jié)論與展望

由于Ⅱ型RIPs毒素具有毒性極強(qiáng)、制備簡便以及難以防治的特點(diǎn),其快速、準(zhǔn)確的識別檢測技術(shù)已成為各國反化生恐怖發(fā)展規(guī)劃中的重要工作。然而,針對Ⅱ型RIPs毒素的檢測方法各有優(yōu)缺點(diǎn),尚未有一種分析方法能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)Ⅱ型RIPs毒素的準(zhǔn)確鑒定與活性檢測。正如OPCW對生物毒素唯一性鑒定的要求標(biāo)準(zhǔn),實(shí)現(xiàn)劇毒Ⅱ型RIPs毒素(蓖麻毒素,相思子毒素等)的唯一性鑒定必須要同時(shí)準(zhǔn)確獲得其結(jié)構(gòu)鑒定信息、毒素與抗體的免疫識別信息以及毒性活性3個(gè)方面的完整信息。因此,在實(shí)際樣品的準(zhǔn)確分析中,往往需要多種檢測方法的聯(lián)合使用,發(fā)展劇毒性Ⅱ型RIPs毒素的準(zhǔn)確、靈敏、特異的多重檢測方法是當(dāng)前乃至今后生物毒素唯一性鑒定研究工作的重點(diǎn)。