黃 石，段賢春，潘凌宇，陳 燕1，，汪永忠

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)1.藥學(xué)院，2.第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，安徽 合肥 230031)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜增生、關(guān)節(jié)破壞為特點的自身免疫系統(tǒng)疾病，主要影響外周關(guān)節(jié)，也可累及關(guān)節(jié)外器官，如皮膚、心臟、肺、眼睛等[1]；其病理變化主要從關(guān)節(jié)滑膜的破壞開始，隨之出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨、骨破壞，進而導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙，甚至關(guān)節(jié)功能喪失。RA的發(fā)病機理尚不明確，西醫(yī)治療主要應(yīng)用非甾體抗炎藥、改善病情的抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素、生物制劑等，雖然這些藥物能有效控制RA的發(fā)作，極大的提高RA的臨床療效，但其副作用較多，患者依從性不高，所以尋找新的治療方法極具意義。而中藥因其治療RA療效顯著、副作用小、耐受性好，近年來日益受到關(guān)注。

桃紅四物湯出自清代吳謙等所著的《醫(yī)宗金鑒》，由桃仁、紅花、當(dāng)歸、熟地、白芍、川芎六味中藥組成。桃紅四物湯的功效為活血化瘀、養(yǎng)血補血，臨床常在該方基礎(chǔ)上進行藥味加減，用于治療婦科、心腦血管及RA等疾病，F(xiàn)u等[2]發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯通過Wnt/IP3R/CAMKII途徑減輕缺血再灌注大鼠成肌細胞鈣超載和炎癥反應(yīng)；Duan等[3-4]運用質(zhì)譜分析技術(shù)得到桃紅四物湯入血及入腦成分，再結(jié)合高通量測序技術(shù)揭示桃紅四物湯治療實驗性大鼠大腦中動脈栓塞的潛在靶點；李肖等[5]將桃紅四物湯與麻黃附子細辛湯通過加減治療RA，療效顯著。但桃紅四物湯發(fā)揮治療RA作用的藥效機制有待進一步闡明。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性、系統(tǒng)性與中醫(yī)藥的整體觀、辯證論等基本理論相吻合，應(yīng)用于中醫(yī)藥可以很好的闡述其物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制[6]。據(jù)此本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究手段，探討桃紅四物湯治療RA的可能作用機制，為RA的治療提供思路和參考。

1 材料與方法

1.1 桃紅四物湯活性成分的獲取基于課題組前期超高效液相色譜-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MSE)收集的桃紅四物湯體外化學(xué)成分[7]，并與中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)中的結(jié)果進行整合，得到可能存在于桃紅四物湯中的化合物。將這些化合物按照口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%、類藥性(drug-like, DL)≥0.18進行篩選，選出最可能發(fā)揮作用的有效活性成分。

1.2 桃紅四物湯成分的靶點預(yù)測使用Zinc網(wǎng)站(zinc.docking.org)和PubChem網(wǎng)站(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下載活性成分的mol2文件或SDF文件，將其上傳至PharmMapper數(shù)據(jù)庫(www.lilab-ecust.cn/pharmmapper)，PharmMapper可以對成分的潛在靶點進行識別，勾選“Homo Sapiens”，等待預(yù)測結(jié)果。

1.3 RA疾病靶點的獲取通過OMIM數(shù)據(jù)庫(http://omim.org)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org)搜索“rheumatoid arthritis”，獲取RA靶點。

1.4 藥物成分靶點與疾病靶點映射獲得桃紅四物湯相關(guān)靶點以及RA的靶點之后，取兩者的交集靶點蛋白，這樣可提高篩選靶點的準確性，增大結(jié)果的可信性，再用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，利用軟件中的“Network Analyzer”功能對“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)進行拓撲學(xué)分析，桃紅四物湯的成分和靶點是網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(node)，邊(edge)代表中藥成分和其作用靶點之間的聯(lián)系。根據(jù)拓撲分析結(jié)果篩選出桃紅四物湯作用于RA的關(guān)鍵化合物。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點篩選將獲得的交集靶點上傳至 STRING 數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/cgi/input.pl)，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，將蛋白種類設(shè)置為人源，最低相互作用閾值(minimumrequired interaction score)設(shè)置為“highest confidence(0.900)”，同時設(shè)置隱藏游離點，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。下載PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，借助其“Network Analyzer”功能對PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，度值(degree)、介數(shù)(betweenness centrality，BC)均大于平均值的節(jié)點為關(guān)鍵靶點。

1.6 富集分析及“桃紅四物湯-組方藥材-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將“1.4”項結(jié)果中的交集靶點基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov)進行GO功能富集和KEGG通路富集，其中GO分析包括生物過程(biological process，BP)、細胞組成(cellular component，CC)以及分子功能(molecular function，MF)3個部分，設(shè)定FDR值獲得GO與KEGG富集結(jié)果，根據(jù)富集結(jié)果做氣泡圖。利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“桃紅四物湯-組方藥材-成分-靶點-通路”圖。

1.7 關(guān)鍵成分與關(guān)鍵靶點的分子對接驗證將“1.4”項結(jié)果中排名前三的關(guān)鍵化合物在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取其mol2格式文件，PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前三的關(guān)鍵靶點蛋白，在PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org)中獲取其結(jié)構(gòu)，利用AutoDock vina軟件將關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點進行分子對接，以結(jié)合能作為評價指標對對接結(jié)果進行評價，并用pymol軟件對結(jié)果進行展示。

2 結(jié)果

2.1 桃紅四物湯活性成分篩選桃紅四物湯所含107種有效成分經(jīng)篩選后，共得到38個活性成分，其中桃仁3個、紅花6個、當(dāng)歸18個、熟地2個、白芍3個、川芎16個，熟地與紅花的共有成分1個，川芎與當(dāng)歸的共有成分7個，白芍、紅花與熟地的共有成分1個，見Tab 1。

Tab 1 The active ingredients of Tao-Hong-Si-Wu decoction

2.2 桃紅四物湯活性成分-靶點篩選整合PharmMapper網(wǎng)站上桃紅四物湯相關(guān)靶點，得到8 450個。去除重復(fù)值后，得到相關(guān)人類基因靶點共441個。

2.3 疾病-靶點篩選在OMIM數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索“rheumatoid arthritis”，獲取RA疾病靶點，剔除重復(fù)，共得到4 167個。

2.4 藥物活性成分靶點與疾病靶點的映射將桃紅四物湯活性成分對應(yīng)的441個作用靶點與4 167個RA相關(guān)靶點取交集，得到桃紅四物湯潛在作用于RA疾病靶點291個，如下Fig 1，其中桃仁對應(yīng)169個，紅花對應(yīng)196個，當(dāng)歸對應(yīng)237個，熟地對應(yīng)163個，白芍對應(yīng)203個，川芎對應(yīng)225個，構(gòu)建“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)中有329個節(jié)點(桃紅四物湯中化合物節(jié)點38個，靶點基因節(jié)點291個)，5 037條邊。在網(wǎng)絡(luò)中，一個節(jié)點的度值表示網(wǎng)絡(luò)中與節(jié)點相連線的條數(shù)，度值越大則表示該化合物發(fā)揮作用的可能性越大。利用Cytoscape 3.7.1中的“Network Analyzer”對網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的特性進行拓撲學(xué)分析，網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點的平均度值為129.153 8，平均介數(shù)為0.024 8。度值、介數(shù)均超過平均值的化合物節(jié)點有11個，見Tab 2，推測這些化合物可能是桃紅四物湯發(fā)揮治療RA作用的關(guān)鍵化合物。

Fig 1 Intersection of predicted targets of THSWD and RA

2.5 靶點PPI網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵靶點的篩選將“2.4”項下得到的291個靶點基因?qū)?STRING 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction Networks，PPI)網(wǎng)絡(luò)。PPI網(wǎng)絡(luò)中包含232個節(jié)點和1 046條邊，表明該網(wǎng)絡(luò)中有232個靶點可以發(fā)生相互作用，共產(chǎn)生1 046次相互作用關(guān)系。拓撲學(xué)參數(shù)顯示，網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點的平均度值為9.017 2，平均介數(shù)為0.010 1。度值、介數(shù)均超過平均值的節(jié)點有33個，由Cytoscape軟件進行可視化展示，其中，節(jié)點大小與顏色表示度值的大小，節(jié)點越大，對應(yīng)的度值越大，如Fig 2所示，靶點具體信息見Tab 3，推測這些靶點可能是桃紅四物湯治療RA的關(guān)鍵靶點。

Tab 2 Basic information of hubcompounds of THSWD in RA treatment

2.6 富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫對桃紅四物湯治療RA的291個靶點進行GO功能富集分析以及KEGG信號通路富集分析(FDR<0.01)，GO富集分析中包括BP的相關(guān)條目59個；MF的相關(guān)條目32個；CC的相關(guān)條目15個。BP主要包括凋亡過程的負調(diào)控、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路、肽基酪氨酸自磷酸化等；MF主要包括類固醇激素受體、蛋白酪氨酸激酶活性等；CC主要包括胞漿、胞外體等。將篩選出的前10個BP、MF、CC通過R語言相關(guān)程序作氣泡圖，見Fig 3。KEGG通路富集篩選得到34條信號通路(FDR<0.01),與RA相關(guān)的通路有FoxO,Ras及VEGF等14條，見Fig 4。

2.7 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將桃紅四物湯治療RA的38個成分，291個靶點以及KEGG富集分析的14條可能與RA相關(guān)的通路等構(gòu)建“桃紅四物湯-組方藥材-成分-靶點-通路”的網(wǎng)絡(luò)圖，如Fig 5所示。

2.8 分子對接驗證選取PPI 網(wǎng)絡(luò)中排名前3的關(guān)鍵靶點蛋白(MAPK1、SRC、PIK3R1)與表2的排名前3的關(guān)鍵活性成分(Hydroxysafflor-Yellow-A、Rutin、Kaempferol)進行對接，見Tab 4，其中Rutin與SRC的結(jié)合性最好，pymol可視化后見Fig 6。

3 討論

RA在中醫(yī)理論中屬于“痹證”的范疇，主要由于機體氣血虛弱、正氣不足，導(dǎo)致風(fēng)寒濕邪侵襲機體，停滯于肌肉筋膜、骨骼關(guān)節(jié)，加之寒邪收澀凝結(jié)，最后引起關(guān)節(jié)重著、冷痛、屈伸受限，甚至關(guān)節(jié)變形的一種慢性疾患[8]?！额愖C治裁·痹證》說：“痹久必有瘀血”，祖國醫(yī)學(xué)亦有“不通則痛，通則不痛”之言。作為活血化瘀的代表方劑桃紅四物湯，可使RA患者關(guān)節(jié)經(jīng)絡(luò)中的瘀滯消失從而減輕疼痛。現(xiàn)代藥理研究證實，桃紅四物湯有抑制骨質(zhì)疏松、填充骨髓等功效，可使RA患者的骨質(zhì)疏松化恢復(fù)正常，還可以降低炎癥，使毛細血管有充分的通透性，減少炎癥滲出，改善血液循環(huán)，促進炎癥吸收[9]。

Tab 3 Basic information of hub targets of THSWD in RA treatment

Tab 4 Molecular docking results

通過對38個成分和291個交集靶點構(gòu)建“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，結(jié)果表明成分中的羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor-yellow-A)、山奈酚(kaempferol)等11個化合物可能是桃紅四物湯發(fā)揮治療RA作用的關(guān)鍵活性成分。羥基紅花黃色素A已被證實可緩解多種炎癥因子的表達，姚弘毅等[10]發(fā)現(xiàn)羥基紅花黃色素A可通過降低骨性關(guān)節(jié)炎大鼠不同部位相關(guān)炎癥因子含量及抑制Notch1信號通路激活進而減輕軟骨損傷。山奈酚[11]可通過阻斷MAPK通路和生長因子受體3-核糖體S6激酶2信號軸，來發(fā)揮治療RA作用。

PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，桃紅四物湯治療RA的核心靶點包括AKT1、MAPK1、JAK2等。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的家族成員之一，AKT1可調(diào)控mTOR信號通路，減少細胞凋亡，上調(diào)AKT1蛋白的表達，可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞增殖[12]。MAPK1即絲裂原活化蛋白激酶1，MAPK參與了RA關(guān)節(jié)的炎癥和組織破壞，與RA病理狀態(tài)的維持及病情進展密切相關(guān)。JAK2屬于酪氨酸蛋白激酶家族，RA患者滑膜中細胞因子與JAK2結(jié)合，從而激活JAK/STAT信號通路，致使關(guān)節(jié)破壞，鄧龍飛等[13]發(fā)現(xiàn)威靈仙總皂苷通過抑制滑膜組織中JAK2mRNA表達及p-JAK2/JAK2 相對表達，進而調(diào)控JAK/STAT信號通路發(fā)揮治療RA作用。以上結(jié)果提示，桃紅四物湯可能通過調(diào)控軟骨細胞凋亡、炎癥細胞因子激活、細胞自噬或凋亡等途徑的靶點發(fā)揮治療RA作用。

Fig 2 PPI network of THSWD in treating potential targets of RA

Fig 3 Bubble diagram of GO function enrichment of potential targets from THSWD for RA treatment

Fig 4 Bubble diagram of KEGG enrichmentof potential targets from THSWD for RA treatment

KEGG通路富集結(jié)果表明，桃紅四物湯通過調(diào)控FoxO、Ras及VEGF等信號通路發(fā)揮對RA的治療效果，其中已有多條通路被證實參與了RA的發(fā)生發(fā)展。FoxO屬于叉頭框蛋白(forkhead box，F(xiàn)OX)家族中的一個亞類，當(dāng)機體刺激FoxO時，修復(fù)和自由基清除等功能的基因表達，使細胞凋亡、修復(fù)和降解的轉(zhuǎn)錄程序啟動，同時幾種前凋亡基因也誘導(dǎo)損傷或異常細胞發(fā)生凋亡[14]。一般而言，氧化應(yīng)激的信號匯集到下游，激活效應(yīng)器caspase-3，活化的caspase-3剪切Akt，引起PI3K/Akt抑制，進而促進FoxOs蛋白轉(zhuǎn)位入核，激活其轉(zhuǎn)錄活性，促進前調(diào)亡基因(如Bim和Fas)和細胞生長停滯與DNA損傷修復(fù)基因(Gadd45a)的表達，誘導(dǎo)細胞周期阻滯和細胞調(diào)亡，從而清除受損或異常的細胞。RA進程中的氧化應(yīng)激反應(yīng)通常伴隨著FoxO3a蛋白含量的變化，且FoxO3a的活性被抑制，則谷胱甘肽過氧化物酶表達降低，使ROS的清除減少，機體的抗氧化能力減弱[15]。

Fig 5 “THSWD-prescription composition-prototype components- targets- pathways” network

Fig 6 Molecular docking diagram

Ras是單聚體鳥苷三磷酸結(jié)合蛋白，Ras能廣泛激活MAPK等通路對細胞凋亡起負向調(diào)節(jié)作用，一些藥物可能就是通過Ras信號通路介導(dǎo)的細胞內(nèi)反應(yīng)發(fā)揮治療RA作用。另有研究表明[16],Ras/Raf/MEK/ERK信號通路不僅能夠直接通過上調(diào)自噬相關(guān)蛋白表達誘導(dǎo)自噬，而且還能通過間接激活PI3K/Akt/mTOR信號通路促進自噬的發(fā)生。VEGF即血管內(nèi)皮生長因子，VEGF在RA患者滑液和血清中大量表達，在炎癥發(fā)生時，VEGF的分泌可增高3～20倍，直接參與了滑膜血管新生，李夢等[17]發(fā)現(xiàn)鐵筷子醇提物可通過下調(diào)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)VEGF的表達發(fā)揮治療作用。

分子對接結(jié)果，靶點蛋白與活性成分之間的結(jié)合活性度越高，結(jié)合能越小，表示其對接性越好，一般≤-5.0 kJ·mol-1則表示具有較好的結(jié)合性[18]，從結(jié)果可以看出，桃紅四物湯的主要活性成分與靶點蛋白結(jié)合能均<-5.0 kJ·mol-1，推測這些活性成分在治療RA中發(fā)揮重要作用。

綜上，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究結(jié)果顯示桃紅四物湯通過作用于多個靶點、多條通路共同實現(xiàn)對RA的治療作用。這些靶點和通路主要涉及細胞凋亡、細胞生長因子等，提示桃紅四物湯治療RA的作用機制與干預(yù)細胞凋亡、促進血管新生相關(guān)，為后期桃紅四物湯治療RA的深入研究提供基礎(chǔ)。