胡 偉，陶姣陽，莫澤君，林耀煌，梁 嬌，李嘉凱

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，浙江 杭州 310009)

無論是在全球或者是在我國(guó)，肺癌都已成為癌癥發(fā)病率和死亡率首位，據(jù)19年國(guó)家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)，15年我國(guó)新發(fā)肺癌病例約78.7萬例，死亡病例約63.1萬例[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌總病例數(shù)的80%～85%，而肺腺癌(LUAD)為其主要病理類型，約占NSCLC的60%。LUAD發(fā)病隱匿不易察覺，早期就診患者較少，對(duì)于晚期或轉(zhuǎn)移患者主要治療手段為化療和放療，而放化療具有嚴(yán)重毒副作用，并會(huì)大大降低患者的生活質(zhì)量。因此，LUAD患者迫切需要臨床療效穩(wěn)定和毒副作用小的治療方案。

威麥寧膠囊是從金蕎麥的干燥根莖中，使用現(xiàn)代技術(shù)提取的活性成分，作為我國(guó)首個(gè)治療肺癌單方中成藥[2]，具有清熱解毒、活血化瘀、驅(qū)邪扶正等作用，臨床主要配合放、化療治療腫瘤有增效減毒作用，也用于不適宜放、化療肺癌患者的治療。雖然，相關(guān)的臨床觀察研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，威麥寧膠囊配合放化療治療NSCLC患者能帶來明顯的臨床獲益，但是關(guān)于其發(fā)揮抗腫瘤作用的內(nèi)在藥理學(xué)機(jī)制卻鮮有報(bào)道。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種集合系統(tǒng)生物學(xué)、組學(xué)和計(jì)算生物學(xué)，并基于成分、疾病、靶點(diǎn)之間相互作用網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)研究方法，可以系統(tǒng)的揭示藥物治療疾病的作用機(jī)制[5]。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相較于傳統(tǒng)的試驗(yàn)方法，能夠以科學(xué)的分析方法全面的闡述中藥潛在的作用機(jī)制[6]。分子對(duì)接技術(shù)是根據(jù)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的原理，利用計(jì)算機(jī)高精度對(duì)接模擬，并將蛋白和配體的結(jié)合位點(diǎn)和潛力進(jìn)行評(píng)估，是發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)藥物靶點(diǎn)快捷有效的新途徑[7]。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，分析研究威麥寧膠囊有效成分治療LUAD的可能的作用靶點(diǎn)，并通過分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行評(píng)估確認(rèn)，提高結(jié)果的可靠性。

1 材料與方法

1.1 威麥寧膠囊的有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)的篩選威麥寧膠囊為金蕎麥干燥根莖的提取物，通過檢索TCMSP(https:// tcmspw.com/ tcmsp.php)、TCMID(http://119.3.41.228:8000/ tcmid/)、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php)和ETCM(http://www.tcmip.cn/ ETCM /index.php)數(shù)據(jù)平臺(tái)收集金蕎麥根莖(Rhizoma Fagopyri Cymosi)的化學(xué)成分，根據(jù)ADME參數(shù)篩選活性成分，設(shè)定同時(shí)滿足口服生物利用度OB≥30%和類藥性DL≥0.18的成分作為活性成分[7]，同時(shí)利用TCMSP和DrugBank(https://www.drugbank.ca/)預(yù)測(cè)活性成分靶點(diǎn)。并且根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)，補(bǔ)充其活性化合物及其靶點(diǎn)。篩選所得靶點(diǎn)，需在Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www. uniprot.org)將活性成分作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范。

1.2 肺腺癌的差異表達(dá)基因的獲取從GEO數(shù)據(jù)庫搜索組織來源為人，同時(shí)含有肺腺癌和正常肺組織樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，篩選出GSE116959和GSE43458兩個(gè)探針芯片數(shù)據(jù)集。GSE 116959芯片包含57個(gè)肺腺癌組織和11個(gè)正常肺組織樣本基因表達(dá)譜，GSE43458芯片包含80個(gè)肺腺癌組織和30個(gè)正常肺組織樣本的基因表達(dá)譜。本研究利用R語言的limma軟件包對(duì)芯片進(jìn)行基因差異分析，ggplot2軟件包繪制火山圖，根據(jù)相關(guān)參數(shù)adj.P<0.05和差異倍數(shù)∣logFC∣>1作為篩選條件。

1.3 交集靶點(diǎn)及其相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為明晰藥物作用靶點(diǎn)與肺腺癌差異表達(dá)靶點(diǎn)之間的關(guān)系，本研究將所得靶點(diǎn)信息輸入在線Venn分析工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，并繪制Venn圖，獲得藥物與疾病的交集靶點(diǎn)。然后，將交集靶點(diǎn)輸入蛋白交互作用網(wǎng)站String(https://string-db.org)，生物種類選擇“Homo sapiens”，最小相互作用閾值設(shè)置“medium confidence”(>0.4)，其他參數(shù)選擇默認(rèn)值，即可得到PPI網(wǎng)絡(luò)。使用CytoScape 3.7.2將所得PPI結(jié)果進(jìn)一步美化，得到交集蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 GO和KEGG通路富集分析Metascape平臺(tái)(http://metascape.org/gp/index.html)擁有全面的注釋功能并且每月更新基因注釋的數(shù)據(jù)資料。將威麥寧治療肺腺癌的作用靶點(diǎn)輸入Metascape平臺(tái)，設(shè)置P<0.01，最小基因數(shù)=3，富集因子>1.5。將其主要的GO與KEGG通路進(jìn)行富集分析，然后利用R語言ggplot2軟件包將結(jié)果繪制氣泡圖。

1.5 核心靶點(diǎn)的提取和分析使用CytoScape 3.7.2中的CytoHubb插件，利用MCC算法，提取得到排名前10個(gè)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，將其作為核心基因并進(jìn)行KEGG通路富集分析。

1.6 分子對(duì)接將威麥寧的主要有效成分和10個(gè)核心靶點(diǎn)，用Autodock軟件進(jìn)行分子對(duì)接。使用TCMSP數(shù)據(jù)庫，下載藥物小分子化合物的MOL2格式文件，并通過pymol轉(zhuǎn)換為PDB格式；然后通過PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)下載靶蛋白與其他配體結(jié)合的復(fù)合物的PDB格式文件，對(duì)接區(qū)域即原始配體所在位置。使用Autodock軟件在對(duì)接時(shí)，選擇Genetic Algorithm作為對(duì)接算法，并設(shè)置輸出樣品數(shù)為100，計(jì)算次數(shù)為27 000，其他參數(shù)使用默認(rèn)值。

2 結(jié)果

2.1 威麥寧膠囊的有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)通過檢索幾個(gè)數(shù)據(jù)庫，根據(jù)篩選條件OB≥30%和DL≥0.18，共獲得15個(gè)有效成分；然后通過檢索相關(guān)文獻(xiàn)[2]，發(fā)現(xiàn)原花青素b2(Procyanidin b2)為威麥寧膠囊的重要活性成分，于是將其歸入有效活性成分見Tab 1所示。通過TCMSP和DrugBank對(duì)獲得的16個(gè)活性成分進(jìn)行相關(guān)靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)，然后使用Uniprot(https://www. uniprot. org/)數(shù)據(jù)庫將所得靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行規(guī)范化處理，結(jié)果總共獲得353個(gè)有效靶點(diǎn)；使用Cytoscape 3.7.2軟件對(duì)所得的活性成分和靶點(diǎn)進(jìn)行可視化網(wǎng)絡(luò)展示，如Fig 1所示。網(wǎng)絡(luò)圖中紅色六邊形代表有效成分，紫色圓形代表degree>3的靶點(diǎn)，淡藍(lán)色菱形代表degree≤3的靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)越大代表degree值越大。結(jié)果顯示木犀草素(luteolin)和槲皮素(quercetin)的degree值分別為154和57，很可能是威麥寧膠囊發(fā)揮藥理作用的主要活性成分。

Tab 1 Main active ingredients of Weimaining

2.2 肺腺癌的差異表達(dá)基因使用R語言limma軟件包對(duì)GSE116159和GSE43458數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因差異分析，分別獲得肺腺癌(LUAD)相對(duì)正常肺組織存在1 862和746個(gè)差異基因，GSE116159中表達(dá)上調(diào)的有674個(gè)，下調(diào)的1 188個(gè)，GSE43458中表達(dá)上調(diào)291個(gè)，下調(diào)455個(gè)。將兩個(gè)數(shù)據(jù)集獲得的差異基因取并集，總共得到2 217個(gè)可能與LUAD有關(guān)的差異基因。將結(jié)果用R語言繪制火山圖展示，見Fig 2、3。

Fig 1 Component-target network of Weimaining

Fig 2 Volcano map of GSE116159 differential genes

Fig 3 Volcano map of GSE116159 differential genes

Fig 4 Venn diagram of targets of Weimaining and LUAD

2.3 交集靶點(diǎn)及其相互作用網(wǎng)絡(luò)將威麥寧膠囊主要有效成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行去重后，共獲得204個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，同時(shí)通過對(duì)兩個(gè)LUAD數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)挖掘，共獲得2 217個(gè)和LUAD相關(guān)的差異表達(dá)基因。然后將藥物和疾病所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)分別導(dǎo)入在線Venn分析工具，獲得41個(gè)交集靶點(diǎn)，并繪制Venn圖，見Fig 4。最后將獲得的41個(gè)共同作用靶點(diǎn)，利用蛋白交互網(wǎng)站String進(jìn)行蛋白相互作用分析，并將其結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化，結(jié)果見Fig 5。PPI網(wǎng)絡(luò)中共有39個(gè)節(jié)點(diǎn)(去除2個(gè)獨(dú)立節(jié)點(diǎn))，162條邊，節(jié)點(diǎn)大小和節(jié)點(diǎn)顏色根據(jù)degree值排序，degree值越大節(jié)點(diǎn)越大顏色越亮；邊的粗細(xì)和顏色根據(jù)combined score排序，combined score值越大邊越粗顏色越亮。

Tab 2 MCC Score values of core targets

Fig 5 PPI network at intersectiontargets of Weimaining and LUAD

Fig 6 GO enrichment and KEGG pathway enrichment analysis of intersection targets

Tab 3 KEGG pathway enrichment analysis of core targets

Tab 4 Docking results of main active componentsof Weimaining with core targets

2.4 GO和KEGG通路富集分析將之前獲得威麥寧膠囊治療LUAD的41個(gè)靶點(diǎn)基因放入Metas-cape平臺(tái)，分別進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。GO 富集分析主要包括BP(Biological Processes)、CC(Cellular Components)、MF(Molecular Function)，利用R語言將結(jié)果繪制成氣泡圖，橫坐標(biāo)為Gene ratio，縱坐標(biāo)為富集結(jié)果，富集結(jié)果的-log10(Qvalue)值以顏色表示，氣泡大小表示基因Count值，見Fig 6。

細(xì)胞組分(CC)的富集結(jié)果，顯示威麥寧膠囊和LUAD的交集基因主要分布在RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、細(xì)胞膜筏、濃縮的染色體、ficolin-1-rich顆粒內(nèi)腔和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔等細(xì)胞部位。

分子功能(MF)富集的結(jié)果，顯示交集基因主要是對(duì)G蛋白偶聯(lián)胺受體、功能類固醇激素受體、氧化還原酶和絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶的活性影響，以及通過與蛋白激酶、整合素、轉(zhuǎn)錄因子和生長(zhǎng)因子的結(jié)合，從而發(fā)揮作用。

生物過程(BP)的富集結(jié)果，顯示交集基因主要富集在對(duì)細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控、多細(xì)胞生物過程、對(duì)金屬離子反應(yīng)、對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)激素刺激的反應(yīng)和對(duì)含嘌呤化合物的反應(yīng)等生物過程。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，41個(gè)交集基因顯著富集在12條通路上(Qvalue<0.01)。包括液體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、cAMP信號(hào)通路、金屬鉑耐藥等通路，也說明威麥寧膠囊可以通過多靶點(diǎn)多通路協(xié)調(diào)作用，從而發(fā)揮治療LUAD的功效。

2.5 核心靶點(diǎn)的提取和分析使用CytoHubba插件，選擇MCC方式進(jìn)行核心靶點(diǎn)的提取，根據(jù)MCC score提取前10的靶點(diǎn)，如Tab 2所示。將Top10的靶點(diǎn)利用Metascape分析平臺(tái)進(jìn)行KEGG通路富集分析，所得結(jié)果與交集靶點(diǎn)結(jié)果基本一致，主要富集在IL-17信號(hào)通路，癌癥通路和癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)這3條通路，見Tab 3。

2.6 主要活性成分和核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接威麥寧膠囊中活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖中，顯示木犀草素(luteolin)和槲皮素(quercetin)很可能是其發(fā)揮藥理作用的主要活性成分。通過威麥寧膠囊和LUAD所獲得的交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，然后使用CytoHubba獲得10個(gè)核心靶點(diǎn)。從TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取木犀草素和槲皮素的mol2結(jié)構(gòu)式，PDB數(shù)據(jù)庫下載核心蛋白的pdb結(jié)構(gòu)式，使用Autodock軟件進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合能(Binding energy)越小說明配體和受體結(jié)合越穩(wěn)定，越可能發(fā)生相互作用。然后使用Pymol軟件對(duì)所得對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化展示。結(jié)果顯示木犀草素和槲皮素與核心靶點(diǎn)結(jié)合性較好，結(jié)合能均小于0 KJ·mol-1并顯示著相同的趨勢(shì)，如Tab 4所示，排在前五位的靶點(diǎn)蛋白為MMP-9、MMP-1、CAT、PLAU和PPARG。

3 討論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，探討了威麥寧膠囊治療LUAD的潛在作用機(jī)制。通過數(shù)據(jù)庫、基因芯片數(shù)據(jù)挖掘以及分子對(duì)接的結(jié)果找出了威麥寧的主要活性成分木犀草素和槲皮素，以及可能通過與MMP-9、MMP-1、CAT、PLAU和PPARG發(fā)生相互作用，作為威麥寧膠囊治療LUAD的主要靶點(diǎn)。

MMP-9和MMP-1都屬于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，一種鋅依賴性內(nèi)肽酶，MMPs的基因多態(tài)性與肺癌的易感性存在相關(guān)性，比如MMP-1-16071G/2G基因型在亞洲人中發(fā)現(xiàn)肺癌風(fēng)險(xiǎn)增加，而MMP-9-1562C/T基因型很可能是肺癌的保護(hù)因素[8]；并且已發(fā)現(xiàn)在MMP-9和MMP-1多種腫瘤組織中均為高表達(dá)，而降低MMP-9和MMP-1的表達(dá)不僅可以抑制NSCLC細(xì)胞的活力和遷移能力，還能提高耐藥細(xì)胞對(duì)EGFR抑制劑的敏感性[9]。CAT為過氧化氫酶，可以保護(hù)細(xì)胞免受過氧化氫的毒性作用，促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞、肥大細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，CAT可以降低組織中過多ROS引起的損傷，與癌旁組織相比，在NSCLC細(xì)胞中，CAT的表達(dá)量和活性都會(huì)降，同時(shí)CAT可以產(chǎn)生氧來克服腫瘤細(xì)胞的缺氧，進(jìn)而增加效應(yīng)T細(xì)胞的浸潤(rùn)，同時(shí)耗盡腫瘤中的免疫抑制細(xì)胞，增強(qiáng)PD1單抗的療效[10]。PLAU尿激酶型纖溶酶原激活劑，除了可以激活纖溶酶原，還與肺癌細(xì)胞的增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，如KLF17通過Src/p38/MAPK信號(hào)通路抑制PLAU可以抑制LUAD的侵襲[11]。PPARG是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于過氧化物酶體增殖活化受體(PPARs)家族，PPARs受體的激動(dòng)劑能有效的抑制LUAD細(xì)胞的增殖，發(fā)現(xiàn)PPARG蛋白過表達(dá)或者激動(dòng)劑羅格列酮的誘導(dǎo)，可以增強(qiáng)輻射誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞的凋亡，并且這種放射增敏效應(yīng)是由Bax介導(dǎo)[12]。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，威麥寧膠囊治療LUAD的潛在作用機(jī)制除了直接作用于癌癥通路，癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)以及金屬鉑耐藥，還包括流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、AGE-RAGE信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路等通路。流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路對(duì)血管的再生有著重要的調(diào)節(jié)作用，流體剪切應(yīng)力可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞中相關(guān)基因的表達(dá)，影響著內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)、分化、遷移和增殖[13]。AGE-RAGE信號(hào)通路主要是指晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)與其受體RAGE結(jié)合后可啟動(dòng)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)，合成和釋放多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)ROS生成增多，誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。目前，在人類肺癌組織中均發(fā)現(xiàn)RAGE 蛋白表達(dá)，并參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、自噬、侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及耐藥[14]。p53信號(hào)通路廣泛作用于多種腫瘤組織，可以調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)，加速DNA的損傷修復(fù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用。研究表明，促進(jìn)p53蛋白的合成，抑制p53的泛素化和降解，可以促進(jìn)LUAD細(xì)胞凋亡，抑制LUAD的進(jìn)展[15]。cAMP信號(hào)通路，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP的水平而引起反應(yīng)的信號(hào)通路，在基因調(diào)控，以及細(xì)胞遷移、增殖、凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用[16]。

目前已有相關(guān)的臨床研究證明，威麥寧膠囊聯(lián)合放療或化療在治療LUAD患者臨床觀察研究中，改善患者免疫狀態(tài)，提高療效，減輕放化療毒性，延長(zhǎng)患者生存期[3-4]。 但是關(guān)于其作用的藥理學(xué)機(jī)制，影響的通路及具體蛋白卻很少有人研究，本文研究的重要性就得到很好的體現(xiàn)。

綜上所述，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，闡明了威麥寧膠囊治療LUAD主要有效成分、作用靶點(diǎn)，以及相關(guān)的通路，發(fā)現(xiàn)其可以通過直接細(xì)胞抑制作用和增加放化療的敏感性發(fā)揮療效。但是想要揭示其分子學(xué)機(jī)制，仍需要通過進(jìn)一步的體內(nèi)外研究對(duì)本文的研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，這也將是作者接下來要進(jìn)行的工作。