◎ 黃高柳，易澤夫，楊博文，吳 景，羅 揚(yáng)

（長(zhǎng)沙市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410003）

食品安全既是重要的民生問題，也是推進(jìn)生態(tài)文明建設(shè)、實(shí)現(xiàn)美麗中國(guó)夢(mèng)的重要抓手，而農(nóng)藥殘留超標(biāo)則是影響食品安全的重要因素[1]?；诖耍鼛啄陣?guó)家不僅加大了對(duì)農(nóng)藥使用的監(jiān)管力度，并且對(duì)果蔬中農(nóng)藥殘留的限量要求也日益嚴(yán)格。但隨著各種害蟲的耐藥性不斷提升，各式農(nóng)藥也在不斷更新?lián)Q代，這樣的變化使得果蔬中的農(nóng)藥殘留的化學(xué)成分更加復(fù)雜，用傳統(tǒng)的氣相、液相方法檢測(cè)工作量十分艱巨，因此以QuEChERS前處理結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜的多農(nóng)殘檢測(cè)方法應(yīng)運(yùn)而生[2]。

氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（GC-MS/MS）檢測(cè)具有靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，正好滿足農(nóng)藥多殘留分析的需求[3]。但由于基質(zhì)種類多，有些基質(zhì)成分復(fù)雜，在進(jìn)行上機(jī)測(cè)定時(shí)，往往會(huì)因?yàn)檫M(jìn)樣次數(shù)不斷增多而造成進(jìn)樣口和離子源污染，導(dǎo)致某些農(nóng)藥的檢測(cè)靈敏度逐漸下降，從而影響檢測(cè)結(jié)果，雖然可以通過更換襯管、割柱頭以及清洗離子源等操作對(duì)儀器進(jìn)行維護(hù)，但這無(wú)疑增加了檢測(cè)的成本與時(shí)間。因此，對(duì)樣品的凈化成為提高方法耐用性的關(guān)鍵。而石墨化碳黑（GCB）正是一種優(yōu)良的氣相色譜吸附劑，具有均勻石墨化表面的規(guī)則多面體結(jié)構(gòu)，對(duì)平面分子有極強(qiáng)的親和力，適用于凈化植物中的色素[4]，在QuEChERS前處理方法中應(yīng)用廣泛。為了探究樣品凈化中GCB的含量與方法耐用性的關(guān)系，本論文將以甘薯葉，辣椒，甘藍(lán)以及葡萄四種果蔬為研究對(duì)象，探究在0.1 mg·kg-1的加標(biāo)水平下，GCB的用量對(duì)方法回收率、精密度以及耐用性的影響，從而確定QuEChERS前處理方法中GCB的最佳使用量，以期建立一種采用GC-MS/MS檢測(cè)農(nóng)殘，且具備大批量處理分析樣品能力的方法，讓檢測(cè)效率大幅提升。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

41種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 mg·L-1），均由農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所提供。

乙腈（色譜純，美國(guó)Supelco公司）、丙酮（色譜純，美國(guó)TEDIA天地試劑公司）、正己烷（色譜純，美國(guó)TEDIA天地試劑公司）、氯化鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、石墨化碳黑（GCB，安捷倫科技公司）、2 mL凈化管（內(nèi)含50 mg PSA、50 mg C18、150 mg MgSO4，迪馬科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-7000C三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（安捷倫科技公司）、數(shù)字式脈沖渦旋儀（WIGGENS技術(shù)公司）、高速離心機(jī)（賽默飛科技公司）、T200電子天平（常熟雙杰測(cè)試儀器廠）、N-EVAP氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確移取41種100 mg·L-1農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用丙酮稀釋成2 mg·L-1混標(biāo)中間液備用。再取41種2 mg·L-1混標(biāo)中間液適量，逐級(jí)用空白基質(zhì)液稀釋成質(zhì)量濃度為0.005 mg·L-1、0.01 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品前處理

稱取10 g空白基質(zhì)于50 mL塑料離心管中，加入20 mL乙腈和陶瓷均質(zhì)子，蓋上離心管蓋劇烈振蕩1 min，加入5 g氯化鈉，放入渦旋振蕩器中渦旋振蕩10 min后4 000 r·min-1離心4 min。將QuEChERS凈化粉末（內(nèi)含不同量GCB）灌入2.5 mL注射器，吸取超過2 mL上清液，劇烈振蕩，讓凈化粉末與上清液充分混合，過0.22 μm微孔濾膜，用5 mL玻璃刻度管準(zhǔn)確收集2 mL濾液，50 ℃水浴氮吹至凈干，用正己烷+丙酮（1∶1）定容至1 mL，用于測(cè)定。

1.5 GC-MS/MS分析條件

1.5.1 氣相色譜條件

色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；色譜柱流量1.2 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度280 ℃；載氣為高純He（純度大于99.999%）；傳輸線溫度280 ℃；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL；程序升溫：初始柱溫70 ℃保持1 min，50 ℃·min-1升至150 ℃保持0 min，6 ℃·min-1升至280 ℃保持1 min，10 ℃·min-1升至300 ℃保持3 min。

1.5.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊源：70 eV；四極桿MS1和MS2溫度180 ℃；離子源溫度280 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM模式。41種農(nóng)藥對(duì)應(yīng)序號(hào)以及定量定性離子對(duì)和碰撞能量詳見表1。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將4種果蔬的空白樣品進(jìn)行提取、凈化、濃縮和復(fù)溶后，所得到的基質(zhì)空白液作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋液，按1.3節(jié)的操作準(zhǔn)確配制成質(zhì)量濃度為0.005 mg·L-1、0.01 mg·L-1、0.05 mg·L-1、0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以1.4和1.5節(jié)的條件進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸計(jì)算[5]。

表1 41種農(nóng)殘MRM離子對(duì)信息及碰撞能量表

1.7 精密度和回收率測(cè)定

本次測(cè)試采用空白基質(zhì)配標(biāo)-外標(biāo)法定量，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品溶液在同一儀器條件下檢測(cè)，以降低基質(zhì)效應(yīng)[6]。基質(zhì)選擇為甘薯葉，辣椒，甘藍(lán)以及葡萄，添加濃度水平為0.1 mg·kg-1，按照1.4實(shí)驗(yàn)部分進(jìn)行前處理，各個(gè)基質(zhì)的上清液分別用填有0 mg、15 mg、30 mg和60 mg石墨化碳黑的凈化粉末進(jìn)行凈化（空白樣品和添加樣品進(jìn)行同樣的前處理，得到相同凈化水平的空白基質(zhì)液用來配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液），每種凈化方式都重復(fù)處理6次，以重復(fù)樣品間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）考察方法的精密度，平均加標(biāo)回收率考察方法的準(zhǔn)確度[7]。

1.8 方法耐用性測(cè)定

對(duì)滿足回收率需求的GCB使用量處理的樣品進(jìn)行方法耐用性測(cè)試，在同一儀器條件下，分別檢測(cè)進(jìn)樣起始和進(jìn)樣200針后插入的質(zhì)控樣品各個(gè)農(nóng)藥的響應(yīng)值，比對(duì)TIC圖前后變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

對(duì)程序升溫進(jìn)行了較大調(diào)整，沒有采用GB 23200.113—2018中的升溫程序，而是經(jīng)過對(duì)分析物出峰時(shí)間的不斷調(diào)整，使分析時(shí)間縮短近10 min，以6 ℃·min-1升至280 ℃，這種較緩的升溫梯度能夠讓后面出峰的菊酯類農(nóng)藥有很好的分離度，保證其在有相互影響的離子對(duì)的情況下，可以準(zhǔn)確辨識(shí)。以10 ℃·min-1升至300 ℃保持3 min，能起到高溫烘烤的作用，不僅可以有效老化色譜柱，也能讓高沸點(diǎn)的化合物迅速流出色譜柱[8]。

本方法將41種農(nóng)藥按保留時(shí)間先后分為24個(gè)時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段選擇合適的離子對(duì)數(shù)量，以提高檢測(cè)的靈敏度，保證所有農(nóng)藥都有良好的峰形和響應(yīng)。每種農(nóng)藥都選擇了3個(gè)離子對(duì)，用來排除相似結(jié)構(gòu)農(nóng)藥中相同離子對(duì)的干擾，能夠保證定性的絕對(duì)準(zhǔn)確[9]。

2.2 樣品檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限

所得結(jié)果表明：41種農(nóng)藥在濃度0.005～0.5 mg·L-1范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2在0.994 2～0.999 8，以S/N=10確定方法定量限（LOQ）為1.05～9.12 μg·kg-1，均低于GB 23200.113—2018的方法定量限要求（10 μg·kg-1）[10]，具備實(shí)驗(yàn)可行性。為統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，符合QuEChERS快篩方法要求，將各農(nóng)藥的LOQ統(tǒng)一定為10.00 μg·kg-1，詳細(xì)結(jié)果見表2。

表2 41種農(nóng)藥在5～500 μg·L-1濃度范圍線性關(guān)系和定量限表

續(xù)表2

2.2.2 精密度和回收率測(cè)試結(jié)果

結(jié)果顯示，4種基質(zhì)的回收率在GCB含量為0 mg和15 mg時(shí)表現(xiàn)最優(yōu)，除百菌清和五氯硝基苯外，其他農(nóng)藥的平均回收率基本在65%～110%，滿足GB/T 27404—2008對(duì)回收率的相關(guān)要求，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在12.0%以內(nèi)（n=6），說明本法的重復(fù)性良好。從總體上看，凈化粉末中石墨化碳黑含量的多少對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥影響較小，而菊酯類農(nóng)藥的回收率會(huì)隨著石墨化碳黑含量的增多而下降。甲胺磷，乙酰甲胺磷和氧樂果的回收率較低，分析可能是在氮吹的過程中損失較大，或者這3種農(nóng)藥的提取率較低。百菌清和五氯硝基苯的回收率偏低，是由于石墨化碳黑對(duì)該農(nóng)藥的吸附性較強(qiáng)[11]。4種果蔬在不同GCB含量?jī)艋绞较录訕?biāo)回收率詳細(xì)結(jié)果見圖1～圖4。

圖1 辣椒0.10 mg·kg-1加標(biāo)回收率圖

圖2 甘薯葉0.10 mg·kg-1加標(biāo)回收率圖

圖3 甘藍(lán)0.10 mg·kg-1加標(biāo)回收率圖

2.2.3 方法耐用性測(cè)試結(jié)果

對(duì)GCB用量為0 mg和15 mg處理的樣品進(jìn)行方法耐用性測(cè)試，結(jié)果如圖5和圖6所示，可明顯看出，在同一坐標(biāo)軸下，進(jìn)樣200針時(shí)，使用0 mg GCB凈化的樣品在儀器進(jìn)樣分析后，插入的質(zhì)控樣品大部分農(nóng)藥響應(yīng)值下降50%～80%，且有少數(shù)農(nóng)藥響應(yīng)極低，甚至沒有出峰或者峰形不平滑，少數(shù)藥物基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)明顯，說明儀器受到的污染比較嚴(yán)重[12]。而使用15 mg GCB用量的凈化方式，質(zhì)控樣品各農(nóng)藥的響應(yīng)值變化基本在30%以內(nèi)，是可接受的范圍。因此，選擇GCB含量為15 mg的凈化管進(jìn)行樣品批處理凈化，可在保證準(zhǔn)確度的同時(shí)極大地提升方法耐用性。

圖6 使用15 mg GCB凈化的樣品在儀器進(jìn)樣分析后質(zhì)控樣TIC圖前后變化圖

3 結(jié)論

本文采用QuEChERS前處理結(jié)合GC-MS/MS檢測(cè)41種農(nóng)殘，對(duì)氣相以及質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過方法加標(biāo)回收率、RSD、方法耐用性等測(cè)試，確定了GCB的最優(yōu)使用量為15 mg，也證實(shí)了本法的可行性。該研究建立的方法具有前處理快速、準(zhǔn)確度高、對(duì)儀器污染小及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，為多農(nóng)殘檢測(cè)提供了一種有力的技術(shù)手段，在保障食品安全方面具有重要意義[13]，但其使用也有一定的局限性，多農(nóng)殘方法中各個(gè)農(nóng)藥的化學(xué)性質(zhì)有很大差異，如本法的百菌清回收率偏低。因此，在檢測(cè)這類平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥時(shí)，對(duì)于GCB的使用要仔細(xì)斟酌，這也需要在后續(xù)工作中進(jìn)一步優(yōu)化[14]。