蒙藥麻花頭中總黃酮的超聲提取及含量測(cè)定

張可青，成 瑞，王建華*，于姝燕，王 敏

0 引言

麻花頭是菊科麻花頭屬植物麻花頭(SerratulaL.)的干燥全草，為多年生草本植物，主要分布在我國(guó)吉林、河北、黑龍江、內(nèi)蒙古、山東、山西、陜西、遼寧和甘肅等省區(qū)的草原地帶以及綠地闊葉林地區(qū)[1-2]。麻花頭是北方常見(jiàn)的牧草品種，產(chǎn)量豐富，在早春和冬季時(shí)各種家畜均可采食。麻花頭還可作為藥用植物，具有清熱解毒之功效，用于風(fēng)熱頭痛、麻疹、肺熱咳喘、咽喉腫痛、胃火牙痛等病癥[3-5]。研究顯示，麻花頭含有蛻皮甾酮[6-9]、黃酮[10]、揮發(fā)油[11]、神經(jīng)酰胺等成分[12]。其中黃酮類化合物具有抗病毒、抗炎、抗菌、抗腫瘤、保護(hù)心血管、清除自由基的作用[13-15]，已被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健品以及化妝品等領(lǐng)域[16-17]。對(duì)于麻花頭化學(xué)成分的研究工作大部分集中在蛻皮甾酮上，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，麻花頭中黃酮類物質(zhì)的含量也較為豐富，但目前尚無(wú)麻花頭中總黃酮提取工藝和含量測(cè)定的研究報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行了考察，并測(cè)定了麻花頭全草中總黃酮的含量，為麻花頭臨床應(yīng)用和深加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器 BSA224S型分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；TU-1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析儀器有限公司)；KQ-250DB型超聲反應(yīng)器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):100080-201811)；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇等試劑均為市售分析純；試驗(yàn)用水為自制去離子水。麻花頭采于內(nèi)蒙古呼和浩特市小井溝草原，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室渠弼副教授鑒定為菊科植物麻花頭的干燥全草。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備 將蘆丁對(duì)照品減壓干燥至恒重，精密稱量40 mg，置于小燒杯中，加少量無(wú)水乙醇溶解，后轉(zhuǎn)移至50 ml棕色容量瓶中，無(wú)水乙醇定容至刻度，即得0.8 mg/ml 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密量取蘆丁對(duì)照品溶液3.0 ml置于25 ml棕色容量瓶中，加入5% NaNO2溶液1.0 ml，靜置5 min，再加入10% Al(NO3)3溶液1.0 ml，靜置6 min，最后加入4% NaOH 溶液10 ml，搖勻后加入70%乙醇定容至刻度，暗處?kù)o置20 min。以70%乙醇為空白對(duì)照，在200～800 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，蘆丁對(duì)照品在510 nm處有最大吸收峰，故確定測(cè)定波長(zhǎng)為510 nm。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取蘆丁對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml于25 ml棕色容量瓶中，加入5% NaNO2溶液1.0 ml，靜置5 min，再加入10% Al(NO3)3溶液1.0 ml，靜置6 min，最后加入4% NaOH 溶液10 ml，搖勻后加入70%乙醇定容至刻度，暗處?kù)o置20 min。于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值(A)，同時(shí)做空白對(duì)照試驗(yàn)，以蘆丁質(zhì)量濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定回歸方程。

2.4 供試品溶液的制備 取麻花頭全草粉碎，過(guò)60目篩。按照下述提取方法、提取溶劑和提取時(shí)間，分別對(duì)5 g麻花頭粉末進(jìn)行提取，提取結(jié)束后冷卻，用微孔濾膜過(guò)濾，濾液倒入25 ml容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，即為不同提取方法所得供試品溶液。

2.4.1 提取方法考察 精密稱取3份麻花頭全草粉末，各5 g，分別進(jìn)行回流提取、超聲提取、索氏提取，提取溶劑均為25 ml無(wú)水乙醇，提取時(shí)間2 h。

2.4.2 提取溶劑考察 精密稱取4份麻花頭全草粉末，各5 g，置于4個(gè)25 ml的錐形瓶中，分別加入90%、80%、70%、60%乙醇各25 ml，超聲提取2 h。

2.4.3 提取時(shí)間考察 精密稱取3份麻花頭全草粉，各5 g，置于3個(gè)25 ml的錐形瓶中，均加入25 ml無(wú)水乙醇。3個(gè)容量瓶分別超聲提取1 h、2 h、3 h。

2.5 麻花頭粉末中總黃酮含量的測(cè)定 精密量取麻花頭全草粉末5 g，按照上述“2.4”項(xiàng)所優(yōu)化的提取條件進(jìn)行提取，冷卻，用微孔濾膜過(guò)濾，濾液置25 ml容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度。精密吸取2.5 ml轉(zhuǎn)移至25 ml棕色容量瓶中，加入5% NaNO2溶液1.0 ml，靜置5 min，再加入10% Al(NO3)3溶液1.0 ml，靜置6 min，最后加入4% NaOH 溶液10 ml，搖勻后加入70%乙醇定容至刻度，暗處?kù)o置20 min，于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得出供試品溶液中總黃酮的濃度，最后根據(jù)供試品溶液濃度即可得到麻花頭粉末中總黃酮的含量。重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算平均值。

3 單因素考察

3.1 提取方法的選擇 為考察提取方法對(duì)提取液中總黃酮含量的影響，本文采用回流提取、超聲提取和索氏提取3種方法對(duì)麻花頭粉末進(jìn)行了提取，在提取后按照“2.5”所述方法進(jìn)行顯色，并測(cè)定吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，回流提取液的吸光度值最低，其次是超聲提取，而索氏提取液吸光度值略高于超聲提取，表明索氏提取法的提取效果最好。

圖1 不同提取方法所得提取液的吸光度值

3.2 提取溶劑的選擇 為考察提取溶劑對(duì)提取效果的影響，本文使用不同濃度乙醇水溶液對(duì)麻花頭粉末進(jìn)行了提取，在提取后按照“2.5”所述方法測(cè)定了不同提取液的吸光度值，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，采用90%、80%和和70%的乙醇水溶液提取所得提取液的吸光度值均優(yōu)于60%的乙醇水溶液提取所得提取液，其中80%乙醇水溶液的提取效率最高。

圖2 不同濃度乙醇水溶液提取所得提取液的吸光度值

3.3 提取時(shí)間的選擇 為考察提取溶劑對(duì)提取效果的影響，本文將提取時(shí)間設(shè)定為1 h、2 h、3 h，分別進(jìn)行了提取。3種提取時(shí)長(zhǎng)所得提取液按照“2.5”所述方法顯色并測(cè)定了吸光度值，見(jiàn)圖3。由圖3可知，提取2 h所得提取液吸光度值略高于1 h和3 h提取液。

圖3 不同提取時(shí)間提取所得提取液的吸光度值

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 對(duì)照品蘆丁的回歸方程為Y=0.008 7C+0.199 2，R2=0.999 2。結(jié)果表明，在8.0～48.0 μg/ml范圍內(nèi)濃度與吸光度線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖4。

圖4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

4.2 方法學(xué)考察

4.2.1 精密度試驗(yàn) 精密量取蘆丁對(duì)照品溶液1.0 ml，按照“2.2”所述方法進(jìn)行顯色，并測(cè)定溶液吸光度值，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果顯示，其RSD值為0.81%，表明儀器精密度良好。

4.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取供試品溶液1.0 ml，按照“2.5”所述方法進(jìn)行顯色，分別在0、1、2、3、4 h測(cè)定溶液的吸光度值，結(jié)果顯示，其RSD值為0.65%，表明供試品溶液顯色后在4 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取供試品溶液1.0 ml，按照”2.5”所述方法進(jìn)行顯色，并測(cè)定溶液吸光度值，平行測(cè)定6份，結(jié)果顯示，其RSD值為0.49%，表明該測(cè)量方法重復(fù)性良好。

4.2.4 加樣回收試驗(yàn) 精密稱定0.5 g已知含量麻花頭粉末共4份，放于4個(gè)25 ml容量瓶中，分別加入“2.1”項(xiàng)下制備所得蘆丁對(duì)照品1.0 ml(蘆丁含量為0.8 mg)，加入70%乙醇定容至刻度，精密量取2.5 ml，至于25 ml棕色容量瓶中，按“2.5”所述方法進(jìn)行顯色，并測(cè)定吸光度值，計(jì)算加樣回收率(表1)。結(jié)果表明，其平均加樣回收率為98.33%，RSD值為1.01%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確性良好。

表1 加樣回收率計(jì)算結(jié)果

4.3 麻花頭粉末中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果 精密量取麻花頭全草粉末5 g于25 ml錐形瓶中，加入70%乙醇溶液25 ml，超聲提取2 h，提取結(jié)束后冷卻，用微孔濾膜過(guò)濾，濾液倒入25 ml容量瓶中，按照“2.5”所述方法制備溶液、顯色、測(cè)定吸光度值，并計(jì)算麻花頭粉末中總黃酮的含量(表2)。結(jié)果表明，麻花頭粉末中總黃酮的平均含量為0.614 5 mg/g。

表2 麻花頭粉末中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

5 討論

5.1 提取方法的影響 前述單因素考察結(jié)果“3.1”項(xiàng)表明，索氏提取對(duì)于麻花頭粉末中黃酮類化合物的提取效果最好，但索氏提取存在能耗較大、操作繁瑣、不利于大規(guī)模處理等缺點(diǎn)，同時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間高溫提取有可能破壞中草藥中的某些有效成分，因此本文選擇超聲提取法進(jìn)行總黃酮的提取。超聲提取利用超聲空化效應(yīng)，可破碎植物細(xì)胞，從而使植物細(xì)胞中的有效成分溶出[18-19]，雖然提取溫度僅為室溫，但其提取效率較高。與索氏提取法相比，超聲提取法操作簡(jiǎn)便，同時(shí)可對(duì)多份樣品進(jìn)行提取，而且能耗和污染更小，適合進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)提取。

5.2 提取溶劑的影響 對(duì)于黃酮類化合物的提取，文獻(xiàn)報(bào)道多采用不同濃度的乙醇水溶液作為提取劑進(jìn)行提取。乙醇具有沸點(diǎn)適宜、價(jià)格低廉、清潔無(wú)毒等特點(diǎn)，非常適合進(jìn)行中草藥有效成分的提取。然而提取麻花頭中總黃酮的最適宜乙醇濃度尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，較高濃度的乙醇水溶液對(duì)于黃酮類化合物的提取能力較好，且乙醇濃度對(duì)提取結(jié)果影響不大，這可能是由于黃酮類化合物在乙醇中具有較好的溶解度，再加上采用超聲提取的方法，一定量的乙醇即可以很好地將麻花頭粉末中的黃酮類化合物提取出來(lái)。然而，乙醇濃度太低時(shí)，如60%乙醇水溶液提取效果較差?？紤]到成本，本文選擇70%的乙醇水溶液作為麻花頭粉末中總黃酮的提取溶劑。

5.3 提取時(shí)間的影響 除了提取方法和提取溶劑，提取時(shí)間也是影響提取效果的重要因素。由于超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，提取溶劑的溫度會(huì)大幅上升，為避免體系溫度太高破壞某些敏感成分，本文將提取時(shí)間設(shè)定為1～3 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲提取1 h即可將麻花頭粉末中的大部分黃酮類化合物提取出來(lái)，而繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)長(zhǎng)至2 h，所得提取液吸光度值僅出現(xiàn)小幅增大，提取時(shí)間延長(zhǎng)為3 h后，提取液吸光度值較2 h沒(méi)有顯著變化。因此，綜合考慮提取效率和成本，本文采用超聲提取2 h的方法進(jìn)行提取。

本文以蘆丁為對(duì)照品建立了麻花頭全草粉末中總黃酮含量的測(cè)定方法，考察了提取方法、提取溶劑和提取時(shí)間對(duì)于麻花頭中總黃酮提取效果的影響。結(jié)果表明，麻花頭粉末樣品中總黃酮的最佳提取方法為采用70%乙醇水溶液作為提取劑，以超聲提取法提取2 h。通過(guò)測(cè)定此提取條件下所得溶液的吸光度值，計(jì)算得到麻花頭全草粉末的平均總黃酮含量為0.614 5 mg/g。該方法準(zhǔn)確度高，重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，回收率高，操作簡(jiǎn)便，適合于麻花頭粉末及成藥中總黃酮的含量測(cè)定及質(zhì)量控制，對(duì)于進(jìn)一步發(fā)掘麻花頭的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有一定的參考價(jià)值。