吳其國(guó)，胡葉青

（安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)系，安徽 安慶246052）

川楝素（C30H38O11，F(xiàn)W=574）是從川楝（Melia Toosendan Sieb Et Zucc）的果實(shí)和韌皮部位中分離得到的有效成分之一［1］。川楝素是一種四環(huán)三萜類化合物［2-3］，具有驅(qū)蟲、抗肉毒和抗腫瘤作用［4］，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1 所示。由于川楝素在多種癌癥模型中具有新穎的抗癌作用，最近的研究引起了人們?cè)絹碓蕉嗟呐d趣［5］。川楝素是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤新型抗癌藥物的候選者，雌激素受體β 和p53 可以作為癌癥對(duì)川楝素敏感性的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物［6］；川楝素通過抑制AKT/GSK-3β/β-catenin 途徑來抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡［7］。

圖1 川楝素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

近年來有很多關(guān)于川楝素對(duì)肝癌的抗腫瘤研究，但是其機(jī)制尚不完全清楚，如川楝素提取物通過抑制小鼠體內(nèi)肝癌H22 細(xì)胞和體外人肝癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡而具有強(qiáng)大的抗癌作用，細(xì)胞凋亡的機(jī)制涉及線粒體途徑和死亡受體途徑［8］；川楝素可上調(diào)肝癌細(xì)胞死亡受體5（DR5）表達(dá)，提高腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體抗腫瘤活性［9］；川楝素能夠明顯抑制荷瘤小鼠移植瘤的生長(zhǎng),可能與抑制腫瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)［10］。

系統(tǒng)藥理學(xué)是一種新興的方法學(xué)，從藥物和疾病靶標(biāo)、靶蛋白相互作用和通路等多方面整體上說明藥物的作用機(jī)制［11］。本研究從整體上通過對(duì)多靶點(diǎn)多成分的分析，闡述川楝素作用于肝腫瘤的作用機(jī)制。首先應(yīng)用STITCH、SEA 和TargetNet 等3 種工具預(yù)測(cè)川楝素的可靠靶點(diǎn)，然后應(yīng)用DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得肝腫瘤的作用靶點(diǎn)，并利用網(wǎng)絡(luò)的擴(kuò)散性原理分別獲得藥物和疾病的直接和間接作用靶點(diǎn)，把兩者的交集基因作為川楝素抗肝癌腫瘤的潛在靶點(diǎn)，利用加權(quán)基因關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得潛在靶點(diǎn)中的核心靶點(diǎn)，并將潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路分析，用Cytoscape 軟件可視化GO 功能- 靶點(diǎn)- 通路網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)一步從整體上闡明作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 川楝素靶點(diǎn)的篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tcmspw.com/index.php）獲得川楝素的mol2 結(jié)構(gòu)格式，并將其轉(zhuǎn)化成smilie結(jié)構(gòu)格式，分別用SEA 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://sea.bkslab.org/），STITCH 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://stitch.embl.de/）和TargetNet 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://targetnet.scbdd.com/）篩選川楝素的作用靶點(diǎn)。TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)包括化學(xué)物質(zhì)、靶標(biāo)和藥物目標(biāo)網(wǎng)絡(luò)以及相關(guān)的藥物疾病網(wǎng)絡(luò)［12］。SEA 數(shù)據(jù)庫(kù)是利用相似性集成方法，基于蛋白質(zhì)在其配體之間預(yù)設(shè)的化學(xué)相似性來關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)，從而預(yù)測(cè)靶點(diǎn)［13］。STITCH 數(shù)據(jù)庫(kù)旨在整合散布在文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)以及各種生物途徑、藥物- 靶標(biāo)關(guān)系以及結(jié)合親和力的數(shù)據(jù)庫(kù)［14］。TargetNet 數(shù)據(jù)庫(kù)可用于對(duì)任何給定分子，根據(jù)當(dāng)前的化學(xué)基因組學(xué)數(shù)據(jù)構(gòu)建QSAR 模型，可以嚴(yán)格評(píng)估和驗(yàn)證與623 種人類蛋白質(zhì)相關(guān)的結(jié)果［15］。

1.2 肝腫瘤靶點(diǎn)的篩選

用DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)（v6.0，https://www.disgenet.org/），以“Liver Neoplasms”為關(guān)鍵詞，篩選獲得與肝腫瘤相關(guān)的靶點(diǎn)。DisGeNET（v6.0）包含628 685 個(gè)基因- 疾病關(guān)聯(lián)以及210 498 個(gè)變異基因- 疾病關(guān)聯(lián)。其中基因- 疾病關(guān)聯(lián)包括了17 549 個(gè)基因與24 166 種疾病、病癥、特征和臨床或異常人類表型之間；變異基因- 疾病關(guān)聯(lián)包括117 337 變異基因和10 358 種疾病、特征和表型［16］。

1.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

從HINT 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://hint.yulab.org/）下載人類全基因互作網(wǎng)絡(luò)作為背景網(wǎng)絡(luò)，獲取川楝素和肝腫瘤的相互作用的直接和間接靶點(diǎn)，取交集后得到川楝素抗肝癌腫瘤的潛在靶點(diǎn)，再應(yīng)用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得潛在靶點(diǎn)的加權(quán)基因關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)信息。HINT 數(shù)據(jù)庫(kù)整合了來自8 個(gè)相互作用組資源數(shù)據(jù)庫(kù)（BioGRID、MINT、iRefWeb、DIP、IntAct、HPRD、MIPS 和PDB）的高質(zhì)量蛋白相互作用信息［17］。STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)收集和整合大量生物體的已知和預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)［18］。

1.4 GO 和KEGG 分析

用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析，GO 主要包括生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）以及分子功能（MF）3 個(gè)方面。DAVID 為研究人員提供了一套全面的功能注釋工具，以了解大量基因背后的生物學(xué)意義［19］。

1.5 GO-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過富集分析，獲得前10 的GO 功能、KEGG 通路，利用網(wǎng)絡(luò)可視化軟件Cytoscape（3.7.1 版）構(gòu)建了GO- 靶點(diǎn)- 通路網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步探討川楝素抗肝腫瘤的系統(tǒng)機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 篩選出川楝素的靶點(diǎn)

分別用STITCH 數(shù)據(jù)庫(kù)、SEA 數(shù)據(jù)庫(kù)和TargetNet 數(shù)據(jù)庫(kù)（Prob≥0.3）篩選川楝素的可靠靶點(diǎn)，共得到靶點(diǎn)22 個(gè)。

2.2 肝腫瘤靶點(diǎn)的篩選

用DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置score≥0.3，共篩選出與肝腫瘤相關(guān)的靶點(diǎn)112 個(gè)。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以HINT 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://hint.yulab.org/）為人類全基因組蛋白互作信息的背景網(wǎng)絡(luò)，獲取川楝素的間接和直接作用靶點(diǎn)共258 個(gè)，肝腫瘤的間接和直接作用靶點(diǎn)共1 342 個(gè)，如圖2 所示。

圖2 川楝素與肝腫瘤的共有靶點(diǎn)（LN 表示肝腫瘤，TSD 表示川楝素）

由圖2 可知，取交集共得到川楝素抗肝癌腫瘤的99 個(gè)潛在靶點(diǎn)。將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入string 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得潛在靶點(diǎn)的加權(quán)蛋白- 蛋白相互作用（PPI）信息，設(shè)置minimum required interaction score≥0.900，除去離散的點(diǎn)，用cytoscape 軟件可視化PPI 網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包含了72 個(gè)節(jié)點(diǎn)，374 條邊，如圖3 所示。

圖3 川楝素抗肝腫瘤的靶點(diǎn)蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

進(jìn)一步進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，BetweennessCentrality 的中位數(shù)是0.00 442 429，degree 的中位數(shù)是10，以兩個(gè)參數(shù)的中位數(shù)2 倍值篩選出核心靶點(diǎn)9 個(gè)分別為：AKT1、EP300、UBC、ESR1、SRC、CREBBP、PIK3R1、CTNNB1、HSP90AA1，如圖4 所示。

圖4 9 個(gè)核心靶點(diǎn)的蛋白-蛋白相互作用

2.4 GO 和KEGG 分析

將PPI 網(wǎng)絡(luò)中的72 個(gè)重要靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp），設(shè)置P<0.01，共得到225 條GO 功能和66 條KEGG 通路，其中包括BP 131 條，CC 24 條，MF 70 條。分別選擇前10 條做富集分析的氣泡圖，如圖5 所示。

圖5 GO 和KEGG 富集分析結(jié)果

2.5 GO-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

選取前10 條GO、通路及其靶點(diǎn)，作GO- 靶點(diǎn)- 通路網(wǎng)絡(luò)，包括72 個(gè)靶點(diǎn)，10 條GO，10 條KEGG，共92 個(gè)節(jié)點(diǎn)，486 條邊，如圖6 所示。

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)構(gòu)建的生物網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析及網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的自由度可知，比較重要的GO 功能有：蛋白質(zhì)結(jié)合（72）、核（56）、核質(zhì)（44）、胞質(zhì)溶膠（40）、RNA 聚合酶II 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（30）、RNA 聚合酶II 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控（23）、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（22）和酶結(jié)合（22）等；比較重要的通路有：癌癥通路（28）、甲狀腺激素信號(hào)通路（19）、PI3K-Akt 信號(hào)通路（19）、前列腺癌通路（17）和癌癥中蛋白聚糖通路（16）等；比較重要的靶點(diǎn)有：AKT1（17）、PIK3R1（16）、CTNNB1（14）、GRB2（14）和PIK3R2（14）等。可見川楝素發(fā)揮抗肝腫瘤的機(jī)制主要與這些生物功能、通路和靶點(diǎn)相關(guān)。

圖6 GO-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)（橢圓形代表靶點(diǎn)，菱形代表GO，三角形代表通路）

磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）-AKT 信號(hào)通路調(diào)節(jié)許多與細(xì)胞存活、增殖及運(yùn)動(dòng)有關(guān)的細(xì)胞過程［20］。在許多類型的癌癥中均已報(bào)道了PI3K-Akt 的異常激活，并且許多與AKT 相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成分的表達(dá)和突變的改變也與人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)［21］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果同樣顯示，AKT1 與PIK3R1 在PPI 網(wǎng)絡(luò)和GO- 靶點(diǎn)- 通路網(wǎng)絡(luò)中處于重要位置，PI3K-Akt 信號(hào)通路在富集分析結(jié)果中也處于重要位置。另外，據(jù)報(bào)道CTNNB1 是肝癌發(fā)生中比較普遍的一種突變基因［22］。這些結(jié)果表明川楝素抗腫瘤的作用機(jī)制可能與預(yù)測(cè)到的這些靶點(diǎn)和通路密切相關(guān)。天然產(chǎn)物衍生的藥物通常具有多靶標(biāo)特性，這正是復(fù)雜疾病的治療藥物的特征［23］。本研究表明川楝素可能通過多種靶標(biāo)和多種信號(hào)通路發(fā)揮抗肝癌腫瘤效應(yīng)的治療作用。

總之，本研究通過系統(tǒng)藥理學(xué)虛擬篩選的方法闡明了川楝素用于肝癌的抗腫瘤治療的作用機(jī)制。當(dāng)然由于本研究基于大數(shù)據(jù)挖掘分析，因此有必要進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究以驗(yàn)證該發(fā)現(xiàn)。值得注意的是，這項(xiàng)工作提供了川楝素抗肝癌腫瘤作用機(jī)理的全面而系統(tǒng)的可視化評(píng)價(jià)。