譚月，邱明，李金龍，左陸雅，吳婉婷，霍忠明,2*，閆喜武,2

(1.大連海洋大學 水產(chǎn)與生命學院， 遼寧 大連 116023； 2.遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心， 遼寧 大連 116023)

菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum隸屬于軟體動物門Mollusca雙殼綱Veneroida簾蛤科Veneridae蛤仔屬Ruditapes，俗稱蛤蜊、蜆子、花蛤等[1]，是中國四大養(yǎng)殖貝類之一，中國年產(chǎn)量約300萬t，占世界總產(chǎn)量的90%以上，市場潛力巨大。目前，中國菲律賓蛤仔種質(zhì)資源遺傳基礎不清、北黃海等灘涂土著地方種質(zhì)丟失、人工培育的良種覆蓋率低等問題制約了產(chǎn)業(yè)發(fā)展。理清中國菲律賓蛤仔野生群體及潛在可作修復用途的日本、朝鮮群體的種質(zhì)遺傳基礎，開展蛤仔種質(zhì)資源保護和可持續(xù)利用，可成為解決目前所存問題的主要途徑。

動物線粒體DNA 由于具有分子量小、進化速度快、結(jié)構(gòu)簡單、母性遺傳等特點[2]，已經(jīng)被廣泛應用于水產(chǎn)動物的種質(zhì)遺傳研究中[3]。而16S rRNA 是線粒體基因組中既含有高度保守和中度保守的序列區(qū)域，又含有高度變化序列區(qū)域的一段序列，因此，被認為是科級以下水平物種間親緣關系和系統(tǒng)演化研究的有效標記[4]。目前，利用線粒體DNA基因序列進行菲律賓蛤仔遺傳多樣性的研究已有較多報道，胡利莎等[5]研究了10個菲律賓蛤仔野生群體的遺傳多樣性，結(jié)果表明，中國沿海的菲律賓蛤仔野生群體存在一定的遺傳分化，遼寧大連群體和山東榮成群體聚為一支,其余8個群體聚為一支。劉相全等[6]對菲律賓蛤仔和雜色蛤仔Ruditapesvariegata的線粒體16S rRNA 基因序列進行了分析，結(jié)果表明，兩種菲律賓蛤仔的親緣關系比較接近, 且與同為簾蛤科的硬殼蛤Mercenariamercenaria有明顯的差異。在國外，Cordero等[7]結(jié)合線粒體細胞色素C氧化酶(COI)基因序列及SSR(簡單重復序列)遺傳標記對1936年由日本引種至北美西海岸的菲律賓蛤仔群體的種質(zhì)遺傳基礎進行了評估。這些研究均為菲律賓蛤仔的種質(zhì)資源保護提供了參考。

目前，關于中國菲律賓蛤仔野生苗種產(chǎn)區(qū)的廣西北海、山東萊州、遼寧營口、天津群體，以及日本北海道、朝鮮新義州海域潛在可作為北黃海土著地方品種資源修復用途的群體的種質(zhì)資源狀況尚無報道。本研究中，利用16S rRNA序列多態(tài)性分析了中國4個野生苗種產(chǎn)區(qū)群體及日本北海道、朝鮮新義州群體的菲律賓蛤仔遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)[8]，以期為菲律賓蛤仔種質(zhì)資源保護及可持續(xù)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

菲律賓蛤仔樣本(表1)分別采自中國遼寧營口(YK)、天津(TJ)、山東萊州(LZ)、廣西北海(BH)、日本北海道(JH)和朝鮮新義州(NKS)，每個地區(qū)收集10個個體，在實驗室進行解剖，取其足和閉殼肌，使用體積分數(shù)為90%的乙醇固定，保存于冰箱(-20 ℃)中。

表1 菲律賓蛤仔6個群體的樣本信息

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物工程有限公司)提取菲律賓蛤仔基因組DNA，提取的DNA通過核酸定量儀檢測濃度，并通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，儲存于-20 ℃用于后續(xù)試驗。

1.2.2 PCR擴增 菲律賓蛤仔線粒體16S rRNA基因擴增所用的引物序列如下[9]：

正向16S rRNA：5′CGCCTGTTTAHYAAAAACAT 3′；

反向16S rRNA：5′CCGGTCTGAACTCAGMTCAYG 3′。

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。聚合酶鏈式反應(PCR)體系(50 μL)：100 ng的DNA模板5 μL， Mix(寶生物工程(大連)有限公司)25 μL，正、反向引物各2 μL，用去離子水定容至50 μL。擴增反應條件為：94 ℃下預變性5 min；94 ℃下循環(huán)變性30 s，56 ℃下退火復性30 s，72 ℃下延伸1 min，共進行35個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸7 min；4 ℃下結(jié)束。每個PCR產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠上進行檢測，驗證條帶。所有經(jīng)驗證的PCR產(chǎn)物均采用TaKaRa MiniBEST 瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒進行純化，然后使用ABI 3730 xl DNA分析儀測序系統(tǒng)(生工生物工程(上海)股份有限公司)對PCR引物進行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測序完成后，采用DNAMAN軟件手工檢測和修剪DNA序列。采用DnaSP 5.10.01軟件對菲律賓蛤仔進行遺傳多樣性分析[10]、中性測試及種群動態(tài)分析。采用MEGA 7軟件[9]計算群體間的 K2P(Kimura-2-parameter) 遺傳距離，并利用UPGMA法繪制單倍型遺傳聚類樹。采用Arlequin 3.0軟件[11]計算核苷酸組成、群體間遺傳分化指數(shù)(F-statistics，F(xiàn)ST)。通過POPART[12-14](http://www.http://POPART.otago.ac.nz/index.shtml)進行單倍型網(wǎng)絡分析。設置菲律賓蛤仔16S rRNA基因序列的置信閾值為95%，用于不同地理群體單倍型網(wǎng)絡圖的繪制。采用DNASP軟件將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為Nexfile文件格式，用POPART構(gòu)建菲律賓蛤仔Median-joining (MJ)[13]網(wǎng)絡圖，以檢測不同地理群體菲律賓蛤仔間的遺傳關系。

2 結(jié)果與分析

2.1 菲律賓蛤仔16S rRNA 基因片段堿基組成及單倍型分析

將測序序列剪切至相同長度的535 bp進行分析。6個地理群體16S rRNA 序列的平均堿基組成：T為33.46%，C為10.82%，A為33.79%，G為21.92%，A+T為67.26%。A+T含量依次為YK(67.36%)>LZ(67.28%)>TJ(67.25%)>JH(67.24%)>NPS(67.22%)>BH(67.18%)，堿基偏倚顯著，A+T含量顯著高于G+C含量，且與線粒體堿基組成一致。

根據(jù)DnaSP 5.0 軟件的分析結(jié)果，在菲律賓蛤仔6個地理群體中共獲得16S rRNA 基因的單倍型20個，為Hap-1～Hap-20。其中，從單倍型來看，Hap-1、Hap-3、Hap-9和Hap-14 4個單倍型為共享單倍型，其余16個單倍型為群體的獨享單倍型(表2)。

共享單倍型中，Hap-1 出現(xiàn)頻率最高，為中國北方的營口(YK)、萊州(LZ)、天津(TJ)，以及朝鮮新義州(NKS)和日本北海道(JH)群體所共有，占所有檢測個體的46.67%；Hap-3為中國營口(YK)、萊州(LZ)、天津(TJ)、北海(BH)群體所共有；從不同地理群體來看，營口(YK)和天津(TJ)群體的單倍型數(shù)量最豐富，各自有7個單倍型，日本北海道(JH)群體的單倍型數(shù)量最少，只有2個單倍型，其余群體的單倍型數(shù)量為3～6個(表2)。

表2 菲律賓蛤仔16S rRNA 基因序列的單倍型序列比對及在不同群體中的分布

2.2 菲律賓蛤仔不同地理群體16S rRNA基因的遺傳多樣性分析

從表3可見：從各地理群體來看，基于16S rRNA基因片段，天津(TJ)、營口(YK)和萊州(LZ)群體的單倍型多樣性(Hd)較高，分別為0.911、0.867和0.867，朝鮮新義州(NKS)和日本北海道(JH)群體單倍型多樣性(Hd) 較低，均為0.378；營口(YK)群體的平均核苷酸多樣性(Pi)和平均核苷酸差異數(shù)(K)在6個群體里最高，分別為0.010 60和5.578，日本北海道(JH)群體在6個群體里最低，分別為0.000 75和0.400。

2.3 菲律賓蛤仔單倍型發(fā)生關系

菲律賓蛤仔群體的單倍型網(wǎng)絡中介圖如圖1(a)所示，6個群體單倍型呈分散狀態(tài)，各個單倍型連接點間節(jié)點較多，單倍型分支呈現(xiàn)星狀分布，其中，Hap-1和Hap-3分別處于2個集中分支的中心，且所占比例較大，由此可推測，這兩個單倍型為菲律賓蛤仔的原始單倍型。

如圖1(b)所示，單倍型在群體中分布網(wǎng)絡圖能更加直觀地顯示單倍型在不同地理群體中的分布和系統(tǒng)演化關系， 4個共享單倍型(Hap-1、Hap-3、Hap-9和Hap-14)分別分散在不同地理群體中。

表3 菲律賓蛤仔6個不同地理群體mtDNA 16S rRNA 基因的遺傳多樣性分析

圖(a)中每個圓的大小與總單倍型頻率成正比；圖(b)中扇區(qū)的顏色代表不同的單倍型，扇區(qū)的大小代表該地點出現(xiàn)此單倍型的頻率。

根據(jù)菲律賓蛤仔6個群體的線粒體16S rRNA基因片段，構(gòu)建20個單倍型Neighbor-joining (NJ)系統(tǒng)進化樹(圖2)。其中，共享單倍型Hap-1分布在YK、LZ、TJ、NKS和JH群體中，Hap-3分布在營口(YK)、萊州(LZ)、北海(BH)和天津(TJ)群體中，Hap-9分布在萊州(LZ)、北海(BH)和天津(TJ)群體中，Hap-14分布在北海(BH)和天津(TJ)群體中。在20個單倍型中存在2個優(yōu)勢單倍型(Hap-1和Hap-3)，分別占個體數(shù)的46.67%和18.33%。

2.4 群體間遺傳距離與遺傳分化

從表4可見，6個群體間的K2P遺傳距離均小于0.01，未達到種間分化水平。采用16S rRNA基因序列的遺傳分化系數(shù)(FST)對群體間關系進行分析，結(jié)果表明：中國北方營口(YK)、萊州(LZ)、天津(TJ)3個群體間遺傳分化不明顯，南方北海群體(BH)與萊州(LZ)、營口(YK)群體間存在顯著的遺傳分化(P<0.05)，但與天津(TJ)群體間遺傳分化不顯著(P>0.05)；朝鮮新義州(NKS)與日本北海道(JH)群體間遺傳分化不顯著(P>0.05)，兩群體與北方營口(YK)和萊州(LZ)群體間遺傳分化也不顯著(P>0.05)，但與天津(TJ)和北海(BH)群體間遺傳分化顯著(P<0.05)。

YK—營口群體；LZ—萊州群體；BH—北海群體；TJ—天津群體；NKS—新義州群體；JH—北海道群體。群體名前的數(shù)字代表群體中出現(xiàn)的個體數(shù)。YK—Yingkou population； LZ—Laizhou population；BH—Beihai population；TJ—Tianjin population；NKS—Sinuiju population；JH—Hokkaido population.The number represents the number of individuals present in the populations.圖2 20種單倍型在6個群體中的分布及其系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Distribution of 20 haplotypes and NJ molecular phylogenetic tree in 6 populations

2.5 種群動態(tài)分析

通過線粒體16S rRNA基因?qū)Ψ坡少e蛤仔不同地理群體進行錯配分析。錯配分析(Mismatch distribution)曲線圖可以對種群的歷史動態(tài)進行分析，當種群為新形成或近期發(fā)生擴張時，其錯配分析曲線呈單峰；當種群為一個長期穩(wěn)定的群體時，錯配分析曲線出現(xiàn)多個峰值。本研究結(jié)果顯示(圖3)，6個群體均呈現(xiàn)雙峰或多峰，6個地理群體在近期未發(fā)生快速擴張，群體處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)。

表4 菲律賓蛤仔6個地理群體間K2P遺傳距離(上三角)和遺傳分化系數(shù)(FST) (下三角)

圖3 基于16S rRNA 基因菲律賓蛤仔6個地理群體的錯配分布分析Fig.3 Mismatch distribution analysis of 6 populations of Manila clam Ruditapes philippinarum based on 16S rRNA gene

3 討論

3.1 群體遺傳多樣性

本研究中對菲律賓蛤仔線粒體16S rRNA基因片段單倍型進行分析， 6個群體共檢測到20個單倍型，包括4個共享單倍型和16個獨享單倍型，這說明不同地理群體有部分基因交流的同時，也存在一定程度遺傳分化。其中，共享單倍型Hap-1發(fā)生頻率最高，在群體中分布最廣，故認為該單倍型是最原始的單倍型，能夠適應環(huán)境變化并在群體中保持穩(wěn)定存在。

遺傳多樣性是指物種內(nèi)部和物種間的遺傳變異程度，是生物適應環(huán)境和物種進化的基礎。單倍型多樣性描述了樣品間的等位基因差異，而核苷酸多樣性代表了DNA序列間核苷酸差異的平均數(shù)量[15]。單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)是衡量遺傳多樣性的兩個重要參數(shù)[16]。一般來說，存在4種情況：

1) 單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)的變異均較低(Hd<0.5，Pi<0.005)時，意味著最近發(fā)生過群體瓶頸效應或由單一、少數(shù)群體所產(chǎn)生的建立者效應。

2) 單倍型多樣性指數(shù)較高而核苷酸多樣性指數(shù)較低(Hd>0.5，Pi<0.005)時，預示著群體曾經(jīng)歷過瓶頸效應后，伴隨了迅速的群體擴張與變異的積累。

3) 單倍型多樣性指數(shù)較低而核苷酸多樣性指數(shù)較高(Hd<0.5，Pi>0.005)時，提示可能是來自兩個獨立群體發(fā)生的二次接觸所導致，或者是一個大而穩(wěn)定的群體中發(fā)生過瓶頸效應。

4) 高單倍型多樣性和高核苷酸多樣性指數(shù)均較高(Hd>0.5，Pi>0.005)時，表明一個大而穩(wěn)定的群體是經(jīng)過長時間演化或是兩個不同系群的群體二次接觸所產(chǎn)生的[17]。

本研究中，檢測到朝鮮NKS和日本JH群體遺傳多樣性指數(shù)均較低(Hd<0.5，Pi<0.005)，其原因可能是群體建立者效應，2個群體在相對較短的時間內(nèi)獲得核苷酸變異的個體，但在短時間內(nèi)核苷酸出現(xiàn)變異的數(shù)量不足，導致群體中核苷酸多樣性降低，使其群體遺傳多樣性下降。另外，也可能是由于本研究中樣本數(shù)量較少導致2個群體遺傳多樣性降低，在以后的研究中，應擴大群體樣本數(shù)量，并結(jié)合其他分子標記和基因組測序方法，對這兩個群體遺傳多樣性開展進一步分析。天津、營口、萊州和廣西群體具有較高的遺傳多樣性，這反映了其具有較強的環(huán)境適應性和較大的遺傳變異潛力。

物種的遺傳多樣性與其對環(huán)境的適應能力、物種進化潛力及生存能力密切相關。遺傳多樣性豐富的物種面對環(huán)境變化時具有較強的適應性，在物種進化方面表現(xiàn)出較好的潛力，而遺傳多樣性的匱乏對于種質(zhì)資源保護和利用產(chǎn)生諸多不利影響。本研究中，根據(jù)單倍型遺傳多樣性、遺傳及群體動態(tài)分析，在6個群體中，天津(TJ)、營口(YK)、萊州(LZ)群體的單倍型個數(shù)、單倍型多樣性和核酸多樣性較高，北海(BH)群體遺傳多樣性次之，朝鮮新義州(NKS)和日本北海道群體(JH)遺傳多樣性較低。菲律賓蛤仔在相鄰海域內(nèi)存在廣泛的基因交流。中國人工異地移養(yǎng)菲律賓蛤仔活動對本地野生群體基因資源產(chǎn)生了一定影響。

3.2 群體遺傳距離與遺傳分化

K2P方法主要用來計算種間水平的遺傳距離[18]，一般種內(nèi)K2P遺傳距離小于0.01，只有個別物種的種內(nèi)遺傳距離大于0.02[19-22]。但K2P方法并不能準確反映群體間的遺傳分化程度[18-19]。因此，本研究中首先使用 K2P方法檢測不同群體間菲律賓蛤仔遺傳距離，再使用FST評估群體間遺傳分化程度。本研究表明，6個群體的遺傳距離均小于0.01，并未達到種間分化水平。FST可以用于群體間遺傳分化程度的評估，其值為-1～1，兩個群體間FST值越大，表示兩個群體的遺傳分化程度越高[23]。一般認為，00.25表示群體間分化程度極大。本研究中6個野生地理群體FST值為-0.040 79～0.566 67，中國南方北海群體與中國北方群體(除天津群體)、日本群體和朝鮮群體遺傳分化顯著，6個群體可劃分為南、北2個譜系，即中國南方北海群體為南方譜系，其他5個群體為北方譜系。在前期的研究報道中，陳辰等[24]將毛蚶Scapharcasubcrenata劃分為南、北方2個群系，這可能是由于中國長江淡水形成的天然屏障阻斷了海洋貝類南、北方自然種群的基因交流，同一貝類物種在不同的地理格局，經(jīng)過上萬年的隔離和群體演化，形成了具有明顯特征的南、北方譜系。

菲律賓蛤仔幼蟲浮游時間長(2～3周)、分布空間廣、環(huán)境適應能力強的特點，提高了群體擴張和基因交流的效率。Cordero等[6]發(fā)現(xiàn)，菲律賓蛤仔日本群體自1936年被引入北美加拿大不列顛哥倫比亞海岸后，經(jīng)過30余年的繁衍即擴張到美國南加利福尼亞州。Chiesa等[25]報道，1972年被引種到法國、英國、意大利、西班牙等歐洲沿岸的菲律賓蛤仔與本地土著品種發(fā)生了基因漸滲。本研究中，北海道群體和新義州群體的蛤仔遺傳分化程度較低，可能與選擇的分子標記有關，在今后的研究中可采用具有較高多態(tài)性的微衛(wèi)星標記對群體遺傳多樣性進行分析；在明顯的南北方譜系中，南方北海群體與北方天津群體遺傳分化不顯著，這兩個群體均存在共享單倍型Hap-14，這可能與天津海域人工移養(yǎng)菲律賓蛤仔南方苗種有關[26]，在此過程中，南方北海群體與北方群體得到了一定程度的基因交流；在北方譜系中，天津群體與日本、朝鮮群體均分化顯著，天津與日本、朝鮮群體除了北方特有單倍型Hap-1外無其他共享單倍型，天津群體與北海群體有3個共享單倍型(Hap-3、Hap-9和Hap-14)，說明天津群體由于人工移養(yǎng)南方苗種發(fā)生基因交流密切，由此與日本、朝鮮群體產(chǎn)生顯著分化。中國北方營口、天津及萊州群體間遺傳分化不顯著，這可能與其在同一海域相互間廣泛的基因交流有關。結(jié)合本研究的遺傳分化和共享單倍型地理分布結(jié)果，分析中國北方3個群體、朝鮮新義州和日本北海道群體的基因流為距離隔離模式(Isolation-By-Distance Model)，即菲律賓蛤仔屬于活動范圍有限，出生到死亡基本無較大移動范圍的物種，各個群體在空間上連續(xù)分布，由于受個體間隨機交配范圍的限制，基因頻率在相鄰群體間差異小，不同群體在地理位置和遺傳距離間存在聯(lián)系。

3.3 種質(zhì)資源的保護

根據(jù)本研究結(jié)果，今后的研究工作中可以將天津、營口、萊州和北海野生群體作為主要研究對象，利用線粒體COI基因序列及SSR(簡單重復序列)等分子標記,以及SLAF(特異位點擴增片段)簡化基因組技術(shù)對群體進行遺傳多樣性分析。日本朝鮮群體，種內(nèi)檢測到的遺傳變異水平較低，基于該分子標記檢測出蛤仔北海道和新義州群體遺傳分化不顯著，這可能與選擇的分子標記有關，在今后的研究中可采用核基因標記(微衛(wèi)星標記)進行分析。在進一步確定種質(zhì)優(yōu)良的蛤仔群體基礎上，通過原良種場建設等方法，對種質(zhì)資源進行保護，同時可以將原種場自然野生苗種進行有計劃的采捕和換區(qū)移養(yǎng)，最終達到可持續(xù)利用目的。

4 結(jié)論

1) 菲律賓蛤仔天津、營口、萊州及北海4個群體具有較豐富的遺傳多樣性，朝鮮新義州和日本北海道群體遺傳多樣性較低。

2) 6個群體可劃分為南、北方譜系，即北海群體為南方譜系，其他5個群體為北方譜系；中國北方3個群體(營口、天津和萊州)及日本、朝鮮群體間存在距離隔離模式基因流。

3) 中國人工異地移養(yǎng)菲律賓蛤仔活動對本地野生群體基因資源產(chǎn)生一定影響。