羅非魚“粵閩1號”母本選育群體世代間遺傳差異的微衛(wèi)星分析

劉志剛，曹建萌，高風英，可小麗，王淼，衣萌萌，盧邁新

(中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室，廣東 廣州 510380)

羅非魚是中國重要淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類之一，2019年中國羅非魚總產(chǎn)量達164.17萬t，占世界羅非魚養(yǎng)殖總產(chǎn)量的1/3以上[1]。培育具有生長速度快、抗病抗逆性強、雄性率高和體色均一等優(yōu)良性狀的羅非魚新品種對羅非魚產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。中國自1956年首次從國外引種莫桑比克羅非魚以來，至今已成功培育了13個羅非魚新品種(奧尼魚、福壽魚、尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚、吉富品系尼羅羅非魚、“新吉富”羅非魚、“夏奧1號”奧利亞羅非魚、“吉鱺”羅非魚、尼羅羅非魚“鷺雄1號”、吉富羅非魚“中威1號”、吉奧羅非魚、莫荷羅非魚“廣福1號”和羅非魚“壯羅1號”)，羅非魚種質(zhì)資源的不斷發(fā)展壯大極大地促進了中國羅非魚產(chǎn)量和品質(zhì)的提升。

羅非魚“粵閩 1號”為本研究團隊近年來培育的新品種，是以經(jīng)過多代選育的尼羅羅非魚Oreochromisniloticus為母本，以超雄羅非魚Oreochromissp.為父本雜交獲得的子一代，具有自然雄性率高、生長速度快和出肉率高等特點[2]。其母本是以臺灣引進的尼羅羅非魚為基礎(chǔ)群體，以生長速度、體型和子代性別比例為主要指標連續(xù)多代選育獲得，選育5代后其生長速度提高了18.99%，體長/頭長比值提高了10.54%。但選育群體在選育過程中易受保種群體大小、人工選擇和遺傳漂變等因素的影響導致群體遺傳多樣性降低或近交衰退，從而降低其遺傳潛力[3]。為了保證其優(yōu)良性狀的穩(wěn)定遺傳，有必要對其選育群體各世代的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進行監(jiān)測。在長江刀鱭Coiliaectenes[3]、大口黑鱸Micropterussalmoides[4]、新吉富羅非魚OreochromisniloticusNEW GIFT strian[5]、華南鯉Cyprinuscarpiorubrofuscus[6]和草魚Ctenopharyngodonidella[7]等魚類中均發(fā)現(xiàn)，群體的遺傳變異會隨著選育世代的推進而不斷下降。因此，對羅非魚“粵閩 1號”母本選育過程中各世代的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進行監(jiān)測具有重要意義。同時，通過分析羅非魚“粵閩 1號”母本選育群體與不同尼羅羅非魚地理群體之間的遺傳關(guān)系可揭示其遺傳背景，也可為篩選外群個體用于提高選育群體遺傳多樣性提供理論依據(jù)。

微衛(wèi)星標記具有數(shù)量多、分布廣泛且均勻、多態(tài)性豐富、呈孟德爾共顯性遺傳、重復性好和可高通量檢測等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于魚類選育過程中群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析[3-8]、種質(zhì)鑒定[9]、親權(quán)分析[10]和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建[11]等研究。為了揭示羅非魚“粵閩1號”母本選育群體的遺傳背景及人工選擇對其遺傳結(jié)構(gòu)的影響，本研究中采用微衛(wèi)星技術(shù)分析了羅非魚“粵閩 1號”母本3個選育世代(F2、F4和F6世代)的遺傳多樣性和遺傳分化，并進一步分析了其與4個尼羅羅非魚地理群體(高要群體(GY)、惠州群體(HZ)、茂名群體(MM)和無錫群體(WX))之間的遺傳關(guān)系，旨在為羅非魚“粵閩1號”母本的進一步人工選育和遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

羅非魚“粵閩1號”母本(尼羅羅非魚)3個選育世代群體(F2、F4和F6)的樣本均采自福建省漳州市福建百匯盛源水產(chǎn)種業(yè)有限公司養(yǎng)殖基地羅非魚繁育保種池塘。4個尼羅羅非魚地理群體的樣本分別采自肇慶高要、惠州、茂名和無錫的羅非魚魚苗繁殖池塘，并分別命名為GY群體、HZ群體、MM群體和WX群體。上述每個選育世代群體和地理群體均隨機采集羅非魚尾鰭樣本20份，置于無水乙醇中-40 ℃下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用動物組織基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)抽提上述尾鰭樣本基因組DNA，提取步驟參照試劑盒說明書進行。采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA質(zhì)量，采用超微量分光光度計(OSE-260, TIANGEN)檢測DNA的濃度及純度，并用無菌雙蒸水將DNA稀釋至質(zhì)量濃度為50 ng/μL，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星序列PCR擴增 從Lee等[11]報道的尼羅羅非魚二代遺傳連鎖圖譜的每個連鎖群中隨機選取2 ～ 4個微衛(wèi)星位點，引物序列從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得，通過預試驗從中篩選獲得13個能夠在尼羅羅非魚中穩(wěn)定擴增、多態(tài)性較好的微衛(wèi)星位點，其分布于12個連鎖群，相應(yīng)位點的熒光標記引物由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成，引物詳細信息見表1。PCR擴增體系(總體積10 μL)包括：2×Taq PCR Master Mix (TaKaRa, Japan) 5.0 μL,上、下游引物(10 μmol/L) 各0.5 μL，DNA模板(50 ng/μL) 1.0 μL，無菌雙蒸水3 μL。采用降落PCR進行擴增。反應(yīng)程序為:95 ℃下預變性5 min；95 ℃下變性30 s，62～54 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共進行10個循環(huán)；95 ℃下變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進行22個循環(huán)；最后在72 ℃下延伸10 min。根據(jù)PCR產(chǎn)物大小不重疊的原則混合PCR產(chǎn)物后，利用ABI 3730 xl DNA測序儀進行多重毛細管電泳檢測分型。

1.3 基因分型與數(shù)據(jù)分析

將毛細管電泳檢測結(jié)果導入到GeneMarker軟件中，分析每對引物擴增產(chǎn)物的大小，采用 Popgen 3.2軟件統(tǒng)計各個微衛(wèi)星位點上的等位基因數(shù)(allele number，Na)、有效等位基因數(shù)(effective allele number，Ne)、觀測雜合度(observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity，He)、Shannon 指數(shù)(Shannon index，I)、 遺傳距離(genetic distance，Da)和遺傳相似度(genetic similarity index)。 采用PIC-CALC軟件計算多態(tài)性信息含量(polymorphism information content，PIC)。

采用 MEGA 4.1軟件中非加權(quán)配對算術(shù)平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。利用Arlequin 3.0軟件對群體遺傳變異進行分子方差分析(AMOVA)，并計算遺傳分化系數(shù)(proportion of genetic differentiation，F(xiàn)ST)。

表1 微衛(wèi)星位點的退火溫度及其熒光標記引物序列信息Tab.1 Fluorescence labeled primer sequences and annealing temperature of microsatellite loci

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星位點的多態(tài)性

13對微衛(wèi)星引物在羅非魚“粵閩1號”母本的3個選育世代群體(F2、F4和F6)和4個尼羅羅非魚地理群體(高要群體(GY)、惠州群體(HZ)、茂名群體(MM)和無錫群體(WX))中均能穩(wěn)定重復地擴增出特異性片段。13對微衛(wèi)星引物在上述7個尼羅羅非魚群體中共擴增出176個等位基因，平均等位基因數(shù)(Na)為13.538 5，平均有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon指數(shù)(I)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態(tài)性信息含量(PIC)和近交系數(shù)(Fis)分別為6.220 7、2.027 9、0.648 0、0.810 9、0.789 9和0.101 5(表2)。

2.2 群體內(nèi)遺傳多樣性

羅非魚“粵閩1號”母本3個選育世代F2、F4和F6的平均等位基因數(shù)分別為7.307 7、5.538 5和3.923 1，呈現(xiàn)出隨著選育世代增加而逐漸減少的趨勢；此外，有效等位基因數(shù)、期望雜合度、Shannon指數(shù)和多態(tài)性信息含量等多態(tài)性參數(shù)也隨選育進程逐漸下降，但3個選育世代仍表現(xiàn)為高度多態(tài)性(PIC>0.5)(表3)。

在4個尼羅羅非魚地理群體中GY和MM群體的遺傳多樣性較高，其PIC分別為0.754 1和0.748 6，其次為HZ群體，WX群體的遺傳多樣性最低；GY、MM和HZ群體的遺傳多樣性顯著高于羅非魚“粵閩1號”母本的3個選育世代群體，而WX群體的遺傳多樣性與3個選育世代群體相當(表3)。

2.3 群體間遺傳距離與親緣關(guān)系

遺傳距離和遺傳相似度分析結(jié)果表明:在羅非魚“粵閩1號”母本的3個選育世代中，F(xiàn)2和F4的遺傳距離最小(0.155 6)，遺傳相似度為0.855 9；隨著選育世代增加，世代間遺傳距離增大，F(xiàn)2與F6之間的遺傳距離為0.351 8，遺傳相似度為0.703 5；在4個尼羅羅非魚地理群體中，HZ群體與GY群體的遺傳相似度最高，為0.795 2，遺傳距離為0.229 2；MM群體與WX群體之間遺傳相似度次之，為0.717 8，遺傳距離為0.368 4；在7個尼羅羅非魚群體中，F(xiàn)2、F4兩個選育群體與F6群體的遺傳距離要大于它們與HZ和GY群體的遺傳距離(表4)。

表2 13個微衛(wèi)星位點在7個尼羅羅非魚群體中的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Genetic diversity parameters of the 13 microsatellite loci in 7 populations of Nile tilapia Oreochromis niloticus

表3 羅非魚“粵閩1號”母本的選育世代間和尼羅羅非魚地理群體間的遺傳參數(shù)

表4 羅非魚“粵閩1號”母本的選育世代間和尼羅羅非魚地理群體間的遺傳距離(左下部分)和遺傳相似度(右上部分)

基于群體間遺傳距離的UPGMA系統(tǒng)樹進化分析顯示，MM群體與WX群體聚為一大支，羅非魚“粵閩1號”母本3個選育世代群體與HZ、GY群體聚為另一大支，其中F6群體獨立聚為一小支(圖1)。

2.4 群體間遺傳分化

根據(jù)Wright[12]的劃分標準：當FST為0～0.05時表示群體間遺傳分化微弱；當FST為0.05～0.15時表示群體遺傳分化中等；當FST為0.15～0.25時表示群體遺傳分化較大；當FST大于0.25時，表示遺傳分化極大。羅非魚“粵閩1號”母本的3個選育世代群體中，F(xiàn)2與F4遺傳分化微弱，其FST為 0.036 4；F2、F4二者與F6之間均為中等遺傳分化，其FST分別為0.095 5和 0.111 1，隨著選育進程，世代間遺傳分化不斷加??；4個尼羅羅非魚地理群體中，HZ與GY群體間遺傳分化微弱，但它們與WX和MM群體均具有中等遺傳分化；羅非魚“粵閩1號”母本的3個選育世代群體與4個地理群體中的GY、HZ和MM群體之間遺傳分化中等，而與WX群體之間遺傳分化較大(表5)。

圖1 基于遺傳距離構(gòu)建的7個尼羅羅非魚群體的UPGMA系統(tǒng)進化樹Fig.1 Dendrogram of seven populations of Nile tilapia Oreochromis niloticus based on genetic distance using UPGMA method

AMOVA分析結(jié)果表明，羅非魚“粵閩1號”母本的3個選育世代群體和4個尼羅羅非魚地理群體的遺傳分化有90.01%來自群體內(nèi)個體間遺傳差異，僅有9.99%來自群體間(表6)。

表5 羅非魚“粵閩1號”母本的選育世代間和尼羅羅非魚地理群體間的遺傳分化系數(shù)(FST)

表6 尼羅羅非魚7個群體間的分子方差分析

3 討論

3.1 不同選育世代的遺傳多樣性分析

本研究中采用13對熒光標記微衛(wèi)星引物和多重毛細管電泳方法對羅非魚“粵閩 1號”母本3個選育世代和4個尼羅羅非魚地理群體進行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，與傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳微衛(wèi)星基因分型方法相比，熒光標記多重毛細管電泳具有所需樣品量低、分辨率高、重復性好、準確度高、通量高等優(yōu)點，可大大提高等位基因分型效率[13]。此外，Barker[14]認為具有4個或4個以上等位基因的微衛(wèi)星位點才能較好地用于物種遺傳多樣性分析。本研究中采用的13對微衛(wèi)星引物在7個尼羅羅非魚群體中共擴增出176個等位基因，平均等位基因數(shù)為13.538 5，平均有效等位基因數(shù)為6.220 7，平均多態(tài)信息含量為0.789 9，這說明13個微衛(wèi)星位點的多態(tài)性較高，可用于尼羅羅非魚群體的遺傳參數(shù)分析。本研究結(jié)果還表明，羅非魚“粵閩 1號”母本F2、F4和F6 3個選育世代的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、期望雜合度、Shannon多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息含量等遺傳多樣性參數(shù)均呈現(xiàn)出隨著選育世代增加而降低的趨勢，這說明人工選育導致該選育群體的遺傳變異有所下降，逐步趨向純化，符合選育預期。在“新吉富”羅非魚[5]、羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii[15]和翹嘴鱖Sinipercachuatsi[16]等多種魚類選育群體中也有類似報道，選育群體遺傳多樣性下降可能與人工選育過程中基因逐漸趨于純合，以及低頻等位基因的丟失有關(guān)。Botstein等[17]認為，當PIC>0.5時為高度多態(tài)性，當PIC為0.25～0.5時為中度多態(tài)性，當PIC<0.25時為低度多態(tài)性，由此可知，雖然本研究中選育群體(F2、F4和F6)的遺傳變異隨著選育世代的進行有所下降，但仍為高度多態(tài)性(PIC>0.5)，具有進一步選育的潛力。為了避免選育過程中近親繁殖和“瓶頸”效應(yīng)導致遺傳多樣性進一步下降，需要保種足夠數(shù)量的有效親本，也可通過引進遺傳多樣性較高的外群尼羅羅非魚個體進行雜交而得到改善。本研究中對4個尼羅羅非魚地理群體的遺傳多樣性分析結(jié)果表明，GY、MM和HZ群體的遺傳多樣性顯著高于羅非魚“粵閩 1號”母本的選育群體，可以作為潛在的候選引種群體。

3.2 不同選育世代的遺傳分化

遺傳距離和遺傳相似度是衡量群體間遺傳分化程度的重要指標。根據(jù)Thorpe[18]提出的理論，同物種群體間的遺傳距離在0.03～0.2之間，遺傳相似度在0.8～0.97之間。本研究結(jié)果表明，羅非魚“粵閩 1號”選育世代群體F2與F4之間遺傳距離為0.155 6，遺傳相似度為0.855 9，符合該理論；但F2與F6之間的遺傳距離增大至0.351 8，遺傳相似度為0.703 5，F(xiàn)4與F6之間的遺傳距離為0.375 7，遺傳相似度為0.686 8，均超出了該理論界定的同物種群體間遺傳距離和遺傳相似度范圍。這說明人工選育對選育群體的遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了較大影響，隨著選育世代的進行，世代間遺傳距離逐漸增大，F(xiàn)2與F4親緣關(guān)系較近，為同種群體，而F6已經(jīng)演變成一個獨立的亞種群體。根據(jù) Wright[12]對遺傳分化系數(shù)的界定，本研究中F2與F4之間存在微弱遺傳分化(FST<0.05)，而F2和F4二者與F6之間均存在中等遺傳分化(0.05

3.3 選育群體遺傳基礎(chǔ)的拓寬

選擇育種往往需要連續(xù)多代選育才能獲得可穩(wěn)定遺傳的優(yōu)良性狀，但隨著選育代數(shù)增加，群體遺傳多樣性往往會不斷下降，影響進一步選育的效果。適當拓寬選育群體的遺傳基礎(chǔ)可為其選育工作的持續(xù)進行提供有力保障。Melchinger等[19]研究表明，在遺傳距離小于0.54的范圍內(nèi)，親本間的遺傳距離越大，其雜交子代的基因型雜合度越高，雜種優(yōu)勢越強。本研究結(jié)果表明，GY、HZ、MM和WX 4個尼羅羅非魚地理群體與選育世代群體F6的遺傳距離分別為0.526 4、0.582 9、0.624 4和0.979 4，只有GY群體與F6的遺傳距離小于0.54，而且該地理群體的遺傳多樣性最高，因此，其最適合作為潛在的引種群體與羅非魚“粵閩1號”母本選育群體進行雜交，從而拓寬其遺傳基礎(chǔ)，提高選育群體的遺傳多樣性和選育潛能。

4 結(jié)論

1) 羅非魚“粵閩1號”母本的選育群體在選育過程中遺傳多樣性隨選育世代進行不斷下降，遺傳分化不斷加劇，F(xiàn)6世代與F2、F4之間存在中等遺傳分化，選育群體仍然保持著較高的遺傳多樣性，具有進一步選育的潛力。

2) 4個尼羅羅非魚地理群體中GY群體的遺傳多樣性最高，與F6群體的遺傳距離適中，可作為潛在的引種群體與羅非魚“粵閩1號”母本選育群體進行雜交，用于提高選育群體的遺傳多樣性。