異煙酸-巴比妥酸分光光度法測定土壤氰化物和總氰化物方法研究

馮思敏，孫 文，孫緒博

（陜西地建土地工程技術研究院有限責任公司/陜西省土地工程建設集團有限責任公司/自然資源部退化及未利用土地整治工程重點實驗室/陜西地建土地工程質量檢測有限責任公司，陜西西安 710075）

氰化物是含氰基的一類化合物的總稱，屬于劇毒物質[1]，在酸性條件下具有揮發(fā)性，對人體的危害不可估量[2]。氰化物天然存在于2 000 多種植物中，其中有些是食用植物，例如木薯、杏、梨、李子、櫻桃、桃等的種子和果核中[3-4]；作為基本原材料廣泛應用于電鍍、冶煉、焦化等化工生產中[5]，產生的工業(yè)廢水進一步對土壤產生污染。土壤乃民之根本，大力推進凈土工程，保障農用地和建設用地土壤環(huán)境安全屬于重中之重的工作，檢測土壤中的氰化物對于飲食安全、保護環(huán)境具有十分重要的意義[6]。

目前，實驗室常用的測定氰化物的方法有硝酸鹽容量法、離子色譜法、異煙酸-吡唑啉酮分光光度法、異煙酸-巴比妥酸分光光度法，這幾種方法共同點都是土壤樣品在特定介質中經加熱蒸餾得到氰化氫，進一步進行反應得到氰化物和總氰化物的含量。硝酸鹽容量法雖操作簡單，但傳統(tǒng)滴定法滴定終點不好判斷，存在個體差異性，造成檢測結果誤差較大；離子色譜法需購置特定的檢測器；分光光度法操作簡單、成本低、測量結果穩(wěn)定，分為異煙酸-吡唑啉酮分光光度法和異煙酸-巴比妥酸分光光度法[7-8]，前者顯色溫度高，需要水浴加熱中顯色40 min，且檢出限高于后者，因此本文探討選用異煙酸-巴比妥酸分光光度法作為實驗室檢測土壤氰化物和總氰化物的可行性。

1 方法原理

1.1 氰化物測定原理

堿金屬、堿土金屬的氰化物及鋅氰絡合物等氰化物在pH=4 的酒石酸介質中，二價鋅存在下，經加熱蒸餾能形成氰化氫，該試樣中的氰離子在弱酸性條件下與氯胺T 反應生成氯化氰，與異煙酸作用，經水解反應生成戊烯二醛，再與巴比妥酸反應生成在600 nm波長有最大吸收的紫藍色化合物。

1.2 總氰化物測定原理

簡單氰化物（堿金屬、堿土金屬的氰化物及銨的氰化物）和絕大部分絡合氰化物在磷酸介質中，二價錫和二價銅作用下，加熱蒸餾能形成氰化氫，采用“1.1”所示的異煙酸-巴比妥酸分光光度法測定氰離子的含量，即異煙酸-巴比妥酸分光光度法測定土壤總氰化物的含量。

2 實驗

2.1 儀器與試劑

主要儀器：分光光度計，一體化萬用蒸餾儀，百分之一天平。

主要試劑：異煙酸、氫氧化鈉、巴比妥酸、磷酸二氫鉀、氯胺T、硝酸鋅、酒石酸、氯化亞錫、硫酸銅、磷酸、鐵氰化鉀。

標準物質：水中氰成分分析標準物質（GBW(E)080115）。

2.2 樣品的保存

土壤樣品采集后用可密封的聚乙烯或玻璃容器在4 ℃左右冷藏保存，樣品要充滿容器，并在采集后48 h內完成測試分析。

2.3 樣品的前處理

2.3.1 氰化物試樣制備

稱取約10 g干重的樣品，用稱量紙略微裹緊后移入蒸餾瓶。連接一體化萬用蒸餾儀，打開冷凝系統(tǒng)，在100 mL 比色管中加入10 mL 氫氧化鈉溶液（10 g·L-1）作為吸收液。在加入試樣后的蒸餾瓶中依次加200 mL水、3.0 mL 氫氧化鈉溶液（100 g·L-1）和10 mL 硝酸鋅溶液（100 g·L-1），搖勻，迅速加入5.0 mL 酒石酸溶液（150 g·L-1），立即蓋塞。打開一體化萬用蒸餾儀，設置實驗類別、加熱功率、重量控制等各項參數，進行反應，當接收瓶內試樣近100 mL時，停止蒸餾，用少量水沖洗餾出液導管后取出接收瓶，用水定容（V1），此為試樣A。

另稱取樣品進行土壤干物質的測定。

2.3.2 總氰化物試樣制備

稱取約10 g干重的樣品，用稱量紙略微裹緊后移入蒸餾瓶。連接一體化萬用蒸餾儀，打開冷凝系統(tǒng)，在100 mL 比色管中加入10 mL 氫氧化鈉溶液（10 g·L-1）作為吸收液。在加入試樣后的蒸餾瓶中依次加200 mL水、3.0 mL 氫氧化鈉溶液（100 g·L-1）、3.0 mL 氯化亞錫溶液（50 g·L-1）和10 mL 硫酸銅溶液（200 g·L-1），搖勻，迅速加入10 mL 磷酸（2.69 g·mL-1），立即蓋塞。打開一體化萬用蒸餾儀，設置實驗類別、加熱功率、重量控制等各項參數，開始加熱，當接收瓶內試樣近100 mL時，用少量水沖洗餾出液導管后取出接收瓶，用水定容（V1），此為試樣A。

另稱取樣品進行土壤干物質的測定。

2.3.3 空白試樣制備

蒸餾瓶中只加200 mL 水和3.0 mL 氫氧化鈉溶液（100 g·L-1），按步驟“2.3.1”或“2.3.2”操作，得到空白實驗試樣B。

2.4 樣品的測定

從試樣A、B 中吸取10.0 mL 于25 mL 具塞比色管中，向各管中加入5.0 mL 磷酸二氫鉀溶液（pH=4），混勻，迅速加入0.30 mL 氯胺T（10 g·L-1）溶液，立即蓋塞，混勻，放置1～2 min。向各管中加入6.0 mL異煙酸-巴比妥酸顯色劑，顯色。提前打開分光光度計預熱15 min，設置測量方法，包括吸收波長、樣品數目等參數，在600 nm 波長下，用10 mm 比色皿，以水為參比，測定吸光度。

3 分析與討論

3.1 操作要點探索

3.1.1 顯色條件的選擇

根據方法反應原理，氰離子在弱酸性條件下與氯胺T 反應生成氯化氰，與異煙酸和巴比妥酸的共同作用，生成在600 nm 波長有最大吸收的紫藍色絡合物，考慮到一般常規(guī)實驗室都并非嚴格控溫的恒溫實驗室，因此需要考察顯色溫度和顯色時間對反應的顯色效果影響情況。選取標準序列中含量為2 μg 的氰化物標準溶液進行實驗，考察了溫度依次為15、20、25、30 ℃，顯色時間依次為5、10、15、20、25、30 min時，分別測量樣品的吸光度，對比反應的顯色結果。

由圖1 可見，當溫度為15 ℃時，顯色時間30 min吸光度達到最大，即顯色效果最佳；當溫度為20 ℃時，顯色時間25 min顯色效果最佳；當溫度為25 ℃時，顯色時間15 min顯色效果最佳；當溫度為30 ℃時，顯色時間10 min 顯色效果最佳。當顯色效果達到最佳時，延長時間，吸光度基本不變。因此室溫在15～30 ℃區(qū)間，溫度越高顯色時間越短，反應越高效。

圖1 溫度和時間對顯色效果的影響

3.1.2 加熱功率的影響

在加熱蒸餾過程中通過一體化萬用蒸餾儀加熱單元的高溫來實現(xiàn)土壤氰化氫和浸出液基質的分離，蒸餾儀每個單元的加熱功率會決定加熱裝置的加熱溫度，進而影響氰化氫的蒸餾效果。對土壤樣品進行加標回收試驗，在10.0 g 干重的土壤樣品中分別加入4.0 μg 氰化物和總氰化物，考察了加熱功率在100、200、300、400、500、600 W時的前處理結果。

由圖2 可見，當加熱功率由100 W 升至300 W 時，土壤樣品溜出液的氰化物和總氰化物回收率持續(xù)增加并達到最高；繼續(xù)升高加熱功率由300 W 升至600 W，土壤樣品溜出液的氰化物和總氰化物回收率略微下降。因此，選擇加熱功率為300 W。

圖2 加熱功率對氰化物和總氰化物回收率的影響

3.2 線性范圍

于6 支25 mL 具塞比色管中分別加入氰化鉀標準使用溶液（0.500 μg·mL-1）0.00、0.10、0.50、2.50、4.00 和10.00 mL，再用氫氧化鈉溶液（10 g·L-1）定容至10 mL。標準系列中氰離子的含量分別為0.00、0.05、0.25、0.75、3.00、5.00 g。向各管中加入5.0 mL磷酸二氫鉀溶液（pH=4），混勻，迅速加入0.30 mL氯胺T（10 g·L-1）溶液，立即蓋塞，混勻，放置1～2 min。向各管中加入6.0 mL 異煙酸-巴比妥酸顯色劑，加水稀釋至標線，搖勻，于室溫下顯色。提前打開分光光度計預熱15 min，設置各項參數，以水為參比，測定吸光度。以氰離子的含量（μg）為橫坐標，以扣除試劑空白后的吸光度為縱坐標，繪制校準曲線。

結果表明，采用異煙酸-巴比妥酸分光光度法測定土壤氰化物和總氰化物，標準系列中氰離子的含量分別為0.00、0.05、0.25、0.75、3.00、3.50、5.00 μg，線性方程為y=0.140 3x-0.000 7，相關系數為0.999 9。滿足《土壤氰化物和總氰化物的測定分光光度法HJ 745-2015》（校準曲線回歸方程的相關系數γ≥0.999）的要求。

3.3 方法檢出限、測定下限的測定

根據《環(huán)境監(jiān)測分析方法標準制修訂技術導則》（HJ 168-2010）相關規(guī)定，按照樣品分析的全部步驟進行，對濃度為0.05 mg·kg-1的氰化物和總氰化物樣品進行7 次平行測定，計算7 次平行測定的標準偏差，按（1）式計算方法檢出限，數據匯總于表1。

（1）式中，MDL 為方法檢出限，t指“自由度為n-1、置信度為99%的t分布（單側）”，S為n次平行測定的標準偏差。

由表1 可見，當測試土壤樣品量為10 g，以異煙酸-巴比妥酸分光光度法測定氰化物、總氰化物的檢出限分別為0.007、0.008 mg·kg-1，測定下限分別為0.028、0.032 mg·kg-1。滿足《土壤氰化物和總氰化物的測定分光光度法HJ 745-2015》（當樣品量為10 g，異煙酸-巴比妥酸分光光度法的檢出限為0.01 mg·kg-1）的要求。

表1 氰化物和總氰化物方法檢出限、測定下限測試數據

3.4 方法精密度的測定

分別對3 個含量水平同類型土壤樣品的氰化物和總氰化物，按照樣品分析的全部步驟進行測定，經加熱蒸餾、分取、顯色、上機測定，每個樣品平行測定6 次，并分別計算不同樣品的平均值、標準偏差、相對標準偏差等各項參數，數據匯總于表2。

表2 氰化物和總氰化物精密度測試數據

由表2 可見，對于氰化物含量水平為0.165、0.184、2.48 mg·kg-1實際土壤樣品進行土壤氰化物測試，按照樣品分析的全過程分別平行測定6 次，相對標準偏差分別為5.9%、4.2%、3.6%，滿足《土壤氰化物和總氰化物的測定分光光度法HJ 745-2015》中精密度（實驗室內相對標準偏差分別為3.9%～16%、3.7%～12%、0.6%～8.1%）的要求。

對于總氰化物含量水平為0.187、0.413、23.0 mg·kg-1加標實驗分別測定6 次，總氰化物的相對標準偏差分別為12%、8.2%、3.9%，滿足《土壤氰化物和總氰化物的測定分光光度法HJ 745-2015》中精密度（相對標準偏差分別為2.2%～20%、3.5%～12%、2.2%～9.5%）的要求。

3.5 方法準確度的測定

通過加標實驗驗證方法的準確度。分別對2 個含量水平實際土壤樣品的氰化物和總氰化物，按照樣品10 g干重土壤樣品分析的全部步驟進行加標分析測定，每個樣品平行測定6 次，并分別計算氰化物和總氰化物加標實驗含量的平均值、加標量、加標回收率等各項參數，數據匯總于表3。

表3 氰化物和總氰化物加標回收實驗測試數據

由表3可見，經過對氰化物含量為0.17、0.18 mg·kg-1的實際樣品進行加標分析測定，加標量為4.0 μg，氰化物的回收率為90.3%、94.7%，滿足《土壤氰化物和總氰化物的測定分光光度法HJ 745-2015》中準確度（加標回收率最終值為87.7%±16.6%、85.4%±18.8%）的要求。經過對總氰化物含量為0.19、0.41 mg·kg-1的實際樣品進行加標分析測定，加標量為8.0 μg，氰化物的回收率為105.0%、94.2%，滿足《土壤氰化物和總氰化物的測定分光光度法HJ 745-2015》中準確度（加標回收率最終值為93.6%±29.8%、96.2%±22.4%）的要求。

4 結論

本文通過對異煙酸-巴比妥酸的顯色條件、一體化蒸餾儀的加熱功率的探索，確定了最佳的反應條件，在此基礎上經過對異煙酸-巴比妥酸分光光度法測定氰化物和總氰化物進行方法驗證，表明線性關系、檢出限、精密度、準確度均滿足《土壤氰化物和總氰化物的測定分光光度法HJ 745-2015》的要求。因此，本方法適合用于大批量測定土壤氰化物和總氰化物。