李 青，何 斌，趙海濤

(1.貴州省普通高等學(xué)校生物資源開(kāi)發(fā)與生態(tài)修復(fù)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 生態(tài)工程學(xué)院，貴州 畢節(jié) 551700)

卵黃蛋白原(Vitellogenin,Vtg)于1953年首次在惜古比天蠶蛾(Hyalophoracecropia)血液中被發(fā)現(xiàn)[1]，最初是對(duì)雌性昆蟲(chóng)血液淋巴蛋白的特稱[2],后廣泛定義為特異存在于非哺乳類性成熟卵生雌性動(dòng)物卵黃生成期血液中的一類蛋白質(zhì)。繁殖期內(nèi)魚(yú)類血清中Vtg水平呈現(xiàn)規(guī)律性波動(dòng)[3-5]，斑馬魚(yú)(Daniorerio)和斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)中Vtg含量與其成熟指數(shù)密切相關(guān)[6-7]。Vtg的合成主要受雌激素調(diào)控，可在成熟雌性動(dòng)物體中大量表達(dá)，雌雄個(gè)體間Vtg的表達(dá)水平具有顯著差異，Vtg被用于動(dòng)物成熟程度、外部性征不明顯動(dòng)物的性別鑒定。Vtg的合成包括內(nèi)源性和外源性2種方式，大多數(shù)魚(yú)類中Vtg的合成方式為外源性，Vtg在卵巢外組織肝臟中翻譯為前體蛋白之后，會(huì)經(jīng)歷一系列的修飾、剪切、分泌、運(yùn)輸和受體識(shí)別，最后儲(chǔ)存于卵巢組織，為胚胎發(fā)育提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、維生素及微量元素等營(yíng)養(yǎng)[8]。其中，Vtg的剪切是通過(guò)枯草芽孢桿菌酶及其同工酶完成，大多數(shù)Vtg同源蛋白具有一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)水解酶切位點(diǎn)(RXXR)，對(duì)于具有多個(gè)RXXR位點(diǎn)的Vtg同源蛋白，只有部分酶切位點(diǎn)可以發(fā)生剪切[9]。如褐飛虱Vtg具有3個(gè)RXXR位點(diǎn)，但僅在最保守的位點(diǎn)進(jìn)行剪切[10]，蟑螂具有5個(gè)酶切位點(diǎn)，只在其中3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生剪切[11]。

Vtg蛋白具有結(jié)構(gòu)保守性和多樣性，且分布廣泛，表明其生物學(xué)功能的多樣性[9]，如在魚(yú)中發(fā)現(xiàn)Vtg可以激活I(lǐng)gG Fc段受體(FcγR)，介導(dǎo)芽孢桿菌和大腸桿菌的吞噬作用[12-13]，中和血液中的病毒[14]，促進(jìn)培養(yǎng)中的動(dòng)物卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化[15]，結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子至卵母細(xì)胞[16]，調(diào)節(jié)社會(huì)型昆蟲(chóng)的覓食行為、勞動(dòng)分工和味覺(jué)反應(yīng)性變化[17]，協(xié)助精子受精[18]及降低氧化壓力[19]。1個(gè)完整的Vtg蛋白分子包括N端信號(hào)肽、卵黃脂磷蛋白重鏈(Lipovitellin heavy chain，LvH)、卵黃脂磷蛋白輕鏈(Lipovitellin light chain，LvL)、Vwfd (Von wilebrand factor type D domain)和富含磷酸化多聚絲氨酸(Phosvitin,Pv)結(jié)構(gòu)域。在硬骨魚(yú)中，Vwfd被切割成β′-C和CT兩部分。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和研究的不斷深入，一些非完整類型的Vtg也被發(fā)現(xiàn)[20-23]，卵黃蛋白原C蛋白(VtgC)屬于這種類型，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中只含有LvH和LvL，不含有Pv和β′-C結(jié)構(gòu)域。由于Pv結(jié)構(gòu)域含有多聚絲氨酸區(qū)域，該區(qū)域是通過(guò)氨基酸密碼子連續(xù)擴(kuò)增而產(chǎn)生，因此，具有該區(qū)域的Vtg亞型進(jìn)化速度比其他亞型快[24]。由于物種進(jìn)化速度不同，Vtg在不同物種間顯示出較大分歧度。因此，Vtg是很好的系統(tǒng)進(jìn)化分析的分子標(biāo)記[25]，其序列數(shù)據(jù)可應(yīng)用于系統(tǒng)進(jìn)化研究。

鯽魚(yú)(Carassiusauratus)隸屬于硬骨魚(yú)綱輻鰭亞綱，鯉形目鯉科鯽屬，廣泛分布于歐亞大陸，由于其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富和養(yǎng)殖靈活，很早就成為我國(guó)廣泛水產(chǎn)養(yǎng)殖物種。目前，我國(guó)已是世界上最大的鯽魚(yú)生產(chǎn)國(guó)。鯽魚(yú)冬季可在低溫下忍受數(shù)月缺氧，被認(rèn)為是最耐低氧的魚(yú)類之一[26]。鯽魚(yú)不僅是一種重要水產(chǎn)養(yǎng)殖物種，還被認(rèn)為是研究魚(yú)類進(jìn)化和耐低氧適應(yīng)分子機(jī)制的適當(dāng)模型。目前，關(guān)于魚(yú)類多倍體的起源、遺傳多樣性和耐低氧的機(jī)制尚未完全了解，在鯽魚(yú)上開(kāi)展的Vtg研究多集中于其作為理想雌激素及類雌激素標(biāo)志物應(yīng)用于水環(huán)境內(nèi)分泌干擾物檢測(cè)和評(píng)價(jià)[27-29]。開(kāi)展Vtg蛋白結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式及生物功能的研究，不僅為水產(chǎn)物種人工繁殖、病害防治和資源保護(hù)等工作奠定重要理論基礎(chǔ)，還可為進(jìn)一步探究魚(yú)類進(jìn)化和耐低氧分子機(jī)制提供依據(jù)。目前，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的鯽魚(yú)Vtg基因序列只有部分片段(GenBank No.:JQ776511.1和ABG22139)，關(guān)于鯽魚(yú)Vtg基因不同亞型結(jié)構(gòu)和表達(dá)分析的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，以鯽魚(yú)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆獲得鯽魚(yú)中Vtg基因2個(gè)亞型(分別命名為Ca-VtgAo1和Ca-VtgC)的cDNA全長(zhǎng)序列，利用生物信息學(xué)方法對(duì)鯽魚(yú)中2個(gè)Vtg基因編碼的氨基酸序列組成、理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行分析，揭示其不同亞型的分子特征。此外，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析Ca-VtgAo1mRNA在雌雄鯽魚(yú)不同組織中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步探究Vtg不同亞型的生物學(xué)功能及其分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

分別取雌性性成熟鯽魚(yú)的腎臟、卵巢、肝臟、鰓、腸和心臟組織，雄性性成熟鯽魚(yú)的腎臟、精巢、血液、鰓、肝臟和脾臟組織，用液氮冷凍并于-80 ℃保存，備用。

1.2 鯽魚(yú)Ca-VtAo1和Ca-VtgC cDNA全長(zhǎng)的克隆和生物信息學(xué)分析

提取雌性鯽魚(yú)肝臟組織總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA(TaKaRa PrimeScript Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis Kit)。從鯽魚(yú)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選Vtg基因片段，根據(jù)Vtg已知片段設(shè)計(jì)特異性引物(Ca-VtgAo1上游引物：5′-TGACCAAGACTTTCACCATC-3′，下游引物：5′-ATGCGAGACCTGGACCCTGA-3′;Ca-VtgC上游引物：5′-TCATTGGCGAATCACCTCA-3′，下游引物：5′-TGCCTGTCCAGCCTCATT-3′)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組中Vtg片段序列的正確性。以驗(yàn)證后的Ca-VtgAo1和Ca-VtgC正確序列為模板設(shè)計(jì)引物(Ca-VtgAo1上游引物：5′-ATTGCCCGTGCTGTGAGA-3′，下游引物：5′-GCAGCAAGTTGGTAGCC-3′;Ca-VtgC上游引物：5′-AAAGTTCCTTCCAGGCTACAC-3′，下游引物5′-CTTTTCCCAGGTAAGCCATT-3′)，采用RACE PCR技術(shù)克隆Vtg cDNA末端(Bio-Rad SMARTerTMRACE cDNA Kit)，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min;94 ℃變性30 s,58 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸3 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。使用DNAStar SeqMan軟件拼接獲得Ca-VtgAo1和Ca-VtgC基因cDNA全長(zhǎng)序列。使用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)程序比對(duì)Ca-VtgAo1和Ca-VtgC與其他物種Vtg基因的同源性，確保克隆獲得目的基因序列的正確性。利用在線軟件ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)分析Ca-VtgAo1和Ca-VtgCcDNA序列中開(kāi)放閱讀框及其編碼的氨基酸序列，利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析Ca-VtgAo1和Ca-VtgC基因編碼氨基酸序列的功能域，利用SignalP4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services-/SignalP)預(yù)測(cè)Ca-VtgAo1和Ca-VtgC基因編碼的氨基酸序列是否含有信號(hào)肽，利用ExPASy (http://web.expasy.org/protparam) 分析Ca-VtgAo1和Ca-VtgC基因編碼蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量及等電點(diǎn)(pI)。

1.3 Vtg同源蛋白序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

使用BLASTX分別搜索與Ca-VtgAo1和Ca-VtgC蛋白同源性高的動(dòng)物蛋白質(zhì)序列(表1)，使用DNAMAN軟件比對(duì)不同物種間Vtg同源基因編碼的氨基酸序列的相似度，然后使用MEGA 4.0軟件進(jìn)行同源與聚類分析，采用鄰接法(Neighbor-joining,NJ) 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

表1 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)物種信息

續(xù)表1 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)物種信息

1.4 鯽魚(yú)Ca-VtgAo1 mRNA表達(dá)模式分析

分別提取雌性鯽魚(yú)腎臟、卵巢、肝臟、鰓、腸和心臟組織，雄性鯽魚(yú)腎臟、精巢、血液、鰓、肝臟和脾臟組織的RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA(TaKaRa SYBR Premix ExTaqTM)，以Ca-VtgAo1基因序列為模板設(shè)計(jì)引物(上游引物：5′-ACCAAGACTTTCACCATCAT-3′，下游引物：5′-GCAGCAAGTTGGTAGCC-3′)，鯽魚(yú)β-actin基因(上游引物：5′-TGCAAGAGGCTGGAGCTCAG-3′，下游引物：5′-TCCTGGCAGTGGCTCAGATC-3′)作為內(nèi)參，每個(gè)樣本設(shè)計(jì)3個(gè)平行重復(fù)，使用BioRad CFX96TMReal-time PCR檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)Ca-VtgAo1mRNA表達(dá)模式進(jìn)行分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Bio-Rad CFX Manager軟件分析溶解曲線，通過(guò)2-ΔΔCt分析Ca-VtgAo1mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件中的One-way ANOVA對(duì)Ca-VtgAo1mRNA在鯽魚(yú)不同組織中相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯽魚(yú)Ca-VtgAo1和Ca-VtgC cDNA序列分析

克隆獲得Ca-VtgAo1cDNA序列(GenBank No.:MT409425)全長(zhǎng)共有4 241 bp，其中ORF為3 873 bp，編碼1 290個(gè)氨基酸殘基，5′UTR為192 bp，3′UTR為176 bp(圖1)。Ca-VtgCcDNA序列全長(zhǎng)共有4 207 bp (GenBank No.:MT409426)，其中ORF為3 612 bp，編碼1 203個(gè)氨基酸殘基，5′UTR為150 bp，3′UTR為445 bp(圖2)。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)Ca-VtgAo1和Ca-VtgC基因編碼蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分別為140.6 ku和134.8 ku，等電點(diǎn)分別為9.00和8.23。SignalP預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，Ca-VtgAo1和Ca-VtgC N端都不具有信號(hào)肽序列。SMART分析結(jié)果表明，二者具有LPD_N、DUF1943、DUF1944、LvH和LvL結(jié)構(gòu)域，但都不具有β′-C和CT結(jié)構(gòu)域。此外，Ca-VtgAo1具有Pv結(jié)構(gòu)域，且具有5個(gè)RXXR位點(diǎn)(RFSR、RTLR、RSSR、RAVR和RLER)(圖1、圖2)。

1—192堿基序列代表5′UTR，4 066—4 241堿基序列代表3′UTR，193—4 065堿基序列是ORF，*代表終止密碼子，下劃線部分代表多聚腺苷酸信號(hào)AATAAA和LPD_N，方框區(qū)域分別代表DUF1943、 DUF1944和蛋白質(zhì)水解酶切位點(diǎn)，加粗部分代表Pv多聚絲氨酸區(qū)域

1—150堿基序列代表5′UTR，151—3 762堿基序列是ORF，*代表終止密碼子，下劃線部分是LPD_N結(jié)構(gòu)域,方框區(qū)域代表 DUF1943和 DUF1944

2.2 Vtg同源比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化分析

BLASTX分析結(jié)果顯示，Ca-VtgAo1與鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)VtgB1同源性最高，達(dá)到88.62%，其次為鯉魚(yú)(C.carpio)Vtg、格氏魚(yú)(Anabariliusgrahami)Vtg、草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)Vtg1、黑頭呆魚(yú)(Pimephalespromelas)Vtg前體、鯪魚(yú)(Cirrhinusmolitorella)VtgB1，同源性分別為88.23%、83.93%、84.27%、83.32%、82.7%。Ca-VtgC與草魚(yú)(C.idella)VtgC同源性最高，達(dá)到87.82%，其次為稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)Vtg3、斑馬魚(yú)(Daniorerio)Vtg3、西藏高原鰍(Triplophysatibetana)Vtg，同源性都大于80%，分別為85.55%、82.04%、80.22%。使用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，Vtg主要分為兩大支，其中VtgAa和VtgAb、VtgAe和VtgAo分別先聚為一小支，之后這兩小支聚為一支，VtgC與VtgABCD聚為一支。Ca-VtgAo1首先與鯽魚(yú)VtgAo2聚為一支，再與其他物種VtgAo聚為一支。Ca-VtgC首先與斑馬魚(yú)VtgC聚為一支，再與其他物種VtgC聚為一支(圖3)。

圖3 鯽魚(yú)Ca-VtgAo1和Ca-VtgC與其他物種Vtg進(jìn)化分析

2.3 Ca-VtgAo1 mRNA在鯽魚(yú)不同組織中的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，在雌性鯽魚(yú)中，Ca-VtgAo1mRNA在所檢測(cè)的組織(腎臟、卵巢、肝臟、鰓、腸和心臟)中均有表達(dá)，其中在肝臟組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，在腸、鰓和卵巢中相對(duì)表達(dá)量較低，在腎臟和心臟中均有極微量的表達(dá)(圖4A)。與雌性鯽魚(yú)相同，在雄性鯽魚(yú)中，所檢測(cè)組織(腎臟、精巢、血液、鰓、肝臟和脾臟)中均有Ca-VtgAo1mRNA的表達(dá)，且在肝臟組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，但明顯低于其在雌性肝臟中的表達(dá)量，在雌性肝臟中的相對(duì)表達(dá)量是雄性的50倍，在腎臟和脾臟中幾乎不表達(dá)，但在精巢、血液和鰓中的相對(duì)表達(dá)量較高(血液>鰓>精巢)，血液與肝臟中Ca-VtgAo1mRNA相對(duì)表達(dá)量相近(圖4B)。

不同小寫(xiě)字母表示顯著性差異(P<0.05)

3 結(jié)論與討論

3.1 鯽魚(yú)Vtg基因序列及系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究運(yùn)用RACE PCR技術(shù)首次從鯽魚(yú)肝臟組織中克隆獲得2個(gè)Vtg cDNA全長(zhǎng)序列，生物信息學(xué)分析結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，二者都不具有β′-C和CT結(jié)構(gòu)域，且系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，二者分別與其他物種中VtgAo和VtgC亞型聚為一支，因此，分別命名為Ca-VtgAo1和Ca-VtgC基因。BLASTX 比對(duì)結(jié)果顯示，Ca-VtgAo1基因編碼的氨基酸序列與鯉魚(yú)VtgB1同源性最高，達(dá)到88.62%，Ca-VtgC基因編碼的氨基酸序列與草魚(yú)VtgC同源性最高，達(dá)到87.82%，表明本研究成功克隆鯽魚(yú)Ca-VtgAo1和Ca-VtgC全長(zhǎng)cDNA序列。Ca-VtgAo1具有富含多聚絲氨酸的Pv結(jié)構(gòu)域，而Ca-VtgC不具有該結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，Ca-VtgAo1與其他物種中的VtgAa、VtgAb、VtgAe和VtgAo亞型聚為一支。而Ca-VtgC先與其他魚(yú)類VtgC亞型聚為一支，再與尖端單鰭七鰓鰻VtgABCD聚為一支，表明由于Pv結(jié)構(gòu)域的存在使得Ca-VtgAo1進(jìn)化速度較Ca-VtgC快，VtgC是較古老的一種卵黃蛋白原亞型。此外，Ca-VtgAo1具有5個(gè)RXXR位點(diǎn)，不同Vtg剪切形式具有不同時(shí)空表達(dá)模式，可以介導(dǎo)不同的生物學(xué)功能。

3.2 鯽魚(yú)不同組織Ca-VtgAo1 mRNA表達(dá)差異分析

魚(yú)類中存在多種形式Vtg，由于Vtg結(jié)構(gòu)和功能的多樣性，不同Vtg亞型具有不同表達(dá)模式[30-32]。諸氏鯔蝦虎魚(yú)(Mugilogobiuschulae)Vtg-C在肝臟中的相對(duì)表達(dá)量最高，腸和脾只有微量表達(dá)，而在鰓、肌肉、腦和卵巢組織中未檢測(cè)到其表達(dá)[33]。劉春等[31]同樣發(fā)現(xiàn)，在劍尾魚(yú)中Vtg-C在肝臟中的相對(duì)表達(dá)量最高，在卵巢、脾和腎臟組織中微量表達(dá)，而在鰓、肌肉和腦組織中無(wú)表達(dá)。而對(duì)于Vtg-A，TONG等[33]在青鳉和斑馬魚(yú)中發(fā)現(xiàn)其只在肝臟中表達(dá)，而在其他組織中均未檢測(cè)到其表達(dá)。最新研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育至Ⅲ期的雌雄雙須骨舌魚(yú)(Osteoglossumbicirrhosum)中，Vtg在雌雄魚(yú)肝臟組織中的相對(duì)表達(dá)量都最高，在卵巢、精巢中表達(dá)量較少，在鰓、脾臟、腎臟、肌肉、心臟、頭腎和腦組織中均有極微量的表達(dá)[34]。與雙須骨舌魚(yú)一致，在古老的石紋電鰩(Torpedomarmorata)卵巢濾泡細(xì)胞中可以檢測(cè)到VtgmRNA和其編碼的蛋白質(zhì)[35]。由于在進(jìn)化出現(xiàn)硬骨魚(yú)類之前，鱘魚(yú)和軟骨魚(yú)是由鰭魚(yú)類分化形成的兩支，因此，卵巢表達(dá)Vtg是魚(yú)類較古老的一種特征。本研究在雌雄鯽魚(yú)肝臟和雌性卵巢組織中檢測(cè)到Ca-VtgAo1mRNA表達(dá)，且在肝臟組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，表明鯽魚(yú)中Vtg的合成以外源性肝臟組織合成為主，同時(shí)還保有古老的Vtg內(nèi)源性卵巢合成方式。與羅非魚(yú)(Oreochromismossambicus)中Vtg表達(dá)模式一致[36]，Ca-VtgAo1mRNA在雌雄鯽魚(yú)肝臟組織中的表達(dá)量具有顯著差異，其中在雌性肝臟中的相對(duì)表達(dá)量是雄性肝臟中的50倍，因此，對(duì)于性別外部形態(tài)特征不明顯的鯽魚(yú)，可以依據(jù)檢測(cè)肝臟組織中Ca-VtgAo1mRNA相對(duì)表達(dá)量的原理開(kāi)發(fā)方便快捷的檢測(cè)試劑盒來(lái)鑒定鯽魚(yú)性別，Ca-VtgAo1基因可以作為一種鑒定鯽魚(yú)性別的分子標(biāo)記。此外，Ca-VtgAo1mRNA在腸、鰓和血液中少量表達(dá)，表明其可能參與了鯽魚(yú)的免疫應(yīng)答過(guò)程。在穆雷彩虹魚(yú)(Melanotaeniafluviatilis)精巢組織中，Vtg主要分布于精細(xì)胞周圍的細(xì)胞間隙中，與輸精管周圍的結(jié)蹄組織相關(guān)[37]。在羅非魚(yú)中證明17β-雌二醇通過(guò)激活雌激素受體ERα促進(jìn)Vtg的合成，下調(diào)生長(zhǎng)激素(Growth hormone,GH)和類胰島素生長(zhǎng)因子(Insulin-like growth factors,IGF)通路[36]，表明精巢中Vtg的作用主要是參與精巢生長(zhǎng)抑制、精子-卵子及性別逆轉(zhuǎn)。Ca-VtgAo1mRNA在鯽魚(yú)精巢組織中少量表達(dá)，推測(cè)其可能也參與了鯽魚(yú)精巢生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控過(guò)程。