王 倩,于新新,董 明*

(1大連醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔內(nèi)科學(xué)教研室,大連 116044;2大連醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院;*通訊作者,E-mail:448148894@qq.com)

頭頸部癌(head neck cancer,HNC)是常見的惡性腫瘤,包括起源于鼻竇、鼻腔、口腔、咽、喉等部位的上皮性惡性腫瘤,占惡性腫瘤的6%,病理類型幾乎均為鱗癌[1,2]。作為全球第六大常見癌癥,頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)的最新發(fā)病病例超過30萬,全球死亡人數(shù)超過14萬[3]。口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔最常見的癌癥,占口腔癌的90%以上。盡管隨著醫(yī)療水平的提高,OSCC患者的生存質(zhì)量已顯著提高,但由于手術(shù)后局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,總體預(yù)后仍然較差[4,5]。現(xiàn)階段OSCC患者的治療方案幾乎都是基于腫瘤分期和潛在位置制定的,而對(duì)標(biāo)OSCC潛在生物學(xué)特性的治療方案卻較為鮮見[6],因此,從分子水平來了解OSCC進(jìn)展機(jī)制,檢測(cè)其生物標(biāo)志物,或可為OSCC的預(yù)防及治療提供新的思路和方向。CD147(cluster of differentiation 147)是一種隸屬于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白,也稱為細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子,其廣泛表達(dá)于多種組織中,并在諸多惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[7-9]。最近的研究表明CD147的過度表達(dá)與癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[10],此外CD147還與腫瘤抗藥性有關(guān)聯(lián)[11]。雖然有關(guān)CD147促進(jìn)腫瘤的分子機(jī)制已在某些癌癥中進(jìn)行了研究,但其在OSCC中的表達(dá)和具體作用機(jī)制仍不明確,本文旨在探討CD147是否參與OSCC發(fā)生以及在其發(fā)展中所起到的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 組織樣本采集及分組

本研究在2017年9月至2018年12月期間,于大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收集12例頭頸部鱗癌患者,取鱗癌(OSCC)組織及癌旁組織作為實(shí)驗(yàn)樣本。患者年齡為56-83歲,8例為男性,4例為女性。每個(gè)病例所采集到的樣本均需分為三部分進(jìn)行實(shí)驗(yàn),即CD147基因表達(dá)檢測(cè)、CD147蛋白的Western blot檢測(cè)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)。所有患者均已簽署知情同意,實(shí)驗(yàn)獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 免疫組化檢測(cè)CD147的表達(dá)

將組織切片依次靜置于無水二甲苯,無水乙醇,95%乙醇無水乙醇,85%乙醇無水乙,75%乙醇無水乙醇。在PBS中靜置5 min×3次,滴加山羊血清封閉液。孵育兔抗人CD147抗體(稀釋比1 ∶100),37 ℃室溫1 h,繼而孵育中山金橋SP9001二抗(稀釋比1 ∶100),37 ℃放置15 min,加DAB顯色劑,封片。將載玻片放置于顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取10個(gè)視野拍照并使用Image-J軟件分析統(tǒng)計(jì)。

1.4 Western blot檢測(cè)CD147的表達(dá)

將組織轉(zhuǎn)移至研缽中研磨成粉,加蛋白裂解液,持續(xù)研磨后移入1.5 ml EP管中,提取蛋白質(zhì),按照BCA法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。常規(guī)Western blot電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉后,孵育兔抗人CD147抗體(稀釋比1 ∶1 000),GAPDH抗體(稀釋比1 ∶2 000),4 ℃孵育過夜。繼而孵育山羊抗兔熒光二抗(稀釋比1 ∶500)1 h,使用Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System發(fā)光。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

凍存的人口腔鱗癌細(xì)胞UM-SCC6經(jīng)復(fù)蘇后,在DMEM培養(yǎng)基中37 ℃、5% CO2、濕度90%的條件下傳代培養(yǎng)。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染CD147-siRNA

將UM-SCC6細(xì)胞以103個(gè)每孔鋪于兩組1 ml的無血清無雙抗培養(yǎng)基中,按照說明書分別將CD147-siRNA及NC空載體加入兩組細(xì)胞及轉(zhuǎn)染試劑中,輕輕混勻后,室溫靜置15-20 min,37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育10 h左右,更換有血清及雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,所得兩組細(xì)胞分別命名為CD147-siRNA組及NC組。real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.7 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CD147對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染后24 h,分別將CD147-siRNA組及NC組細(xì)胞按照100 μl/103個(gè)每孔鋪于96孔板中培養(yǎng),每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔。按照實(shí)驗(yàn)時(shí)間,分別在24,48,72 h后,棄培養(yǎng)基,每孔加入100 μl無雙抗無血清的培養(yǎng)液和10 μl CCK-8試劑。孵箱培養(yǎng)2 h之后,酶標(biāo)儀測(cè)定OD450值。

1.8 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CD147對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖的影響

按照每皿含500個(gè)細(xì)胞的濃度接種5 ml細(xì)胞懸液到培養(yǎng)皿中,按照十字的方向輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿,使細(xì)胞能夠分散均勻。將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2周,當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí),加入結(jié)晶紫染液染色15 min,觀察染色的克隆數(shù)量。

1.9 Ki67實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CD147對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h,終止培養(yǎng)。用PBS沖洗1-2次,加入4%的多聚甲醛,室溫固定30 min。棄廢液,PBS洗5 min×3次。加入0.1%Triton-X100,室溫下靜置15 min。棄廢液,PBS洗5 min×3次。加入封閉液,室溫封閉30 min。棄封閉液,加入兔抗Ki67一抗(稀釋比1 ∶500),4 ℃過夜。吸出一抗,PBS洗10 min×3次。加入熒光標(biāo)記的山羊抗兔二抗(稀釋比1 ∶500),室溫避光放置1 h。棄二抗,PBS洗10 min×3次。加入DAPI,室溫孵育2 min。棄廢液,PBS洗10 min×3次。加入抗熒光淬滅封片劑封片,熒光顯微鏡下觀察并拍照,使用Image-J軟件檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)分析光密度值。

1.10 real-time qPCR檢測(cè)CD147基因的表達(dá)

表1 目的基因引物序列

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD147在人OSCC組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示,在OSCC組織和癌旁組織中均能檢測(cè)到CD147的表達(dá),但OSCC組織中CD147的陽性細(xì)胞數(shù)高于癌旁組織(見圖1)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,其平均光密度值分別是0.43±0.06和0.12±0.06,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CD147蛋白在OSCC組織的表達(dá)高于癌旁組織(P<0.05,見圖2),其表達(dá)量分別為1.27±0.15及0.60±0.15。real-time PCR結(jié)果顯示,癌旁組織和OSCC組織CD147基因的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.08及10.38±1.21,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。以上結(jié)果表明無論在蛋白水平還是基因水平,CD147在人口腔鱗癌中表達(dá)均呈增高趨勢(shì)。

圖1 免疫組化檢測(cè)CD147在人口腔鱗癌中的表達(dá)情況

與癌旁組織比較,*P<0.05

2.2 real-time PCR驗(yàn)證CD147-siRNA轉(zhuǎn)染情況

CD147-siRNA轉(zhuǎn)染24 h后,real-time PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率,結(jié)果顯示CD147-siRNA組中CD147轉(zhuǎn)染效率為60%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。

與NC組比較,*P<0.05

2.3 CD147對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示,干擾CD147表達(dá)后,UM-SCC6細(xì)胞的增殖能力受到抑制(P<0.05,見圖4A);集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,UM-SCC6細(xì)胞的集落形成數(shù)在干擾CD147的表達(dá)后呈減少趨勢(shì)(見圖4B)。Ki67實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,干擾CD147表達(dá)后,UM-SCC6細(xì)胞內(nèi)Ki67的表達(dá)量減少(見圖5);平均光密度值在CD147-siRNA組及NC組中分別為165.00±19.47及331.33±30.09,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。

圖4 CD147對(duì)人口腔鱗狀癌細(xì)胞UM-SCC6增殖的影響

圖5 Ki67實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CD147對(duì)人口腔鱗癌細(xì)胞增殖的影響

3 討論

口腔鱗癌是一種具有侵襲性的惡性腫瘤,它是由具有干細(xì)胞樣特征的再生癌細(xì)胞的一個(gè)獨(dú)特亞群驅(qū)動(dòng)形成的[12,13]。而這些多能的癌癥干細(xì)胞樣細(xì)胞能夠通過不斷的自我更新和分化來重建原發(fā)腫瘤的異質(zhì)性[14,15]。它們除了在原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)和維持中起到關(guān)鍵作用外,癌癥干細(xì)胞樣細(xì)胞還具有很強(qiáng)的逃避放療和常規(guī)化療的能力,繼而導(dǎo)致局部或遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)[16]。腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移擴(kuò)散是口腔鱗癌患者主要的致死原因,其主要擴(kuò)散途徑為頸淋巴轉(zhuǎn)移,而是否存在淋巴轉(zhuǎn)移也是決定患者能否長(zhǎng)期生存的關(guān)鍵。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,多種分子抑制劑已開始應(yīng)用于腫瘤的特異性治療,這種特異性治療可以減少放化療的副作用[17,18],有利于抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。

細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子CD147是一種細(xì)胞表面糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族。研究表明CD147在多類細(xì)胞中均有表達(dá),如造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞等。實(shí)際上CD147也參與調(diào)節(jié)人類正常代謝及疾病,尤其是癌癥的發(fā)生發(fā)展過程[19],例如調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡以及腫瘤細(xì)胞遷移、轉(zhuǎn)移和分化等。研究表明,CD147是以通過刺激基質(zhì)金屬蛋白酶和細(xì)胞因子的分泌等方式參與癌癥發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)[20,21]。亦有研究表明,CD147是肝癌的有效治療靶點(diǎn),并已在肝癌的臨床治療中取得了一定進(jìn)展[22]。那么CD147在口腔鱗癌中是否存在差異表達(dá),是否對(duì)腫瘤的增殖有影響,其能否成為監(jiān)測(cè)口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展和治療的作用靶點(diǎn),從而為完善口腔鱗癌患者治療方案提供新的方向是值得探討的。

本研究采用免疫組織化學(xué)及Western blot的方法對(duì)口腔鱗癌患者腫瘤組織及癌旁組織CD147蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)CD147在口腔鱗癌中的表達(dá)高于癌旁組織。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,CD147 mRNA在OSCC組織中的表達(dá)高于癌旁組織。上述結(jié)果表明CD147在OSCC中的蛋白水平及基因水平都高于癌旁組織,提示CD147或可成為OSCC的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)。

由于OSCC的一個(gè)重要特點(diǎn)為增殖能力強(qiáng),為了進(jìn)一步檢測(cè)CD147在OSCC中的作用,本研究通過干擾CD147,繼而檢測(cè)其對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞UM-SCC6增殖作用的影響。CCK-8實(shí)驗(yàn)、集落形成實(shí)驗(yàn)及Ki67三種檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明干擾CD147可以降低UM-SCC6細(xì)胞的增殖能力,說明CD147具有調(diào)節(jié)口腔鱗癌細(xì)胞增殖的能力。有關(guān)CD147在其他類型癌癥中作用的研究表明,CD147的下調(diào)可以抑制人惡性黑色素瘤細(xì)胞系的增殖[23];過表達(dá)CD147 cDNA轉(zhuǎn)染入人類MDA-MB436乳腺癌細(xì)胞可以導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)增強(qiáng)和轉(zhuǎn)移性增加從而增加患者的發(fā)病率,其原因可能是CD147可以提高基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9的表達(dá)造成的[24]。也有報(bào)道指出通過RNAi沉默CD147可以抑制人胃癌的增殖和侵襲,并且可以增加其對(duì)抗腫瘤藥物順鉑的化學(xué)敏感性[25]?？梢奀D147可以促進(jìn)諸多腫瘤細(xì)胞的增殖,口腔鱗狀細(xì)胞癌中亦有此特征,提示CD147或可為OSCC的治療靶點(diǎn),可為OSCC的綜合治療方案提供新的方向。

本研究初步驗(yàn)證了CD147在口腔鱗狀細(xì)胞癌中呈高表達(dá)狀態(tài),并可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖。然而CD147所參與的對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)往往是一個(gè)多因子共同作用的復(fù)雜過程。在這個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中,CD147的具體作用機(jī)制以及參與方式如何均需要進(jìn)一步的研究和探討。