正交法優(yōu)化產(chǎn)甲烷混合菌超低溫保護(hù)劑

譚凱麗，趙 晗

（1.煤與煤層氣共采國家重點實驗室，山西 晉城 048000；2.易安藍(lán)焰煤與煤層氣共采技術(shù)有限責(zé)任公司，山西 晉城 048000）

近年來，煤炭生物轉(zhuǎn)化技術(shù)逐漸受到重視，國內(nèi)外諸多學(xué)者陸續(xù)開展了煤炭生物成氣的相關(guān)研究[1-3]，并在實驗室條件下以煤為底物，通過接種高效產(chǎn)甲烷混合菌群進(jìn)行模擬成氣實驗，獲得良好的產(chǎn)甲烷效果[4-5]。在實驗室環(huán)境下進(jìn)行煤炭生物氣化實驗時，菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、產(chǎn)甲烷效果良好的混合菌對煤炭生物氣化實驗起著關(guān)鍵作用[6]。目前，微生物菌種的保藏多為單菌種的保藏，關(guān)于混合菌群的保藏鮮見報道。而根據(jù)經(jīng)典厭氧發(fā)酵理論[7-8]，參與到產(chǎn)甲烷氣過程中的微生物主要為水解發(fā)酵型細(xì)菌、產(chǎn)氫產(chǎn)酸菌及產(chǎn)甲烷菌，這些混合菌共同作用于煤基質(zhì)而產(chǎn)生生物煤層氣。曾有學(xué)者對山西寺河礦區(qū)121 煤層氣井產(chǎn)出水樣中的菌群進(jìn)行保藏實驗，得出菌群保藏的最佳條件為25 ℃下的煤基-基礎(chǔ)鹽配方，此方法保藏的產(chǎn)甲烷菌群能長期維持在較高的活性狀態(tài)，保持較好的產(chǎn)甲烷能力[9]。

微生物菌種保藏方法很多，冷凍干燥保存法和冷凍保存法是目前公認(rèn)的長期保存微生物菌種的最安全、可靠的方法。其中冷凍保存法中的液氮超低溫保存法適用范圍廣，可用于大多數(shù)微生物，特別是不適合用冷凍干燥保存法保存的微生物，因此該方法已經(jīng)成為長期保存微生物菌種的最佳方法[10]。許多研究表明[11]，在低溫保藏細(xì)胞和組織時，添加保護(hù)劑比不添加保護(hù)劑的保藏效果更好。適當(dāng)濃度的保護(hù)劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)可避免細(xì)胞膜冷凍損傷，添加了保護(hù)劑的菌種冷凍后，可以保持較高的存活率[12]。

海藻糖、甘油、二甲基亞砜作為常用的保護(hù)劑，在低溫生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛使用[13]。根據(jù)保護(hù)劑在深低溫保存中的作用可以分為兩大類：滲透性和非滲透性保護(hù)劑。其中二甲基亞砜和甘油為滲透性保護(hù)劑，海藻糖為非滲透性保護(hù)劑。滲透性保護(hù)劑多屬于低分子中性物質(zhì)，在溶液中優(yōu)先同水分子相結(jié)合，增加溶液的黏性，弱化水的結(jié)晶過程，達(dá)到保護(hù)的目的。非滲透性保護(hù)劑通常分子量較小，能溶于水，但不能進(jìn)入細(xì)胞，在降溫時主要與滲透性保護(hù)劑聯(lián)合使用，促使細(xì)胞完成脫水，同時還具有中和滲透性保護(hù)劑毒性的作用。

本文采用正交實驗設(shè)計法，選用L9（34）正交表，以產(chǎn)甲烷混合菌群為實驗對象，海藻糖、甘油和二甲基亞砜作為保護(hù)劑，優(yōu)化了超低溫保藏產(chǎn)甲烷混合菌群保護(hù)劑配比。

1 實 驗

1.1 實驗材料

菌種來源于山西沁水某煤層氣井，通過收集煤層氣井口排采水獲得含有產(chǎn)甲烷菌群水樣，將水樣裝入?yún)捬跗亢?，放入冰塊帶回實驗室。采集來的水樣添加產(chǎn)甲烷培養(yǎng)基和無煙煤煤塊后放入200 L 厭氧發(fā)酵罐中，在35 ℃富集培養(yǎng)，定期排掉菌液后添加同等體積新鮮培養(yǎng)基[14]。保藏實驗進(jìn)行前，菌液在發(fā)酵罐內(nèi)穩(wěn)定產(chǎn)氣，甲烷體積分?jǐn)?shù)維持在15%左右。

培養(yǎng)基采用無菌無氧產(chǎn)甲烷培養(yǎng)基：在1 L 去離子水中，依次加入磷酸二氫鉀1.5 g、磷酸氫二鉀2.9 g、氯化銨0.4 g、氯化鎂1.8 g 和酵母抽提物2.0 g，在電爐上加熱至沸騰，冷卻后加入半胱氨酸，調(diào)節(jié)pH 值至7，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%刃天青，裝上定量分液器后通氮氣，加熱培養(yǎng)基至沸騰、無色，在微沸狀態(tài)下煮15 min～30 min，在通氮氣的情況下冷卻，定量分裝到厭氧瓶內(nèi)，用鋁蓋封口后高溫滅菌備用。

保護(hù)劑：海藻糖、甘油、二甲基亞砜。

1.2 實驗方法

1.2.1 正交實驗設(shè)計

為得到最佳產(chǎn)甲烷混合菌群保護(hù)劑配比，以海藻糖、甘油、二甲基亞砜作為研究對象，選用L9（34）正交表進(jìn)行正交實驗，因素水平表見表1。

表1 因素水平%

1.2.2 產(chǎn)甲烷混合菌的培養(yǎng)及收集

實驗進(jìn)行前，將發(fā)酵罐內(nèi)50 mL 混合菌液接入250 mL無菌無氧的產(chǎn)甲烷培養(yǎng)基內(nèi)混合均勻，于500 mL 厭氧瓶中35 ℃恒溫培養(yǎng)。產(chǎn)甲烷混合菌的生長情況以600 nm 處的光密度值（OD600）評價。定期檢測轉(zhuǎn)接菌液實驗組及空白對照組OD600值。產(chǎn)甲烷混合菌轉(zhuǎn)接后OD600值變化圖見圖1。由圖1 可知，菌液轉(zhuǎn)接至500 mL厭氧瓶24 h 后，OD600值有下降趨勢，因此，產(chǎn)甲烷混合菌在接種24 h 后，進(jìn)行產(chǎn)甲烷混合菌的保藏實驗。

圖1 產(chǎn)甲烷混合菌轉(zhuǎn)接后OD600 值變化圖

1.2.3 產(chǎn)甲烷混合菌的保藏實驗

按照實驗設(shè)計進(jìn)行正交實驗，將培養(yǎng)24 h 的混合菌液置入?yún)捬豕ぷ髡荆ㄓ鳧WS DG1000）中，通過注射器接入事先通氮氣除氧的離心管，擰緊瓶蓋后10 000 r/min 離心20 min，再次放入?yún)捬豕ぷ髡局?，棄上清液，按照相?yīng)濃度加入保護(hù)劑后放入耐低溫凍存管，進(jìn)行液氮超低溫保藏。

1.2.4 存活率的測定

將存有產(chǎn)甲烷混合菌的凍存管在液氮中保藏48 h后，室溫下靜置2 h，用血球計數(shù)板計數(shù)并計算存活率，存活率計算公式見式（1）：

1.2.5 產(chǎn)甲烷濃度測定

將計數(shù)后菌液按照組別，以體積比1∶5 接入無菌無氧培養(yǎng)基中，35 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d 后測定甲烷體積分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 因素指標(biāo)分析

正交設(shè)計及數(shù)據(jù)和正交實驗結(jié)果分別見表2、表3。

表2 正交設(shè)計及數(shù)據(jù)

表3 正交實驗結(jié)果

從表3 實驗結(jié)果可知：對于存活率，因素主次關(guān)系為甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞二甲基亞砜質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，保護(hù)劑最佳組合為質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%甘油+ 質(zhì)量分?jǐn)?shù) 7%二甲基亞砜 + 質(zhì)量分?jǐn)?shù) 10%海藻糖（B2C2A1）。對于產(chǎn)甲烷體積分?jǐn)?shù)，因素主次關(guān)系為二甲基亞砜質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，保護(hù)劑最佳組合為質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%二甲基亞砜+ 質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%甘油+質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%海藻糖（C3B1A1）。

這是因為煤的厭氧生物降解需要不同代謝功能的多種微生物菌群相互配合來完成，在進(jìn)行冷凍保藏的過程中，不同的菌群對于低溫、氧氣的適應(yīng)性也不盡相同，產(chǎn)甲烷菌為一種嚴(yán)格的專性厭氧微生物，對氧氣敏感度較高，而其他微生物均為兼性厭氧微生物，可承受一定濃度范圍的氧氣。有研究表明[15]，作為保護(hù)劑，甘油對特定類型細(xì)胞非常有效，而二甲基亞砜使用更為廣泛，對所有的細(xì)胞類型都很有效。但本實驗結(jié)果顯示，甘油保護(hù)劑的添加，對整體菌群存活率有所提高，二甲基亞砜則更利于產(chǎn)甲烷菌的存活。

2.2 方差分析

冷凍保護(hù)劑方差分析結(jié)果見表4 和表5。表4 和表5 表明，3 種保護(hù)劑對冷凍存活率及產(chǎn)甲烷的影響均不顯著。

表4 冷凍保護(hù)劑方差分析結(jié)果（存活率）

表5 冷凍保護(hù)劑方差分析結(jié)果（甲烷體積分?jǐn)?shù)）

2.3 最優(yōu)化結(jié)果驗證

以產(chǎn)甲烷體積分?jǐn)?shù)作為最終參考指標(biāo)，進(jìn)行驗證實驗，結(jié)果見表6。

表6 驗證實驗結(jié)果

以C3B1A1（質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%二甲基亞砜+ 質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%甘油+ 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%海藻糖）為產(chǎn)甲烷混合菌保護(hù)劑，進(jìn)行低溫冷凍保藏，活化后其產(chǎn)甲烷體積分?jǐn)?shù)達(dá)到了13.05%。

3 結(jié) 論

添加了保護(hù)劑的實驗組經(jīng)液氮超低溫保藏后，其產(chǎn)甲烷能力優(yōu)于不添加任何保護(hù)劑的實驗組。產(chǎn)甲烷混合菌未加保護(hù)劑實驗組在直接冷凍的情況下，其存活率為13.04%，且產(chǎn)氣實驗后甲烷體積分?jǐn)?shù)偏低；而添加了保護(hù)劑的實驗組其存活率為39.13%，并且產(chǎn)氣實驗后甲烷體積分?jǐn)?shù)相對較高（13.05%），是不添加保護(hù)劑的對照組（0.41%）的32 倍。