方慧祥 崔慶德 呂 晉

云南省曲靖市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，云南 曲靖 655000

益腎靈顆粒為中國藥典[1]收載品種，由枸杞子、女貞子、附子(制)、芡實(shí)(炒)、車前子(炒)、補(bǔ)骨脂(炒)、覆盆子、五味子、桑椹、沙苑子、韭菜子(炒)、淫羊藿、金櫻子十三味中藥材組成。益腎靈顆粒具有溫陽補(bǔ)腎之功效，用于腎氣虧虛、陽氣不足所致的陽痿、早泄、遺精或弱精癥。淫羊藿和補(bǔ)骨脂均為方中君藥，女貞子為方中臣藥，現(xiàn)代藥理研究表明，女貞子有促進(jìn)生長[2]、增強(qiáng)體質(zhì)[3]、強(qiáng)心[4]等作用；補(bǔ)骨脂有抗腫瘤[5]、抗骨質(zhì)疏松[6]、抗氧化[7]等作用；淫羊藿有促進(jìn)生殖[8]、提高免疫[9]、增加骨密度[10]、抗腫瘤[11]等作用。特女貞苷為女貞子的主要成分，具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗衰老等作用，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素為補(bǔ)骨脂的主要成分，具有植物雌激素作用；淫羊藿苷為淫羊藿的主要成分，具有滋陰補(bǔ)陽、促進(jìn)造骨細(xì)胞增殖等作用，中國藥典[1]選擇特女貞苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素、淫羊藿苷分別作為女貞子、補(bǔ)骨脂、淫羊藿三種藥材的含量測(cè)定指標(biāo)。有文獻(xiàn)[12]報(bào)道HPLC法同時(shí)測(cè)定益腎靈顆粒中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和淫羊藿苷的含量，但同時(shí)測(cè)定君藥淫羊藿和補(bǔ)骨脂以及臣藥女貞子中淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和特女貞苷的含量未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)參考中國藥典[1]及相關(guān)文獻(xiàn)[12-18]，建立HPLC切換波長法同時(shí)測(cè)定益腎靈顆粒(無蔗糖)中特女貞苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和淫羊藿苷的含量方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20AT型高效液相色譜儀(配有LC-20AT型輸液泵，CBM-20A型控制器， SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-10AS vp型柱溫箱，SPD-20A型紫外檢測(cè)器，DGU-20A5型脫氣機(jī)，LCsolution色譜工作站)(日本島津制作所)，XS105型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 材料 特女貞苷對(duì)照品(批號(hào):111926-201605，含量：93.3%)，補(bǔ)骨脂素對(duì)照品(批號(hào):110739-201617，含量：99.7%)，異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品(批號(hào):110738-201614，含量：99.9%)，淫羊藿苷對(duì)照品(批號(hào):110737-201516，含量：94.2%)，均購置于中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純(德國默克公司)；水為雙蒸水；其余試劑均為分析純；益腎靈顆粒(無蔗糖)(福建省泉州恒達(dá)制藥有限公司，批號(hào): 20150409、20160324、20160913)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：依利特 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為30 ℃；流動(dòng)相：甲醇(A) -乙腈(B)-水(C),梯度洗脫(25%A始終保持不變；0～35 min，7% B→19% B,35～50 min，19% B→19% B,50.01～60 min，7% B→7% B)；流速為1.0 mL·min-1； 檢測(cè)波長：0～20 min，224 nm(特女貞苷)；20～35 min，246 nm(補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素)；35～60 min，270 nm(淫羊藿苷)；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 樣品制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取特女貞苷、淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品22.78 mg、66.75 mg 、12.01 mg、12.64 mg置 50 mL 容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液(質(zhì)量濃度: 特女貞苷為0.4251 mg·mL-1，淫羊藿苷為 1.2576 mg·mL-1，補(bǔ)骨脂素為0.239 5 mg·mL-1，異補(bǔ)骨脂素為0.2525 mg·mL-1)，精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品使用液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取益腎靈顆粒(無蔗糖)5袋，精密稱定，研細(xì)，取約5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，稱定重量，置水浴上回流1 h，放冷，再稱定重量，用60%乙醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，靜置，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例及工藝，分別制得缺女貞子、缺補(bǔ)骨脂、缺淫羊藿的陰性對(duì)照，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL, 分別置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得。分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。以進(jìn)樣量(x,μg)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,分別得特女貞苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和淫羊藿苷回歸方程為y=1268121.8x+250.4，r=0.9997(n=7);y=7680626.9x+1180.9，r=0.9999(n=7);y=7581018.9x+4347.4，r=0.9999(n=7);和y=2297168.2x+1699.7，r=1.0000(n=7)。結(jié)果表明，特女貞苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和淫羊藿苷的進(jìn)樣量分別在0.03401～0.8501 μg、0.01916～0.4790 μg、0.02020～0.5051 μg、和0.1006～2.5151 μg的范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系?；旌蠈?duì)照品、供試品及陰性對(duì)照的色譜圖如圖1所示。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜濾過的供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，特女貞苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.74%、0.56%、0.58%和0.43%。表明儀器精密度良好。

2.3.3 空白試驗(yàn) 吸取“2.2.3”項(xiàng)下的陰性對(duì)照溶液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，結(jié)果顯示，陰性對(duì)照在與對(duì)照品和供試品色譜峰保留時(shí)間相應(yīng)位置上，沒有相應(yīng)的色譜峰，表明陰性對(duì)照不干擾測(cè)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)：20160324)6份，按“2.2.2”項(xiàng)下制備，測(cè)定特女貞苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和淫羊藿苷的含量，其含量的RSD分別為0.75%、0.86%、0.79%和0.60%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下制備好的同一份樣品，分別在0、2、4、8、16、24、36 h進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。結(jié)果，特女貞苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.96%、0.69%、0.73%和0.55%，表明樣品在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的益腎靈顆粒(無蔗糖)(批號(hào)：20160324)6份，每份約3 g，精密稱定，精密加入“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，再精密加入60%乙醇49 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下操作。測(cè)得加樣回收率見表1。

2.3.7 樣品測(cè)定結(jié)果 分別取3批益腎靈顆粒(無蔗糖)，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定含量。結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

續(xù)表1

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果 (mg/g， n=3)

3 討論

3.1 提取方法的選擇 參考中國藥典[1]及相關(guān)文獻(xiàn)[12-15]，以提取溶劑(甲醇和乙醇)、提取溶劑濃度(40%、60%、80%、100%)、提取方法(超聲和回流)、提取時(shí)間(20 min、40 min、60 min、80 min)為試驗(yàn)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)用60%的乙醇回流提取1 h效果最好。從而確定用60%的乙醇回流提取1 h為本試驗(yàn)的提取方法。

3.2 檢測(cè)波長的選擇 分別取特女貞苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和淫羊藿苷對(duì)照品溶液在200～500 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，特女貞苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和淫羊藿苷分別在224 nm、246 nm、246 nm和270 nm處有最大吸收。為簡化方法，參考中國藥典[1]及文獻(xiàn)[12-13,17-18]使用的檢測(cè)波長，進(jìn)行單波長同時(shí)檢測(cè)以上四個(gè)成分，當(dāng)用224 nm波長時(shí)，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和淫羊藿苷響應(yīng)值偏低，當(dāng)用246 nm時(shí)，特女貞苷和淫羊藿苷響應(yīng)值偏低，當(dāng)用270 nm時(shí)，特女貞苷、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素響應(yīng)值偏低，不利于定量測(cè)定，故最終定為切換波長法進(jìn)行測(cè)定。

3.3 流動(dòng)相的選擇 曾嘗試用甲醇-水系統(tǒng)或乙腈-水系統(tǒng)進(jìn)行分離，當(dāng)采用甲醇-水系統(tǒng)時(shí)異補(bǔ)骨脂素的保留時(shí)間與淫羊藿苷的保留時(shí)間相差太遠(yuǎn)，浪費(fèi)分析時(shí)間，當(dāng)采用乙腈-水系統(tǒng)時(shí)異補(bǔ)骨脂素的保留時(shí)間與淫羊藿苷的保留時(shí)間相差太近，不利于切換波長，最后采用甲醇-乙腈-水系統(tǒng)得到良好效果，因此本試實(shí)驗(yàn)最終將流動(dòng)相甲醇-乙腈-水進(jìn)行梯度洗脫。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究[19-20]發(fā)現(xiàn)，益腎靈顆粒對(duì)改善少、弱精男性的精液質(zhì)量有較好的臨床療效。益腎靈顆粒中淫羊藿為補(bǔ)腎壯陽之要藥，具有補(bǔ)腎陽的功效，補(bǔ)骨脂具有溫腎助陽的功效，女貞子具有滋補(bǔ)肝腎的功效。中成藥的臨床療效是來自組方中各味中藥的綜合作用，為保證臨床療效，同時(shí)控制多味中藥質(zhì)量顯得尤為重要。本方法能同時(shí)測(cè)定益腎靈顆粒(無蔗糖)中特女貞苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和淫羊藿苷的含量，對(duì)保證益腎靈顆粒臨床療效發(fā)揮積極作用。