程潔胡韻陸軍王章桂

(1. 安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽 淮南 232001；2. 安徽省第二人民醫(yī)院，安徽 合肥 230001)

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是東亞地區(qū)的常見腫瘤，從全世界范圍來看其發(fā)病率和死亡率居高不下(分別排第四位和第三位)[1]。由于肝癌自身的病因?qū)W發(fā)展影響因素眾多，因此HCC 是目前醫(yī)學(xué)上治療的難點(diǎn)，也是研究的重點(diǎn)領(lǐng)域[2]。小分子藥物索拉非尼、樂伐替尼均獲批于晚期肝癌的一線治療，但是其有效時(shí)間短(中位無進(jìn)展生存時(shí)間分別為2.7個(gè)月和7.4個(gè)月)、價(jià)格昂貴、可及性、不良反應(yīng)等問題阻礙了其臨床應(yīng)用[3-4]。阿帕替尼是一種口服的靶向藥物，主要的作用靶點(diǎn)是血管內(nèi)皮生長因子受體2。根據(jù)Ⅲ期研究結(jié)果，國家藥品監(jiān)督管理局(National Medical Products Administration，NMPA)批準(zhǔn)阿帕替尼用于接受過兩種化療方案后的晚期胃癌患者的治療，在一項(xiàng)針對進(jìn)展期胃癌的研究中也已經(jīng)觀察到顯著的臨床療效[5-6]。臨床研究表明，阿帕替尼二線治療晚期肝癌表現(xiàn)出一定的臨床療效[7]。本研究試圖探討阿帕替尼體外對人肝癌細(xì)胞株HepG2的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 主要材料包括：HepG2細(xì)胞、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、MTS、Annexin V -FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天C1062M)、Bax(CST，14796S)、Bcl-2(CST，3498S)、Cleaved-Caspase-3(CST，9661s)、VEGFR-2(CST，9698s)、GAPDH(CST，2118S)和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(CST，A0208)、ECL發(fā)光試劑盒分別來源于中科院上海細(xì)胞庫、杭州四季青、上海碧云天和Cell Signal Technology等公司；阿帕替尼 (Apatinib)由恒瑞醫(yī)藥公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 阿帕替尼溶液配制及分組 阿帕替尼分子量為639。將阿帕替尼10 mg溶于1 ml二甲基亞砜(DMSO)中，配制成濃度為20 mmol/L的母液，儲(chǔ)存于-80℃冰箱。使用時(shí)，用1%的FBS進(jìn)行梯度稀釋至指定濃度(0 μmol/L、1.25 μmol/L、 2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L) 。分組：0 μmol/L濃度組、1.25 μmol/L濃度組、2.5 μmol/L濃度組、5 μmol/L濃度組、10 μmol/L濃度組、空白對照組(只含有培養(yǎng)基而無細(xì)胞)、陰性對照組(加入0.4%的DMSO)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞HepG2常規(guī)培養(yǎng)。將肝癌細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中。然后置于CO2濃度為5%，溫度為37℃的培養(yǎng)箱中。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測[8]同我們前期檢測方法類似，采用MTS法。實(shí)驗(yàn)步驟概述如下：①選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞于96孔板中，使得細(xì)胞數(shù)約為1×104個(gè)/毫升；②給予一定濃度的阿帕替尼處理后過夜；③處理指定時(shí)間(24 h、48 h和72 h)后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)說明書加入MTS檢測試劑；④將分光光度計(jì)波長設(shè)為490 nm，上機(jī)檢測OD值，每隔15 min再測1次，反復(fù)3次。抑制率(inhibitor rate，IR)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/細(xì)胞組A值)×100%。數(shù)據(jù)結(jié)果導(dǎo)入GraphPad，制作增殖曲線，計(jì)算抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 將HepG2細(xì)胞接種于6孔板，使得每孔細(xì)胞數(shù)約為3×105個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后，加入10 μmol/L濃度的阿帕替尼培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h后，按照說明提前配制試劑，然后采用漂洗、消化、離心等步驟，將細(xì)胞收集至15 ml 離心管，分別加入指定試劑后避光保存，流式細(xì)胞儀檢測。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.5 免疫印跡分析 將細(xì)胞移植至6孔板中，過夜后加入阿帕替尼，濃度為0 μmol/L、1.25 μmol/L、 2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L。 48 h后按操作說明收集蛋白。蛋白定量采用BCA法；后續(xù)步驟按SDS PAGE電泳說明進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉；前述步驟完成后分別將目標(biāo)抗體Caspase-3(1∶400)、VEGFR(1∶200)、Bcl-2(1∶200)、Bax(1∶200)、GAPDH(1∶1000)加入。過夜后再加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶1000)，采用 ECL發(fā)光試劑上機(jī)顯像，保存文件。

2 結(jié)果

2.1 阿帕替尼抑制肝癌細(xì)胞增殖 MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HepG2細(xì)胞在阿帕替尼處理后的增殖受到明顯的抑制。HepG2細(xì)胞在多種阿帕替尼濃度(0 μmol/L、1.25 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)下均表現(xiàn)出一定的被抑制作用；阿帕替尼處理72 h后的抑制率分別為：0%、(17.25±0.34)%、(32.42±5.25)%、(52.13±7.31)%、(65.48±9.02)%，同不加阿帕替尼藥物的陰性對照組(不含藥物，僅給予0.4% DMSO) 相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。半數(shù)抑制濃度為(5.36±0.27) μmol/L。這表明阿帕替尼具有抑制肝癌細(xì)胞增殖作用，這種抑制作用與濃度和時(shí)間呈劑量依賴性，見圖1。

2.2 阿帕替尼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡 為了檢測阿帕替尼抑制肝癌細(xì)胞增殖是否與凋亡相關(guān)，分別采用流式細(xì)胞儀檢測凋亡率，Western blot檢測天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)為：阿帕替尼在10 μmol/L時(shí)，HepG2細(xì)胞的凋亡率為(44.37±3.48)%，而對照組為(8.42±0.31)%。Western blot結(jié)果表明阿帕替尼作用于HepG2細(xì)胞48 h后，Cleaved-Caspase-3表達(dá)上調(diào)，這些結(jié)果表明阿帕替尼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，見圖2。

圖1 不同濃度阿帕替尼對HepG2細(xì)胞增殖的影響

注：A為FCM檢測凋亡率；B為Western blot檢測Caspase-3表達(dá)。

2.3 阿帕替尼誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制 Western blot結(jié)果表明阿帕替尼給藥48 h后，HepG2細(xì)胞中VEGFR、Bcl-2的表達(dá)在高劑量時(shí)下降最為明顯；相反，Bax的表達(dá)在高劑量時(shí)最為明顯，隨著阿帕替尼的藥物濃度的升高其表達(dá)逐步增加(見圖3A)；蛋白定量表明在GAPDH表達(dá)穩(wěn)定的情況下，VEGFR-2、Bcl-2表現(xiàn)出逐步的降低，而Bax表現(xiàn)出逐步的升高(見圖3B)。

3 討論

晚期肝癌目前的主要治療策略是經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)聯(lián)合索拉非尼或索拉非尼或樂伐替尼單藥口服。Atezolizumab是一種以PD-L1為靶點(diǎn)的免疫檢查點(diǎn)抑制劑，聯(lián)合抗血管生成藥物貝伐單抗已經(jīng)被批準(zhǔn)用于晚期肝癌的一線治療[9]。其作用機(jī)制可能在于抗血管生成從而改善了腫瘤微環(huán)境，使得免疫治療藥物更容易進(jìn)入肝癌細(xì)胞而發(fā)揮作用。阿帕替尼主要作用靶點(diǎn)是VEGFR-2胞內(nèi)段的酪氨酸激酶區(qū)域，除了批準(zhǔn)用于胃癌治療外，目前已經(jīng)獲批用于一線治療后進(jìn)展的晚期肝癌的二線治療。臨床前研究表明阿帕替尼在包括肝癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤中表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性和可耐受的毒性反應(yīng)[10-11]，但是其具體作用機(jī)制還不清楚。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為靶向藥物主要是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生長過程中的信號通路，從而抑制細(xì)胞增殖作用。本研究發(fā)現(xiàn)阿帕替尼可以顯著地抑制肝癌細(xì)胞的增殖，這種增殖抑制作用在高劑量時(shí)最為明顯。這與臨床上觀察到的現(xiàn)象相一致，也就是患者在接受阿帕替尼治療后表現(xiàn)為腫塊的快速退縮，并且療效與劑量相關(guān)[12]。

注：A為Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)；B為Image J軟件濃度分析。

惡性腫瘤的死亡方式包括凋亡、自噬、鐵死亡等。誘導(dǎo)凋亡是傳統(tǒng)中藥、分子靶向治療藥物、micoRNA等作用于肝癌細(xì)胞的方式之一[13-14]。細(xì)胞凋亡可以分為受體依賴性凋亡和非受體依賴性凋亡，其中Caspase活性是檢測細(xì)胞凋亡的重要手段，Caspase-3活化后導(dǎo)致線粒體細(xì)胞色素C釋放。在本研究中觀察到阿帕替尼高劑量組凋亡率達(dá)到了(44.37±3.48)%，進(jìn)一步采用免疫印跡也證實(shí)了這一結(jié)果，免疫印跡表明活化的Caspase-3表達(dá)在高劑量組表達(dá)最為顯著，這些結(jié)果表明阿帕替尼誘導(dǎo)凋亡。本課題組一直從事凋亡、自噬、鐵死亡研究，雖然阿帕替尼誘導(dǎo)凋亡，但是自噬、鐵死亡等死亡方式是否參與了這一過程以及在這一過程中的具體作用還有待進(jìn)一步觀察。

Liao JB等[15]報(bào)道在肝癌的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中阿帕替尼通過抑制PI3K/Akt通路而發(fā)揮放療增敏作用。本研究中發(fā)現(xiàn)，阿帕替尼可以抑制VEGFR-2的表達(dá)，其抑制作用在高劑量時(shí)最為顯著；與VEGFR-2表達(dá)相一致的是凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)降低，在高劑量組最為明顯；而Bax的表達(dá)隨著阿帕替尼濃度的增加而升高；這些結(jié)果表明與Cleaved-caspase-3表達(dá)相一致；盡管臨床前研究表明[16]阿帕替尼主要的作用靶點(diǎn)是VEGFR-2，本研究也證實(shí)阿帕替尼抑制VEGFR-2的表達(dá)，但是阿帕替尼是否通過抑制下游PI3K/Akt、Mek/Erk等信號通路而抑制Bcl-2和促進(jìn)Bax表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡還并不清楚。在后續(xù)研究中，我們需要通過上調(diào)或下調(diào)VEGFR-2的表達(dá)后再觀察凋亡相關(guān)分子的表達(dá)情況。

阿帕替尼是一種新的分子靶向治療藥物，其作用機(jī)制目前還不清楚，深入理解其作用機(jī)制有助于臨床選擇優(yōu)勢人群，并為可能的耐藥尋找新的治療策略?？傊?，本研究表明抗血管生成藥物阿帕替尼在體外可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，這種作用與劑量濃度有關(guān)，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)VEGFR-2、Bcl-2、Bax表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步的功能分析和聯(lián)合免疫治療藥物的作用及機(jī)制正在研究中。