徐文剛，劉立明，唐永政，王九龍，于文松，征矢野清，鄒華鋒

（1.煙臺大學海洋學院，山東煙臺 264005；2.煙臺市海洋經濟研究院，山東煙臺 264003；3.長崎大學環(huán)東シナ海環(huán)境資源研究センター，日本長崎 851-2213；4.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，水產種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306）

石斑魚（Epinephelus）隸屬于鱸形目（Perciformes），鮨科（Serranidae），石斑魚亞科（Epinephelinae），廣泛分布在中國、日本、韓國以及其他亞洲國家的溫帶和熱帶海域，因其高品質的魚肉和較高的商業(yè)價值而被認為是重要的海洋經濟魚類之一［1-2］。石斑魚的人工養(yǎng)殖主要集中在我國廣東、海南和福建，其產量逐年增加并在2018年達到13.15萬t［3］。目前國內有關石斑魚養(yǎng)殖生物學的研究報道主要集中在雜交試驗［4-6］、環(huán)境脅迫［7］、營養(yǎng)成分分析［8］以及形態(tài)發(fā)育［9］等方面，有關其體長、年齡與性成熟、性逆轉以及內分泌激素之間聯系的研究較少報道。

硬骨魚類的生活史包含生長、發(fā)育、成熟和繁殖階段，其中性成熟受到內分泌激素的調節(jié)和體長、年齡以及與繁殖相關環(huán)境因子的綜合影響。大量研究表明，魚類性成熟的開始與體長和年齡因素相關。日本學者OKUZAWA［10］認為，魚類初次性成熟與體長密切相關，當魚類生長規(guī)格達到或超過性成熟所需要的最小體長時，即可視為初次成熟的開始，之后個體中成熟比例隨著體長的增加而增加。對竹?魚（Trachurus japonicus）的研究［11］表明，當其叉長超過19～23 cm的生物學最小形時即達到成熟。也有研究表明，魚類初次性成熟與年齡密切相關，澳大利亞的墨瑞鱈（Maccullochella peelii peelii）在4齡后才達到性成熟［12-13］；而牙鲆（Paralichthys olivaceus）雌魚隨著體長和年齡的增加其成熟率也逐漸提高［14］。然而有關石斑魚初次性成熟與體長和年齡關系的研究僅在赤點石斑魚（Epinephelus akaara）［15］和黑邊石斑魚（E.fasciatus）［16］中有少量報道。

黑邊石斑魚廣泛分布于我國南海［2］以及印度洋和太平洋［16-17］，是一種棲息于熱帶和亞熱帶地區(qū)的中小型石斑魚類，其味道鮮美，具有很高的商業(yè)價值，是東亞地區(qū)重要的水產資源。黑邊石斑魚屬于雌雄同體、先雌后雄的海水魚類。目前日本東京都小笠原群島每年進行黑邊石斑魚苗種的生產和放流［18］，以增加其漁獲產量。對日本長崎市沿岸海域市場的調查表明，通過垂釣或網捕所得漁獲物中黑邊石斑魚的數量大幅增加，但捕獲個體的規(guī)格卻逐年減小。黑邊石斑魚原屬南海主要珊瑚礁魚類［2］，近年隨著日本近海水溫的上升，其棲息地北遷至長崎沿岸海域。研究表明，在人工養(yǎng)殖環(huán)境下，其滿1齡時體長為16.6 cm，滿2齡時為23.5 cm［16］，2～3齡時性腺發(fā)育成熟［18］，此前均為雌性，之后經過短暫的間性過渡后性逆轉為雄性。由于地域和環(huán)境的不同，其產卵期和性成熟規(guī)格也有差異。如在菲律賓熱帶海域，黑邊石斑魚雌性成熟個體體長為14～28 cm，成熟且完成卵黃蓄積后能夠全年進行產卵［19］，而在小笠原群島其產卵期在4—6月，性成熟體長24 cm［20］。此外養(yǎng)殖條件的差異也會導致其產卵期的不同，如自然條件下小笠原群島在4—6月，人工養(yǎng)殖條件下在4—11月［20］。但至今未見長崎沿岸海域有關黑邊石斑魚的生長和成熟之間關系的研究報道。本研究為探明日本長崎市沿岸海域黑邊石斑魚性成熟、性逆轉期與體長、年齡之間的關系，于2015年7月至2018年6月逐月連續(xù)采樣，并對其體長、體質量、年齡、性別、性腺發(fā)育成熟度和性腺指數以及血清中雌二醇（17β-Estradiol，E2）含量展開了調查研究，以為今后黑邊石斑魚的資源調查和人工繁殖提供更多信息。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2015年7月至2018年6月，采用漁船捕撈作業(yè)和垂釣法相結合的方式，在日本長崎市沿岸海域隨機捕獲黑邊石斑魚，分別記錄每月累計采樣的數量，樣本數量總計297尾。

1.2 實驗方法

所捕獲黑邊石斑魚用2-苯氧乙醇麻醉后，測定全長（total length，TL）和體質量（body weight，BW）。從尾柄部采血，血液在1 500 r·min-1、4℃離心機中離心20 min后取上層血清保存于-80℃冰箱。之后取出性腺，測定質量（gonadal weight，GW），計算性腺指數（gonadosomatic index，GSI），公式為：

將性腺固定在波恩試劑中，24～48 h后轉移至70%的酒精中保存用于組織學分析。之后取出位于腦下部的耳石，左右各一個，將其保存在70%的乙醇或蒸餾水中，用于年齡的測定。

1.2.1 性腺組織學觀察

對黑邊石斑魚性腺進行常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為5μm。采用蘇木精-伊紅（HE）染色，中性樹膠封片，Olympus FX380型光學顯微鏡觀察并拍照，以切片圖中性細胞最發(fā)達階段作為性腺的發(fā)育階段。性腺中若觀察到卵母細胞的個體為雌性；同時觀察到卵細胞和精細胞的個體為間性；觀察到精原細胞、精母細胞或精子的個體為雄性。此外，雌性參考國內外學者的研究［21-23］對卵母細胞發(fā)育情況作A～G分期。

1.2.2 耳石加工和年齡的鑒定

耳石加工和年齡的鑒定參照文獻［24-25］中的方法加以改進，具體過程如下，將半片膠囊（Kobayashi Capsulae Co.，Ltd.，Japan）投入到牙科用樹脂（Shofu Inc.，Japan）中后迅速將耳石垂直包埋其中，包埋后的耳石放置在低速精密切斷機（MetaServTM250-Single，Switzerland）上于中心部位沿短軸方向切開，厚度約1.5 mm左右。之后置于研磨機（MetaServTM 250-Single，Switzerland）上研磨至厚度約0.5 mm。在1%鹽酸溶液中浸泡20 s后于1%甲苯胺藍溶液中染色60 s，最后用透明指甲油固定在載玻片上，在顯微鏡下根據所觀察到的輪紋數鑒定黑邊石斑魚的年齡。

1.2.3 血清中雌二醇含量的檢測

本實驗中雌二醇（17β-Estradiol，E2）的檢測參照左永松等［26］的方法進行測定，具體過程如下，-80℃冷凍的血清樣品經過4℃解凍離心后取得上層血清，血清經過甲醇-乙醚低溫冷凍蒸發(fā)系統(tǒng)進行類固醇的提純，經3次冷凍蒸發(fā)后的血清樣品可用于檢測。E2的測定采用Cayman Chemical公司購置的EIA（enzyme immunoassy）酶聯免疫試劑盒。

1.3 數據分析

利用SPSS 22.0軟件對數據進行比較分析，所有數據均表示為平均值±標準誤（means±SEM）。采用Kolmogorov-Smirnov法進行正態(tài)分布檢測，利用ANOVA檢驗以及Tukey’s HSD法進行差異性比較分析，取P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 黑邊石斑魚的累計數量及其生長指數的變化

2015年7月至2018年6月，每月捕獲黑邊石斑魚的累計數量及其生長指數的變化如表1所示。黑邊石斑魚體長在9月顯著高于5、6、8、10、12月（P＜0.05），體質量在9月顯著高于1、2、5、6、8、10、11、12月（P＜0.05）；其性腺質量和GSI的變化一致，兩者均在7月顯著高于1—5月和8—12月（P＜0.05）。

2.2 未成熟與成熟雌性、間性和雄性個體累計數量及其比例的變化

調查期黑邊石斑魚性腺發(fā)育各階段切片如圖1所示，其中未成熟雌性性腺發(fā)育見圖1-A～B，成熟雌性見圖1-C～G，間性圖1-H，雄性圖1-I。調查期每月未成熟與成熟雌性、間性和雄性個體累計數量及其比例的變化如表2所示。每月均觀察到未成熟雌性個體，其比例在1—5月較高，在3月和5月均達到100%；在6—12月較低，其中7月最低，僅為20.7%。在1、2、4及6—11月觀察到成熟雌性個體，在6—8月比例較高，6月為45.5%，7月升至最高為64.6%，8月為43.8%；之后逐漸降低，在11月僅為7.1%。此外，在7、8、11、12月觀察到間性個體；在1、7、8、10、11、12月觀察到雄性個體。每月間性和雄性個體比例為0～30%，均較雌性個體比例低。

2.3 7月未成熟與成熟雌性、間性和雄性個體累計數量、生長指數、GSI和年齡的差異

根據表2的結果，取成熟雌性比例最高的調查期7月累計捕獲的82尾黑邊石斑魚統(tǒng)計未成熟與成熟雌性、間性和雄性個體累計數量、生長指數、GSI及年齡如表3所示。間性和雄性個體體長和體質量均顯著高于未成熟和成熟雌性個體（P＜0.05）。成熟雌性的性腺質量和GSI顯著高于未成熟雌性、間性以及雄性（P＜0.05）。未成熟和成熟雌性的年齡在2～4齡，間性在9齡，雄性在7～12齡。

表1 調查期月捕獲黑邊石斑魚累計數量及其生長指數的變化Tab.1 Changes of cumulative number and grow th index of Epinephelus fasciatus in each month from July 2015 to June 2018

2.4 7月雌性黑邊石斑魚年齡、性腺發(fā)育階段、累計數量、生長指數、GSI和雌二醇含量的變化

根據表3的結果，取成熟雌性比例最高的調查年7月累計捕獲的70尾雌性黑邊石斑魚統(tǒng)計其年齡、性腺發(fā)育階段、累計數量、生長指數、GSI和雌二醇（E2）含量的變化如表4所示。在2齡魚中未檢測到成熟個體，其性腺發(fā)育檢測為核仁外周期（Pn）和卵黃囊泡期（Yv）階段，各指標均無顯著性差異，其Yv階段體長為（21.92±0.83）cm，GSI為（0.35±0.04）%，E2含量為（73.38±12.94）pg·mL-1。3齡魚中開始檢測到三級卵黃球期（Ty）階段成熟個體，其體長為（24.52±1.55）cm，GSI為（4.05±1.24）%，E2含量為（247.28±45.34）pg·mL-1。4齡魚中大部分個體檢測為Ty階段成熟個體，其體長為（28.96±0.51）cm，GSI為（3.89±0.63）%，E2含量為（253.88±45.47）pg·mL-1。5齡魚的性腺發(fā)育檢測均為完熟期（R）階段。

3齡魚的性腺發(fā)育檢測為Pn、Yv、Ty和核移動期（Mn）階段，其中Ty和Mn階段的性腺質量、GSI和E2含量顯著高于Pn階段（P＜0.05），Ty和Mn階段的E2含量顯著高于Pn和Yv階段（P＜0.05）。4齡魚的性腺發(fā)育檢測為Yv、Ty和R階段，其中Ty和R階段的性腺質量、GSI和E2含量顯著高于Yv階段（P＜0.05）。

圖1 不同發(fā)育階段黑邊石斑魚性腺切片圖Fig.1 Histological sections of different gonadal developmental stages of Epinephelus fasciatus

3 討論

3.1 黑邊石斑魚卵巢發(fā)育成熟期的推測及其與E2之間的聯系

本研究中，在長崎市沿岸海域捕獲的黑邊石斑魚在6—8月觀察到較高比例的成熟雌性個體，且其GSI和成熟比例均在7月達到峰值。已有研究表明，褐石斑魚（E.bruneus）卵黃球形成期出現在4月且在5—6月確認產卵［27］。七帶石斑魚（E.septemfasciatus）卵黃囊泡以及卵黃球形成期在3月，5月迎來產卵期［28］。蜂巢石斑魚（E.merra）產卵期在5—7月［26，29］。赤點石斑魚［30］和鞍帶石斑魚（E.lanceolatus）［31］的人工繁殖期分別在6—9月和7—9月。已有研究表明，長崎地區(qū)黑邊石斑魚性腺在2017年7月和8月能發(fā)育成熟并產卵，是水溫、性激素E2和性成熟激素DHP共同調節(jié)所致［32］。以上結果表明，由于石斑魚種類的不同，其性腺發(fā)育成熟和產卵期也會有所差異，在長崎市沿岸海域海水水溫每年變化不大的情況下，黑邊石斑魚性成熟期大致在7月。

表2 調查期各月未成熟與成熟雌性、間性和雄性個體累計數量及其比例Tab.2 Changes of cumulative number and proportion between the immature and mature female，intersex，and male Epinephelus fasciatus in each month from July 2015 to June 2018

表3 調查期7月未成熟與成熟雌性、間性和雄性個體累計數量、生長指數、GSI和年齡的差異Tab.3 Differences of cumulative number，grow th index，GSI，and age between the immature and mature female，intersex，and male Epinephelus fasciatus in July from July 2015 to June 2018

表4 調查期7月雌性黑邊石斑魚年齡、性腺發(fā)育階段、累計數量、生長指數、GSI和雌二醇（E2）含量的變化Tab.4 Changes of age，gonadal developmental stage，cumulative number，grow th index，GSI，and 17β-Estradiol（E2）content of Epinephelus fasciatus in July from July 2015 to June 2018

大量研究［33］表明，魚類腦垂體分泌的促性腺激素（gonadotropins，GtHs）能夠誘導性腺合成性激素E2，從而促進卵母細胞發(fā)育成熟。本研究3齡和4齡成熟雌性個體中E2含量和GSI顯著高于未成熟雌性個體，表明E2在誘導卵母細胞發(fā)育成熟過程中起重要作用。以往的研究表明［32］，黑邊石斑魚E2含量在成熟季節(jié)顯著高于非成熟季節(jié)。斜帶石斑魚（E.coioides）成熟雌魚血清中E2含量在生殖季節(jié)最高，且其平均性腺成熟系數GSI也顯著高于其他月份，表明其血清E2水平的季節(jié)變化與性腺成熟系數的變化基本一致，都是在生殖季節(jié)達到最高峰［34］。此外，給鯔（Mugil dussumieri）注射外源激素E2能夠誘導其性腺發(fā)育成熟［35］。斜帶髭鯛（Hapalogenys nitens）血清中E2含量在產卵期之前達到最高值，且其變化趨勢與卵母細胞發(fā)育和GSI的變化一致［36］。本研究中黑邊石斑魚成熟階段性激素和GSI的變化趨勢與上述結果一致，表明E2含量的增加與卵巢發(fā)育成熟密切相關。

3.2 黑邊石斑魚體長、年齡與性成熟、性逆轉之間的聯系

本研究中2齡黑邊石斑魚最小體長為21.4 cm，3齡為24.5 cm，4齡為27.8 cm。已有研究表明［17］，在日本小笠原人工養(yǎng)殖的黑邊石斑魚最小體長2齡為23.5 cm，3齡為27.6 cm。本研究中的黑邊石斑魚均為長崎市沿岸海域捕獲，因此其體長與小笠原人工養(yǎng)殖的有所差異。本研究中黑邊石斑魚在3齡時檢測到成熟個體，而小笠原養(yǎng)殖群體的成熟期在2～3齡［17］。褐石斑魚在3齡時出現成熟個體，但比例較低，僅為4%；4～6齡時成熟率分別為45%、63%和63%，隨著年齡的增長成熟率逐漸增加［37］。赤點石斑魚在2～3齡時出現成熟個體［38］，表明不同種類石斑魚成熟的年齡也不相同。本研究中3齡成熟個體的體長在24.5 cm左右，隨著體長的增加，成熟個體的數量也逐漸增加，表明長崎市沿岸海域黑邊石斑魚初次性成熟年齡在3齡、體長在24.5 cm左右。

魚類性逆轉是一個復雜的生理過程，雌性先熟的雌雄同體魚類（如石斑魚）在自然條件下激素的平衡首先趨向于雌性發(fā)育成熟，直到產卵后的一定發(fā)育階段才開始產生卵巢退化、精巢發(fā)育的性逆轉過程［39］。本研究中黑邊石斑魚在體長35.7 cm左右、9齡時檢測到間性個體；體長36.7 cm左右、7～12齡時檢測到雄性個體，表明其性逆轉期大致在7～12齡。已有研究表明，自然海區(qū)的石斑魚性逆轉一般發(fā)生在體長和年齡足夠大的個體，如赤點石斑魚發(fā)生在6齡［15，40］，鮭點石斑魚（E.tauvina）在7齡以上［41-42］，褐石斑魚在11齡左右［27］。此外，在人工養(yǎng)殖條件下赤點石斑魚體長17～24 cm時性逆轉出現雄魚，但自然環(huán)境下體長27 cm時仍未見雄魚［38］，表明除年齡和體長外，生活環(huán)境也會影響石斑魚性逆轉時期。因此，本實驗中黑邊石斑魚性逆轉期可能受到體長、年齡和生活環(huán)境的影響。

綜上所述，2015年7月至2018年6月通過連續(xù)調查取樣，長崎市沿岸海域黑邊石斑魚性成熟期在7月且與E2含量的增加密切相關，其初次性成熟年齡在3齡，性逆轉在7～12齡。本研究結果為黑邊石斑魚的資源保護及人工繁殖方面提供了基礎生物學資料和理論依據。