蝦肝腸胞蟲(chóng)4個(gè)孢壁蛋白基因的鑒定、序列特征及表達(dá)分析

李枝敏，王 元，房文紅，周俊芳，李新蒼

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)，上海 201306）

蝦肝腸胞蟲(chóng)（Enterocytozoon hepatopenaei，簡(jiǎn)稱(chēng)EHP），屬微孢子蟲(chóng)目（Microsporidia），微孢子蟲(chóng)科（Nosematidae），腸胞蟲(chóng)屬，是一種主要寄生在對(duì)蝦肝胰腺細(xì)胞中的單細(xì)胞真核生物。EHP最早于2004 年在泰國(guó)斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）肝胰腺細(xì)胞內(nèi)被檢測(cè)到［1］，直到2009年TOURTIP等［2］才將其正式命名為蝦肝腸孢蟲(chóng)，并將其認(rèn)定為腸上皮細(xì)胞微孢子蟲(chóng)屬的一個(gè)新種。隨后，國(guó)內(nèi)外均對(duì)EHP開(kāi)展了大量的研究，研究?jī)?nèi)容涉及EHP檢測(cè)方法、流行病學(xué)、典型臨床癥狀和病理變化等［3-13］，如目前已建立對(duì)蝦EHP的LAMP檢測(cè)方法［3-4］和TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法［5-6］，均可用于病原的快速檢測(cè)；流行病學(xué)研究顯示，EHP主要通過(guò)水平方式進(jìn)行傳播，但也有研究人員發(fā)現(xiàn)該病原也可以通過(guò)垂直方式傳播［7-11］；前期大量研究表明，EHP感染對(duì)蝦的典型臨床癥狀為生長(zhǎng)緩慢或停滯，有時(shí)出現(xiàn)白便癥狀，但對(duì)蝦的存活率沒(méi)有顯著改變［9，11］。綜合已有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前對(duì)EHP的生物學(xué)特性還缺乏足夠了解，關(guān)于該病原的一些重要科學(xué)問(wèn)題，如在國(guó)內(nèi)暴發(fā)流行的EHP與國(guó)外流行株是否屬于同一個(gè)種，該病原在世界流行暴發(fā)是否會(huì)導(dǎo)致某些基因產(chǎn)生變異等，尚無(wú)明確報(bào)道。此外，EHP侵染的分子機(jī)制仍不清楚。因此有必要鑒定一批可能與EHP侵染相關(guān)的分子，開(kāi)展前期基礎(chǔ)研究，為EHP侵染機(jī)制乃至疾病防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

孢壁蛋白位于微孢子蟲(chóng)孢子的最外層，研究表明某些孢壁蛋白能與宿主細(xì)胞表面組分直接接觸，參與侵染過(guò)程。例如，家蠶微孢子蟲(chóng)（Nosema bombycis）的特定孢壁蛋白在其侵染宿主的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用［14-15］，提示EHP的某些孢壁蛋白也可能參與了宿主的侵染過(guò)程。因此，鑒定EHP孢壁蛋白種類(lèi)，明確哪些孢壁蛋白在微孢子蟲(chóng)感染過(guò)程中發(fā)揮了作用，不但可以了解微孢子蟲(chóng)的感染機(jī)制，還可以將其作為阻斷感染的靶標(biāo)分子，用于開(kāi)發(fā)微孢子蟲(chóng)感染阻斷試劑或藥物。當(dāng)前，對(duì)EHP孢壁蛋白的報(bào)道較少，JAROENLAK等［16］在2018年報(bào)道了EHP的第1個(gè)孢壁蛋白EhSWP1，推測(cè)其可能參與EHP感染；寧梓健等［17］在2020年也預(yù)測(cè)到1個(gè)含有信號(hào)肽序列的孢壁蛋白基因SWP7，但該基因表達(dá)特點(diǎn)還不清楚。為進(jìn)一步了解EHP孢壁蛋白的特性，本研究擬對(duì)從EHP感染陽(yáng)性對(duì)蝦中獲得的4個(gè)假設(shè)孢壁蛋白基因進(jìn)行鑒定，分析它們的序列特征，并比較它們的相似性及表達(dá)規(guī)律，以期促進(jìn)EHP孢壁蛋白生物學(xué)特性的解析，為EHP疾病防控提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

疑似發(fā)病凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei，以下簡(jiǎn)稱(chēng)對(duì)蝦）于2017年8月份取自上海青浦某對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)。隨機(jī)采集外觀健康的成年活體對(duì)蝦樣本（70日齡以上）28只，對(duì)蝦體質(zhì)量為4～16 g，其中16只用于蝦肝腸孢蟲(chóng)PCR檢測(cè)，6只用于孢壁蛋白基因轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)，6只用于孢壁蛋白基因表達(dá)分析研究。

1.2 疑似EHP感染對(duì)蝦肝胰腺組織的鏡檢

為檢測(cè)該批對(duì)蝦是否存在EHP感染，取疑似EHP感染對(duì)蝦肝胰腺制作濕涂片，隨后用光學(xué)顯微鏡（LEICA，DM4B）鏡檢觀察。

1.3 組織核酸樣品提?。―NA和總RNA）

對(duì)蝦肝胰腺組織DNA的提取方法參照海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）的說(shuō)明書(shū)。對(duì)蝦肝胰腺、胃、鰓和腸4個(gè)組織的總RNA選用Trizol試劑（大連TaKaRa）進(jìn)行提取。提取的核酸樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA樣品符合實(shí)驗(yàn)要求后，再用超微量分光光度計(jì)（ND 5000，北京百泰克）測(cè)定核酸樣品濃度，保存至-20℃條件下備用。

1.4 對(duì)蝦EHP的PCR檢測(cè)

本研究通過(guò)PCR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)一步確認(rèn)對(duì)蝦樣品的EHP感染狀況，檢測(cè)方法參照前期文獻(xiàn)報(bào)道［16］。PCR反應(yīng)采用的引物序列為EHPF1（5′-TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTT-3′）和 EHPR1（5′-CACGATGTGTCTTTGCAATTTTC-3′），模板為1.3中提取的肝胰腺組織DNA。反應(yīng)體系如下（20 μL）：2 × Premix ExTaq10 μL，10 pmol·μL-1上下游引物（EHPF1和EHPR1）各1 μL，肝胰腺樣品DNA模板1μL（1μg·μL-1），雙蒸水7μL；PCR反應(yīng)反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；30個(gè)循環(huán)包括94℃變性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸40 s；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，確定陽(yáng)性樣品（陽(yáng)性樣品出現(xiàn)大小為514 bp的條帶）。

由圖可見(jiàn)，水泥凈漿流動(dòng)度隨VAc加入量增加先增大后減?。欢炷恋牡固骺諘r(shí)間隨著VAc的量增加迅速減少，當(dāng)VAc的加入量占單體總質(zhì)量的10%，流空時(shí)間最少，混凝土的粘度較低，隨著疏水單體VAc的加入，表面活性效果有所增強(qiáng)，從而降低了混凝土的粘度。而之后繼續(xù)增加VAc用量粘度卻增大，這是由于在該反應(yīng)體系中，VAc的反應(yīng)活性明顯低于其他單體，當(dāng)過(guò)量時(shí)，反應(yīng)體系活性較低、轉(zhuǎn)化率降低，有大量的單體殘余在體系中，對(duì)水泥凈漿和混凝土粘度產(chǎn)生不利影響。

1.5 cDNA的合成

通過(guò)分析對(duì)蝦肝胰腺轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，獲得4個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果為孢壁蛋白的基因。為驗(yàn)證這4個(gè)基因序列拼接的正確性，依據(jù)獲得的cDNA序列，設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物（表1），以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取4個(gè)基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）序列。為獲得4個(gè)基因?qū)?yīng)的DNA序列，選取肝胰腺組織DNA為模板，并利用上述4對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2×Premix ExTaq25 μL，10 pmol·μL-1上下游引物（EF和ER）各2 μL，cDNA模板／DNA模板2μL（1μg·μL-1），雙蒸水19μL，總體積50μL。PCR反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性5 min；35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min）；最后72℃延伸10 min。

1.6 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及孢壁蛋白基因預(yù)測(cè)

將EHP感染中后期的對(duì)蝦肝胰腺組織總RNA送至上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。核酸樣品經(jīng)高通量測(cè)序后，使用Trinity序列拼接軟件將經(jīng)雙端測(cè)序的序列進(jìn)行拼接，獲取轉(zhuǎn)錄本和最終的Unigenes。將Unigenes與在線數(shù)據(jù)庫(kù)（NR、SWISSPROT和KOG）進(jìn)行比對(duì)并注釋?zhuān)Y選EHP孢壁蛋白基因。

1.7 EHP 4個(gè)孢壁蛋白基因開(kāi)放閱讀框序列及相應(yīng)DNA序列的獲取

將1.3中提取的4個(gè)組織總RNA作為模板，參照cDNA合成試劑盒（大連TaKaRa）所述方法分別進(jìn)行第一鏈cDNA合成，反應(yīng)產(chǎn)物保存至-20℃條件下備用。

1.8 EHP 4個(gè)孢壁蛋白基因序列測(cè)序及鑒定

將EhEnP1、EhSWP7、EhSWP12和EhSWP26的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這4個(gè)孢壁蛋白氨基酸序列一致性為16.14%（圖2）。在這4個(gè)孢壁蛋白中，EhEnP1和EhSWP7的氨基酸序列一致性最高，也僅為13.51%，表明4個(gè)孢壁蛋白相互之間的相似性很低，屬于4個(gè)不具有序列相似性的蛋白。

取凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織進(jìn)行涂片，鏡檢結(jié)果顯示，肝胰腺組織中存在大量的微孢子蟲(chóng)孢子樣結(jié)構(gòu)，初步判斷該批對(duì)蝦很可能存在EHP感染。為進(jìn)一步確認(rèn)鏡檢結(jié)果，作者對(duì)該批對(duì)蝦開(kāi)展了EHP的PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖1所示：檢測(cè)的16只對(duì)蝦中，有10只蝦檢測(cè)到目的條帶，確認(rèn)EHP感染陽(yáng)性，陽(yáng)性率為62.5%，據(jù)此判斷該對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)存在嚴(yán)重的EHP感染。

1.9 生物信息學(xué)分析

為分析4個(gè)孢壁蛋白基因在EHP感染對(duì)蝦不同組織中的表達(dá)量，本研究借助熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了孢壁蛋白基因在對(duì)蝦肝胰腺、鰓、腸和胃組織中的表達(dá)水平。根據(jù)4個(gè)孢壁蛋白基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)的4對(duì)特異性引物序列見(jiàn)表2。此外，對(duì)蝦延伸因子EF-1α被選為內(nèi)參基因，用于計(jì)算4個(gè)孢壁蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量。熒光定量檢測(cè)使用上述合成的第一鏈cDNA為模板，具體反應(yīng)體系為：2×SYBR premix ExTaqTM10μL，1μmol·mL-1上下游引物（EF和ER）各4 μL，cDNA模板2μL，總體積20μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min；隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增（95℃變性10 s，60℃退火延伸60 s）；最后將樣品從60℃逐漸升溫至95℃，每升高0.5℃檢測(cè)1次熒光值，用于熔解曲線分析。用SPSS 17.0進(jìn)行t檢驗(yàn)和差異顯著性分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)視為差異顯著。

1.3.2 松弛療法 指通過(guò)一定的肌肉松弛訓(xùn)練程序，有意識(shí)地控制自身的生理心理活動(dòng)，降低喚醒水平，改善軀體及心理功能紊亂狀態(tài)，達(dá)到治療疾病的作用［10］。

筆者作為陜西農(nóng)墾集團(tuán)朝邑農(nóng)場(chǎng)有限公司外派到蘇墾農(nóng)發(fā)新洋分公司掛職的干部，全程參加了新洋分公司2018年三秋工作。新洋分公司運(yùn)用現(xiàn)代公司化管理模式，依靠科技創(chuàng)新，落實(shí)關(guān)鍵技術(shù)措施，發(fā)展現(xiàn)代農(nóng)業(yè)。新洋分公司發(fā)展現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的公司化管理模式，值得陜西農(nóng)墾借鑒學(xué)習(xí)。

2015年北海市通過(guò)開(kāi)展大量的實(shí)地調(diào)研考察，對(duì)收集到的建筑工程中常見(jiàn)問(wèn)題，有針對(duì)性地給出了解決辦法，匯總編制成《北海市建設(shè)工程質(zhì)量安全管理標(biāo)準(zhǔn)化圖集》，用于指導(dǎo)施工企業(yè)按圖索驥，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化施工，最大限度地降低質(zhì)量通病的發(fā)生，使北海市建筑工程質(zhì)量整體水平得到明顯的提升。特別是住宅工程中滲漏、裂縫、空鼓、空間尺寸偏差等通病得到了有效控制，投訴信訪案件發(fā)生率逐年穩(wěn)步下降，人民群眾對(duì)住宅工程的滿(mǎn)意度持續(xù)提高。

1.10 4個(gè)孢壁蛋白基因在EHP感染對(duì)蝦不同組織的表達(dá)分析

用在線翻譯軟件（http：／／web.expasy.org／translate／）將EHP孢壁蛋白基因的cDNA序列翻譯成氨基酸序列。用在線軟件SingalP 5.0預(yù)測(cè)孢壁蛋白氨基酸序列的信號(hào)肽，并在線計(jì)算孢壁蛋白理論分子量和等電點(diǎn)（http：／／web.expasy.org／compute＿pi／）。用在線比對(duì)工具BLASTP分析EHP孢壁蛋白與其他微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白的相似性，并用DNAMAN軟件分析孢壁蛋白氨基酸序列間的相似性，以及cDNA序列中ORF區(qū)序列與對(duì)應(yīng)DNA序列的一致性。

休閑制約協(xié)商更加強(qiáng)調(diào)人對(duì)制約因素的積極能動(dòng)作用，進(jìn)一步拓展了休閑制約的研究?jī)?nèi)容。當(dāng)然，如何檢驗(yàn)和測(cè)量休閑制約協(xié)商過(guò)程中的各種干預(yù)因素也成為研究難點(diǎn)，同時(shí)是推動(dòng)研究向縱深方向發(fā)展的關(guān)鍵點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏡檢及PCR檢測(cè)結(jié)果

二是要按照生態(tài)文明建設(shè)、保護(hù)優(yōu)先和節(jié)約集約的要求來(lái)開(kāi)展改革創(chuàng)新工作。明年工作要把改革擺在重要位置，深度全面地推進(jìn)各項(xiàng)工作，并在原來(lái)基礎(chǔ)上要有所拓展。

2.2 EHP 4個(gè)孢壁蛋白基因初步鑒定結(jié)果

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和數(shù)據(jù)分析，從EHP感染陽(yáng)性對(duì)蝦肝胰腺中鑒定到4個(gè)孢壁蛋白樣基因，分別 命 名 為EhEnP1、EhSWP7、EhSWP12和EhSWP26。通過(guò)BLASTP在線比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這4個(gè)基因編碼的氨基酸序列，分別與泰國(guó)研究團(tuán)隊(duì)經(jīng)基因組測(cè)序得到的EHP孢壁蛋白EHP00＿1402（蛋白編號(hào)：OQS54765.1）、SWP7（OQS55031.1）、SWP12（OQS53422.1）和孢子蛋白（OQS53873.1）的氨基酸序列一致。此外，我們進(jìn)一步分析了4個(gè)孢壁蛋白氨基酸序列與其他孢壁蛋白序列的相似性。

圖1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products

利用qRT-PCR檢測(cè)了EHP 4個(gè)孢壁蛋白基因在不同組織的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果將鰓組織中各基因的表達(dá)設(shè)為1，肝胰腺中這4個(gè)基因（EhEnP1、EhSWP7、EhSWP12和EhSWP26）的表達(dá)量分別約為鰓組織表達(dá)量的118、358、1843、297倍（圖3-A～D）。結(jié)果表明：這4個(gè)基因均在肝胰腺組織中表達(dá)量最高，在鰓組織中表達(dá)量最低（P＜0.05）；各基因在胃和腸組織中的表達(dá)量比較接近。提示EHP侵染的主要組織是肝胰腺。

2.3 EHP 4個(gè)孢壁蛋白基因的序列特征

進(jìn)一步序列分析發(fā)現(xiàn)，EhEnP1、EhSWP7、EhSWP12和EhSWP26的cDNA序列全長(zhǎng)分別為1 002、779、756、718 bp，其開(kāi)放閱讀框（ORF）分別為1 002、753、735、687 bp，分別編碼333、250、244、228個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的理論分子量分別為38.3、25.3、28.7、25.7 kDa，計(jì)算的理論等電點(diǎn)分別為8.86、5.04、9.05、5.12，提交的基因編號(hào)分別 為 MN604019、MN604020、MN604021 和MN604022。用SignalP 5.0在線分析4個(gè)孢壁蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)僅EhSWP7蛋白含有信號(hào)肽（第1至21位氨基酸）。在線軟件SMART分析結(jié)果顯示，只有EhSWP26 預(yù)測(cè)到1個(gè)MICSWaP結(jié)構(gòu)域（第28至222位氨基酸）。

2.4 4個(gè)孢壁蛋白氨基酸序列的相似性分析

將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，按照核酸回收試劑盒（大連TakaRa）說(shuō)明對(duì)目的片段進(jìn)行回收。隨后將4個(gè)核酸片段分別連接到pMD-19T載體中，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，對(duì)藍(lán)白斑篩選及PCR篩選均為陽(yáng)性的菌株進(jìn)行增殖培養(yǎng)，菌液樣品送至上海瑞迪生物科技公司進(jìn)行測(cè)序。

2.5 4個(gè)孢壁蛋白基因的cDNA序列和基因組序列的相似性分析

進(jìn)一步擴(kuò)增4個(gè)孢壁蛋白基因開(kāi)放閱讀框?qū)?yīng)的基因組序列，分別進(jìn)行序列相似性比較，發(fā)現(xiàn)4個(gè)孢壁蛋白基因的cDNA序列與對(duì)應(yīng)的基因組序列分別一致，結(jié)果表明4個(gè)孢壁蛋白基因?qū)?yīng)的DNA序列中沒(méi)有內(nèi)含子序列。

2.6 EHP 4個(gè)孢壁蛋白基因在不同組織中的表達(dá)水平

BLASTP結(jié)果顯示：EhEnP1與柑橘鳳蝶（Papilio xuthus）微孢子蟲(chóng)EnP1樣孢壁蛋白（XP＿013175528.1）的一致性為40.79%，表明兩者屬于同源分子，因此將該孢壁蛋白命名為EhEnP1。與此類(lèi)似，EhSWP7 與中華絨螯蟹肝胞蟲(chóng)（Hepatospora eriocheir）的孢壁蛋白 SWP7（ORD97919.1）的一致性高達(dá)40.57%，EhSWP12與黃道蟹腸孢蟲(chóng)（Enterospora canceri）的孢壁蛋白SWP12（ORD93985.1）的一致性高達(dá)50.63%，故將EHP這兩個(gè)孢壁蛋白分別命名為EhSWP7和EhSWP12。此外，EhSWP26與果蠅微孢子蟲(chóng)假定孢壁蛋白（RVD91259.1）的一致性是24.59%，與水蚤微孢子蟲(chóng)（Hamiltosporidium magnivorad）假定孢壁蛋白 （TBU08151.1）和 微孢子蟲(chóng)（Hamiltosporidium tvaerminnensis）假定孢壁蛋白（TBU01699.1）的一致性均是20.61%。從上述比對(duì)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，該類(lèi)孢壁蛋白在其他物種中也沒(méi)有確切的命名，由于該孢壁蛋白理論分子量為25.7 kDa，大 小 接 近26 kDa，故 暫 命 名 為EhSWP26。

2.7 EHP 4個(gè)孢壁蛋白基因在肝胰腺和胃兩個(gè)組織中的表達(dá)分析

為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的嚴(yán)謹(jǐn)性和準(zhǔn)確性，將4個(gè)孢壁基因在2個(gè)高表達(dá)組織中（肝胰腺和胃）的相對(duì)表達(dá)量分別進(jìn)行計(jì)算和比較。結(jié)果顯示，在肝胰腺組織中4個(gè)基因（依次為EhEnP1、EhSWP7、EhSWP12和EhSWP26，下同）相對(duì)同一個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)量分別為0.041、0.050、0.232和0.054，將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，表達(dá)量如圖4-A所示，它們之間的比例關(guān)系約為1∶1∶4∶1。在胃組織中，這4個(gè)基因表達(dá)量分別為0.006 4、0.01、0.016 6和0.006 2，將計(jì)算結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化后，表達(dá)量如圖4-B所示，它們之間的比例關(guān)系約為1∶1.5∶3∶1。上述結(jié)果表明，4個(gè)孢壁蛋白基因在2種不同組織中的表達(dá)模式有一定的相似性。其中，EhEnP1和EhSWP26的表達(dá)量較為一致，表明它們?cè)贓HP的蛋白構(gòu)成比例可能也相似；EhSWP7含量約為EhEnP1的1～1.5倍，表明在EHP的蛋白構(gòu)成中可能前者稍高于后者或兩者相似；EhSWP12的表達(dá)量約為EhEnP1的3～4倍，在這4個(gè)基因中表達(dá)量最高，由此推測(cè)EhSWP12在EHP蛋白組成中含量也高于其他3種蛋白。

圖2 蝦肝腸孢蟲(chóng)Eh EnP1、Eh SWP7、Eh SWP12和Eh SWP26的氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Alignment of four SWP am ino acids of EHP

圖3 4個(gè)孢壁蛋白基因在不同組織中的表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of four spore wall protein genes in different tissues

圖4 4個(gè)孢壁蛋白基因在肝胰腺和胃組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of four spore wall proteins genes in hepatopancreas and stomach

3 討論

近年來(lái)，在浙江、粵西、遼寧、天津等多個(gè)對(duì)蝦養(yǎng)殖區(qū)域均檢出了EHP感染［19-23］。本研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自上海郊區(qū)的這批凡納濱對(duì)蝦EHP感染率高達(dá)62.5%，進(jìn)一步表明EHP感染在我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖區(qū)域較為普遍。由于EHP最早在泰國(guó)斑節(jié)對(duì)蝦中被檢測(cè)到［1］，并將其認(rèn)定為微孢子蟲(chóng)屬的一個(gè)新種［2］，這給我國(guó)研究人員提出了一個(gè)重要科學(xué)問(wèn)題：在我國(guó)暴發(fā)流行的EHP與泰國(guó)流行株是否屬于同一個(gè)種；此外，EHP作為一種簡(jiǎn)單真核生物，是否會(huì)像病毒、細(xì)菌等原核生物一樣常因環(huán)境選擇壓力導(dǎo)致部分基因發(fā)生變異，這些問(wèn)題目前還不清楚。為此，本研究通過(guò)基因克隆獲取了EHP的4個(gè)孢壁蛋白基因的DNA序列，序列比較發(fā)現(xiàn)，它們分別與泰國(guó)當(dāng)?shù)谽HP孢壁蛋白基因的DNA序列一致，這表明上海養(yǎng)殖場(chǎng)的該對(duì)蝦微孢子蟲(chóng)和泰國(guó)當(dāng)?shù)谽HP極有可能屬于同一個(gè)種?？紤]到4個(gè)孢壁蛋白基因的序列均沒(méi)有出現(xiàn)變異現(xiàn)象，提示該真核生物具有不易受環(huán)境改變而產(chǎn)生基因變異的特點(diǎn)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)這4個(gè)孢壁蛋白基因?qū)?yīng)的DNA序列中均不含內(nèi)含子，與原核生物基因組結(jié)構(gòu)中不含內(nèi)含子的特征非常相似，這也是早期研究將微孢子蟲(chóng)歸為原核生物的重要原因之一，研究結(jié)果也從另一角度揭示微孢子蟲(chóng)屬于低等真核生物。

微孢子蟲(chóng)的孢壁主要由孢壁蛋白和纖維狀幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)成。孢壁蛋白位于微孢子蟲(chóng)孢子最外層，研究表明某些孢壁蛋白能與宿主細(xì)胞表面組分直接接觸，參與侵染過(guò)程［14-15］。對(duì)孢壁蛋白進(jìn)行鑒定并研究其生物學(xué)功能，對(duì)于闡明微孢子蟲(chóng)侵染機(jī)制以及其與宿主之間的關(guān)系非常重要。雖然目前EHP孢壁蛋白的研究報(bào)道較少見(jiàn)，但來(lái)源于家蠶、蜜蜂、蝗蟲(chóng)等微孢子蟲(chóng)的孢壁蛋白報(bào)道較多，其中家蠶微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白的研究最多，有深入研究的已達(dá)10種［15，24-35］。據(jù)此推測(cè)，對(duì)蝦EHP孢壁蛋白也應(yīng)該有多種類(lèi)別。因此對(duì)多種不同類(lèi)別孢壁蛋白采取一定方式合理命名，對(duì)后續(xù)功能研究具有重要意義。在本研究之前，JAROENLAK等［16］于2018年報(bào)道了EHP的第一個(gè)孢壁蛋白EhSWP1，它有含肝素結(jié)合基序和BAR結(jié)構(gòu)域，推測(cè)其可能參與EHP感染。通過(guò)序列分析，筆者發(fā)現(xiàn)EhSWP1與兔腦炎微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白EnP1屬于同類(lèi)蛋白，兩者相似性較高且都具有肝素結(jié)合基序和BAR結(jié)構(gòu)域［36］。此外，本研究也鑒定了一個(gè)EnP1樣孢壁蛋白基因EhEnP1，但EhEnP1蛋白不含肝素結(jié)合基序和BAR結(jié)構(gòu)域，其命名主要是基于EhEnP1與柑橘鳳蝶EnP1樣蛋白具有較高相似度。由此筆者認(rèn)為EnP1樣蛋白之間的生物學(xué)功能應(yīng)該存在明顯差異。鑒于目前對(duì)該類(lèi)蛋白生物學(xué)功能了解有限，還需隨著功能研究的深入，對(duì)該類(lèi)蛋白進(jìn)一步命名，避免因蛋白名稱(chēng)類(lèi)似而混淆不同種類(lèi)蛋白。由于EhSWP7和EhSWP12均能在各自BLASTP結(jié)果中找到高相似性的同源蛋白基因，因此這兩個(gè)孢壁蛋白命名較為合理。至于EhSWP26，其BLASTP結(jié)果中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)高相似性的已命名孢壁蛋白基因，根據(jù)未知蛋白常見(jiàn)命名方法，筆者依據(jù)其分子量大?。?6 kDa），暫命名為EhSWP26。目前EHP孢壁蛋白功能研究報(bào)道很少，筆者通過(guò)生物信息學(xué)分析，僅發(fā)現(xiàn)EhSWP26包含功能域，多數(shù)孢壁蛋白功能無(wú)法預(yù)測(cè)。因此，確切命名上述孢壁蛋白還需要更深入的功能研究。

本研究通過(guò)qRT-PCR方法，分析了在EHP感染對(duì)蝦中孢壁蛋白基因的表達(dá)特點(diǎn)，4個(gè)孢壁蛋白基因均在肝胰腺中表達(dá)量最高，表明EHP主要侵染肝胰腺組織。此外，研究還發(fā)現(xiàn)4個(gè)孢壁蛋白基因在胃和腸中也存在較低水平的表達(dá)，這與之前報(bào)道這2個(gè)組織也存在EHP感染的描述類(lèi)似［37-41］。雖然在鰓中也檢測(cè)到孢壁蛋白基因的表達(dá)，但與肝胰腺中相比，其表達(dá)量非常低，一般不認(rèn)為是EHP侵染的組織。在鰓中檢測(cè)到的原因可能是對(duì)蝦本身開(kāi)放的血淋巴循環(huán)系統(tǒng)攜帶一定量EHP或病原核酸所致。

其中i表示研究個(gè)體即西部12個(gè)省(區(qū)市)，t表示時(shí)間即從2003年到2016年，xit表示除了金融發(fā)展因素外對(duì)地區(qū)經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)有較大影響的控制變量,包括消費(fèi)、投資、政府支出、對(duì)外依存度和社會(huì)勞動(dòng)力。FDit是與區(qū)間相關(guān)的依賴(lài)變量即金融發(fā)展水平。HCit是門(mén)檻變量即人力資本存量，因?yàn)槿肆Y本水平對(duì)地區(qū)經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)也有重要影響，在這里也把它加入控制變量之中。γ是研究中待估計(jì)的門(mén)檻值。I(°)為指標(biāo)函數(shù)，其相應(yīng)的括號(hào)內(nèi)條件成立時(shí)取值為1，否則取值為0。μi為不隨時(shí)間變化的個(gè)體效應(yīng)，eit為隨機(jī)干擾項(xiàng)。進(jìn)一步地，(1)式可以轉(zhuǎn)化為：

除探明了EHP侵染各組織的情況，本研究還通過(guò)比較4個(gè)孢壁蛋白基因在感染組織中表達(dá)水平，明確了EhSWP12是EHP孢壁蛋白主要組分，推測(cè)其可能在EHP侵染過(guò)程中發(fā)揮重要作用，這為EHP侵染機(jī)制等功能研究奠定了基礎(chǔ)。雖然利用傳統(tǒng)的蛋白鑒定方法（如雙向電泳和質(zhì)譜鑒定）研究結(jié)果更為直接、可靠，但在不易獲取高純度孢子的條件下，利用孢壁蛋白基因表達(dá)水平間接預(yù)測(cè)EHP蛋白構(gòu)成情況，可能是探索EHP孢壁蛋白含量和組成的一種更為有效的手段。盡管存在轉(zhuǎn)錄后修飾等過(guò)程，對(duì)得到孢壁蛋白的真實(shí)組成情況還存在不確定性，但本研究至少提供了一些有價(jià)值的信息，如EhSWP12為EHP高含量孢壁蛋白。此外，EHP感染周期很長(zhǎng)且感染對(duì)蝦死亡率不高，暗示在EHP感染中后期，對(duì)蝦體內(nèi)EHP基因的表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，也意味著EHP蛋白表達(dá)和組成相對(duì)平衡，這表明利用EHP感染中后期孢壁蛋白基因的表達(dá)水平推測(cè)其蛋白組成情況具有可行性。

4 小結(jié)

本研究對(duì)EHP的4個(gè)假定孢壁蛋白基因進(jìn)行了序列分析和鑒定，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)的4個(gè)孢壁蛋白彼此相似性很低，應(yīng)屬于4個(gè)不同的孢壁蛋白基因；它們與泰國(guó)當(dāng)?shù)谽HP相應(yīng)孢壁蛋白基因的序列一致且不易受環(huán)境影響發(fā)生突變，表明上海本地和泰國(guó)當(dāng)?shù)貙?duì)蝦EHP很可能屬于同一個(gè)種。表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，4個(gè)孢壁蛋白基因均在肝胰腺中表達(dá)水平最高，且EhSWP12表達(dá)水平明顯高于其他3個(gè)基因，表明EHP主要侵染肝胰腺組織，EhSWP12是EHP孢壁蛋白主要組分，很可能在EHP侵染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究為后期開(kāi)展EHP病原生物學(xué)及感染機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)。