黃宣運，楊光昕，史永富，黃冬梅，葉洪麗，蔡友瓊

（1.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（上海），上海 200090；3.上海海洋大學，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306；4.上海海洋大學，水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306）

亞甲基藍（methylene blue，MB）是一種吩噻嗪類化合物［1］，最早被用于工業(yè)染色和治療細菌性瘧疾。近年來，亞甲基藍被用于替代禁用藥物孔雀石綠［2］防治水產(chǎn)動物養(yǎng)殖過程中的水霉病［3］。與孔雀石綠相比，亞甲基藍毒性較低，但依然存在副作用［4-5］。目前，歐盟規(guī)定禁止亞甲基藍用于動物食品生產(chǎn)過程，日本規(guī)定動物食品中亞甲基藍最高殘留限量為10μg·kg-1［6］。因此，建立一種簡單、快捷的檢測亞甲基藍的方法顯得十分必要。

現(xiàn)有檢測動物源性食品中亞甲基藍殘留的方法主要有儀器法和免疫學分析法，儀器法主要包括紫外分光光度法［7-8］、液相色譜法［9］、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［10］等。與儀器法相比，免疫學分析法具有靈敏、快速、簡單等優(yōu)點，更適合用于水產(chǎn)品藥物殘留的初步篩查［11-13］。目前，基于免疫學原理開發(fā)的快速檢測方法主要針對氟喹諾酮類［14-15］、孔雀石綠［16］等指標，對于亞甲基藍尚未有相關(guān)研究報道。

本研究以亞甲基藍代謝物天青C（azure C）作為亞甲基藍的半抗原，采用戊二醛法合成亞甲基藍人工抗原，并制備和鑒定了亞甲基藍鼠源多克隆抗體，以期為下一步制備亞甲基藍單克隆抗體及開發(fā)快速檢測試劑盒提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

亞甲基藍，含量≥98.9%，購自USP美國藥典標準品公司；天青A，含量≥99.0%，購自山東西亞化學工業(yè)有限公司；天青B，含量≥95.1%，購自北京正翔科技有限公司；天青C，含量≥90%，購自Sigma公司；牛血清白蛋白（bovine serum album，BSA）、雞卵血清白蛋白（ovalbumin，OVA）、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（酶標二抗）、96孔酶標板、50%戊二醛（GA），購自生工生物工程（上海）公司；弗氏完全、不完全佐劑，購自Sigma公司；BALB／c小鼠購自上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司，許可證號為：SCXK（滬）2017-0012。本實驗動物飼養(yǎng)于華東師范大學閔行校區(qū)實驗動物中心，許可證號為：SYXK（滬）2015-0011。

本實驗所用其他生物試劑純度均大于98%，化學試劑均為分析純及以上純度。

Multifuge X3R離心機（賽默飛世爾（上海）儀器公司），U4100紫外分光光度計（株式會社日立制作所，日本），Multiskan MK3酶標儀（賽默飛世爾（上海）儀器公司）。

1.2 亞甲基藍人工抗原的合成

參考滕海英等［17］的方法，對人工抗原進行合成。稱取3.5 mg天青C溶解于2 mL磷酸鹽緩沖溶液（PBS 0.01 mol·L-1，pH 7.2）中，加入50 μL 50% 戊二醛（GA）反應1 h。在室溫磁力攪拌下，逐滴加入0.85 mL 20 mol·L-1的BSA溶液，再加入1.1mL PBS緩沖液，反應24 h。將溶液轉(zhuǎn)移至處理好的透析袋中，并以PBS溶液為透析液在4℃透析3 d，每天更換透析液3～4次。透析后即為亞甲基藍人工抗原（azure C-BSA），4℃保持備用，其合成路線見圖1。azure C-VOA的制備方法與azure C-BSA一致，將OVA替換BSA即可。

1.3 亞甲基藍人工抗原的鑒定

1.3.1 紫外掃描鑒定

用PBS將BSA、OVA、天青C和人工抗原稀釋至適當濃度后，用紫外-可見分光光度計對其進行表征。

1.3.2 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MADLI-TOFMS）鑒定

人工抗原委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行鑒定。具體方法如下：取1μL樣品點至樣品靶上，自然干燥后，再取CHCA基質(zhì)溶液點至對應靶位上并自然干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰位置點標準品。在正離子模式下選擇線性方法對樣品測試分子量。通過比較偶聯(lián)蛋白、半抗原及人工抗原的分子量，計算偶聯(lián)比。

圖1 亞甲基藍人工抗原合成路線Fig.1 Synthetic route of MB artificial antigen

1.4 多克隆抗體制備

挑選4只健康的6周齡的BALB／c小鼠，暫養(yǎng)1周后，免疫前眼眶取血作為陰性血清。取2 mg·mL-1免疫原（azure C-BSA）與弗氏完全佐劑等量混合，腹腔注射小鼠，免疫劑量為0.2 mg。首次免疫后2周，免疫原與弗氏不完全佐劑混合乳化，腹腔注射。以后免疫不加佐劑，分別在第3周、第4周、第5周各免疫一次，采用尾部靜脈注射免疫。最后一次免疫后，摘眼球取血，離心分離血清后凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 多克隆抗體的鑒定

1.5.1 抗體效價測定

采用間接酶聯(lián)免疫吸附檢測方法（ELISA）檢測抗體效價。將包被原稀釋400倍后加入酶標板中，每孔100μL，37℃包被1 h。棄去廢液，PBST（0.5% Tween-20）洗板3次（以下簡稱洗板），拍干。每孔加入200μL的PBS（5%的牛奶）封閉過夜，洗板，拍干，每孔加入100μL倍比稀釋抗體，同時設置空白和陰性對照，37℃，1 h。洗板，拍干后加入羊抗鼠酶標二抗（1∶2 000稀釋）37℃，0.5 h，洗板，拍干。每孔添加新配置的TMB顯色液100μL，37℃，10min，加入2M H2SO450μL終止反應，用酶標儀在450 nm讀數(shù)。以上清液吸光度為陰性值吸光度2倍（即P／N≥2.0）判斷為陽性。

1.5.2 抗體靈敏度測定

利用方陣法，以OD450為1.0時，作為抗原抗體最佳反應濃度，配置不同濃度MB標準品，用間接競爭ELISA測不同濃度MB條件下的OD450，采用四參數(shù)Logisitic擬合標準曲線，公式為y=A2+（A1-A2）/［1+（X/X0）P］，其中A1為最大吸光度對應的濃度，A2為最小吸光度對應的濃度，X0為半數(shù)抑制濃度（IC50）對應的MB濃度，P為斜率。

1.5.3 抗體特異性測定

以亞甲基藍代謝物天青A、天青B、天青C、孔雀石綠和結(jié)晶紫等作為競爭物，用間接競爭ELISA測定多抗對各競爭物的半數(shù)抑制濃度（IC50）。交叉反應率（cross reactivity，CR）為MB的IC50與各競爭物的IC50的百分比。

2 結(jié)果與討論

2.1 半抗原的選擇

亞甲基藍是一個小分子化合物，其分子量只有319.9 Da，必須連接大分子物質(zhì)，如BSA、OVA和鑰孔血藍蛋白（KLH）等才能夠刺激機體產(chǎn)生抗體［18］。如圖2所示，MB沒有直接與蛋白質(zhì)連接的功能基團（羧基和氨基），除了對MB進行化學改造接入連接功能基團外，利用結(jié)構(gòu)類似物替代目標物作為半抗原，是一種最為簡便的策略［19］。對于亞甲基藍而言，其代謝物天青A或天青C不僅結(jié)構(gòu)與其類似，而且有連接蛋白質(zhì)的氨基基團，在本研究中選取天青C作為半抗原。

2.2 亞甲基藍人工抗原的鑒定

2.2.1 紫外掃描鑒定

紫外掃描是鑒定人工抗原是否偶聯(lián)成功最簡單有效的方法［20］。在250～400 nm波長條件下，對天青C、BSA、OVA和人工抗原進行掃描，結(jié)果如圖3所示，天青C、BSA、OVA、azure C-BSA和azure C-OVA的最大吸收峰分別為292 nm、278 nm、279 nm、260 nm和266 nm，與BSA和OVA相比較，人工抗原的最大吸收峰發(fā)生了藍移，證明亞甲基藍人工抗原制備成功。

2.2.2 MADLI-TOFMS鑒定

利用MADLI-TOF MS對BSA、OVA、azure CBSA、azure C-OVA的分子量進行鑒定，結(jié)果如圖4所示，BSA的分子量為66 330.2 Da，azure CBSA分子量為74 134.2 Da。BSA上連接1個天青C 分子，分子量增加為249.7（Mr，azureC-Mr，H2O=277.7-18=249.7），因此azure C-BSA的偶聯(lián)比約為31∶1，同理azure C-OVA的偶聯(lián)比約為52∶1。

圖2 不同化合物的分子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 M olecular structure formula of different com pounds

2.3 多克隆抗體鑒定

2.3.1 抗體效價測定

最后一次免疫后，用ELISA測定血清效價，以陽性血清的OD450≥陰性對照的2倍作為血清的效價判斷依據(jù)。從表1可以看出，4只小鼠均產(chǎn)生了抗體，效價均在1.6×104以上，其中2號小鼠效價最高，選取該抗體進行后續(xù)競爭實驗。

圖3 人工抗原紫外掃描圖譜Fig.3 UV scanning spectrum of artificial antigen

圖4 BSA（A）、azure C-BSA（B）、OVA（C）和azure C-OVA（D）質(zhì)譜圖Fig.4 MADLI-TOF MS spectrogram of BSA（A），azure C-BSA（B），OVA（C）and azure C-OVA（D）

2.3.2 抗體靈敏度

經(jīng)方陣實驗優(yōu)化篩選，MB間接競爭ELISA測定最佳工作條件為包被原稀釋400倍，包被酶標板；抗體稀釋2 000倍；酶標二抗稀釋2 000倍，反應時間為0.5 h。按上述實驗條件測定抗體的靈敏度，利用Origin 16.0對測定結(jié)果進行四參數(shù)擬合，得到曲線方程為y=0.27+0.76/［1+（x/43.9）1.67］（圖5），IC50值為43.9 ng·mL-1。

2.3.3 抗體特異性

通過優(yōu)化的間接競爭ELISA法測定了9種物質(zhì)與抗體的交叉反應。結(jié)果顯示（表2）：抗體與目標物結(jié)構(gòu)非常接近的天青A、天青B和天青C均有交叉反應，交叉反應率（CR）分別為127.6%、84.7%和138.1%。而與水產(chǎn)品中常見的其他藥物幾乎不存在交叉反應（CR＜0.01%）。由此說明，該抗體不僅可以高特異性地識別目標物（亞甲基藍），而且能夠識別與其結(jié)構(gòu)相似的代謝物（天青A、天青B和天青C），這為下一步開發(fā)亞甲基藍及其代謝物快速檢測試劑盒奠定了基礎。

圖5 亞甲基藍間接競爭ELISA方法標準曲線Fig.5 Standard ELISA inhibition curve of MB

表1 多克隆抗體效價測定Tab.1 Titers of polyclone antibody

3 小結(jié)

本實驗以亞甲基藍代謝物天青C作為亞甲基藍半抗原，成功合成了亞甲基藍人工抗原，免疫小鼠后，獲得的多克隆抗體效價均在16 000以上，其中2號小鼠的多抗血清靈敏度最高，IC50為43.9 ng·mL-1，與天青A、天青B和天青C均有交叉反應，與水產(chǎn)品中常見其他藥物幾乎不存在交叉反應，說明該抗體特異性良好，為下一步制備亞甲基藍單克隆抗體及開發(fā)免疫學快速檢測方法奠定了基礎。