賀軍與 尹順瓊 陳云瓊 熊靜蕾 王衛(wèi)斌 周鴻斌 陳 梅 王夢(mèng)玥 陳升位

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院, 云南昆明 650201

自“綠色革命”以來, 全球種植的小麥品種中有 90%含有矮稈和半矮稈基因[1-5]。迄今為止, 已報(bào)道的矮稈和半矮稈基因超過 25個(gè), 但可用于小麥育種的矮稈基因局限于Rht-B1b、Rht-D1b、Rht8和Rht9[6-7]。矮稈基因Rht-B1b、Rht-D1b和Rht8在降低小麥株高時(shí)對(duì)其他性狀無顯著不良影響, 且Rht-D1b、Rht8和Rht9可顯著增加穗粒數(shù)[8-12]。李杏普等[13]發(fā)現(xiàn)Rht10和Rht12的降稈作用大于Rht8, 但其株系的地上部分生物量低于Rht8株系。王清海等[14]研究發(fā)現(xiàn)Rht14、Rht16和Rht18的降稈效應(yīng)分別為47.3%、39.9%和36.0%。攜帶Rht14、Rht16和Rht18的矮稈株系的小穗小花數(shù)變化不大, 但穗長(zhǎng)變長(zhǎng)。Rht5在降低小麥株高的同時(shí)會(huì)減少每穗小穗數(shù)和穗粒數(shù)[15]。前人研究表明, 大多數(shù)小麥推廣品種攜帶的矮稈基因?yàn)镽ht-B1b、Rht-D1b和Rht8[3-6,16-17], 可有效利用的矮稈親本不足, 育成品種遺傳背景狹窄。創(chuàng)制新突變體是解決該問題的有效策略。本文采用甲基磺酸乙酯(Ethyl methyl sulfonate, EMS)誘變‘云麥 53’ (國審品種)成熟種子, 通過誘變植株的連續(xù)3年套袋自交成功獲得了一批株高、小穗密度和小花數(shù)等性狀不同的候選突變體?；谶B續(xù)2年的田間觀察和常見矮稈基因的12個(gè)特異性分子標(biāo)記檢測(cè)鑒定了26株矮稈突變株, 分析了26個(gè)突變體的株高差異及其與穗長(zhǎng)、小穗數(shù)和小穗密度等農(nóng)藝性狀的遺傳關(guān)聯(lián)性,評(píng)估了矮稈突變體的育種價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

誘變親本‘云麥 53’由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院糧食作物研究所提供, 突變體由課題組創(chuàng)制。所有材料由課題組繁育并保存。

1.2 試驗(yàn)材料的種植及取樣

1.2.1 材料誘變和繁育 將 15,000?！汽?53’種子置于三角瓶中, 用pH 8.0的0.05 mol L-1磷酸緩沖液(PBS)震蕩浸泡4 h, 再用0.6% EMS室溫震蕩浸泡16 h, 然后用自來水沖洗4 h。誘變種子及其后代均播種于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆明市盤龍區(qū)試驗(yàn)教學(xué)農(nóng)場(chǎng)。分別套袋自交M1、M2和M3候選突變材料, 按單株收獲種子。

1.2.2 農(nóng)藝性狀調(diào)查 按隨機(jī)排列種植試驗(yàn)材料, 每個(gè)材料種植1行, 5行后種植1行誘變親本。行距20cm, 株距5 cm, 3次重復(fù)。其他田間管理措施與常規(guī)大田管理一致。于2018—2019年度和2019—2020年度分別在開花期調(diào)查穗長(zhǎng)、小穗數(shù)和小花數(shù), 待種子成熟后調(diào)查株高、平均節(jié)間長(zhǎng)和節(jié)間數(shù)。M2代調(diào)查單株性狀, M3株系隨機(jī)調(diào)查5株, 以5株均值代表株系性狀的表型值。按下列公式計(jì)算小穗密度、平均節(jié)間長(zhǎng)。

小穗密度=單株小穗數(shù)/單株穗長(zhǎng)

平均節(jié)間長(zhǎng)=單株節(jié)間長(zhǎng)/單株節(jié)間數(shù)

1.2.3 矮稈基因的分子標(biāo)記檢測(cè) 于拔節(jié)期剪取M2單株及其誘變親本的幼嫩葉片, 置于-80℃保存?zhèn)溆?。采用CTAB法提取基因組 DNA。采用 Ellis等[18-19]報(bào)道的BF-WR1、BF-MR1、BF-WR2、BF-MR2、WMC317、BARC102、BARC151、WMC410和 WMS577, 以及XBARC3[20]、Xgwm261[20]和 WMC503[21]特異性標(biāo)記檢測(cè)突變體攜帶的矮稈基因(表1), 其中BF-WR1和BF2-WR2為野生型(株高正常)基因標(biāo)記, 其余標(biāo)記為突變型(矮稈)基因標(biāo)記。由上海生工生物技術(shù)有限公司合成所有引物。參照前人報(bào)道的PCR擴(kuò)增條件擴(kuò)增各標(biāo)記, 采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。上述標(biāo)記均重復(fù)檢測(cè)3次, 3次檢測(cè)結(jié)果一致。

1.2.4 農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析 基于SPSS 25.0軟件的t測(cè)驗(yàn)、聚類、方差、多重比較和相關(guān)分析模塊默認(rèn)參數(shù), 分析突變體株高差異及其與穗長(zhǎng)、小穗數(shù)和小穗密度等性狀的遺傳關(guān)聯(lián)性。顯著和極顯著水平分別為5%和1%。

表1 矮稈基因及其特異性標(biāo)記的引物序列和片段長(zhǎng)度Table 1 Specific molecular markers of dwarf genes and the fragment length and primers sequence of the markers

2 結(jié)果與分析

2.1 候選矮稈突變體的農(nóng)藝性狀差異分析

本研究采用t測(cè)驗(yàn)檢測(cè)了‘云麥53’與33個(gè)候選材料的株高(M2單株表型值, M3株系均值)差異(表2)。結(jié)果表明,mutant 2、mutant 4、mutant 5等 26個(gè)材料與‘云麥 53’的株高存在顯著或極顯著差異, 為矮稈突變體。在26個(gè)矮稈突變體中mutant 16、mutant 23、mutant 25和mutant 26的株高值低于20 cm, mutant 18、mutant 19和mutant 20的株高值大于40 cm, 其余19個(gè)突變體的株高值介于20～40 cm之間(圖1)。與‘云麥 53’相比, mutant 4、mutant 5 和 mutant 7等18個(gè)突變體的穗長(zhǎng)顯著或極顯著縮短; mutant 4、mutant 5和 mutant 7等 11個(gè)突變體的小穗密度顯著或極顯著增加;mutant 18的小花數(shù)顯著減少; mutant 5、mutant 11、mutant 14等13個(gè)突變體的平均節(jié)間長(zhǎng)顯著或極顯著縮短; mutant 5、mutant 10和mutant 14等6個(gè)突變體的節(jié)間數(shù)顯著或極顯著減少(表2 和圖2)。mutant 7、mutant 12、mutant 24、mutant 28和mutant 29的節(jié)間數(shù)在M2和M3代中未發(fā)生分離, 均低于‘云麥53’的節(jié)間數(shù), 但因方差為0、未做t測(cè)驗(yàn)。26個(gè)矮稈突變體攜帶株高、穗長(zhǎng)和小穗密度等多個(gè)突變性狀。

2.2 候選矮稈突變體的分子標(biāo)記檢測(cè)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證 26個(gè)矮稈材料, 本文采用前人報(bào)道的矮稈基因的12個(gè)特異性標(biāo)記檢測(cè)了33個(gè)候選材料及其誘變親本。結(jié)果表明, 在‘云麥53’中未檢測(cè)到BF-MR1 (Rht-B1b)、BF2-WR2 (Rht-D1a)、BARC102 (Rht5)和 WMS577 (Rht13)標(biāo)記, 但檢測(cè)到其他9個(gè)標(biāo)記。與‘云麥53’相比, mutant 1等32個(gè)候選突變體的BARC151 (Rht9)標(biāo)記, mutant 2等5個(gè)候選突變體的Xgwm261 (Rht8)、WMC503 (Rht8)標(biāo)記均具有差異, 表明其Rht9和Rht8基因發(fā)生了突變。在33個(gè)候選突變體中, mutant 3與‘云麥53’的共有擴(kuò)增標(biāo)記較多(7個(gè)), mutant 11與‘云麥 53’僅有 2個(gè)共同擴(kuò)增標(biāo)記(表3和圖3),mutant 1、mutant 2、mutant 3、mutant 27 和 mutant 28 的Xgwm261 (Rht8)、WMC503 (Rht8)和 BARC151 (Rht9)均發(fā)生變異, 其中BARC151 (Rht9)標(biāo)記位點(diǎn)的突變頻率最高(表3)。

表3 ‘云麥53’和候選突變體中檢測(cè)到的矮稈基因Table 3 Dwarf genes detected in the genome of ‘Yunmai 53’ and candidate mutants

2.3 基于7個(gè)性狀的矮稈突變體聚類分析

基于株高、穗長(zhǎng)和小穗密度等7個(gè)性狀的聚類分析結(jié)果表明, 所有材料可聚為2個(gè)大類, 第1大類包括誘變親本,第2大類包括所有突變體(圖4)。第2大類可分為5個(gè)亞類,其中mutant 18和mutant 16分別聚為第1、2亞類, mutant 5、mutant 10和mutant 23等5個(gè)突變體為第3亞類, mutant 2、mutant 4和 mutant 6等 7個(gè)突變體為第 4亞類, 其余 12個(gè)突變體為第5亞類(圖4)。與‘云麥 53’相比, 5個(gè)亞類的突變體均表現(xiàn)植株矮化、穗長(zhǎng)和平均節(jié)間長(zhǎng)縮短,但其余4個(gè)性狀出現(xiàn)了分化。其中第1亞類突變體的小穗數(shù)和小花數(shù)極顯著減少, 但小穗密度和節(jié)間數(shù)沒有差異;第2～4亞類突變體的小穗密度極顯著增加, 小花數(shù)和節(jié)間數(shù)極顯著減少, 但小穗數(shù)沒有明顯變化(圖5)。在 5個(gè)亞類中, 第 1亞類突變體的小穗數(shù)和小花數(shù)降幅最大; 第 2亞類的株高、穗長(zhǎng)和平均節(jié)間長(zhǎng)的降幅和小穗密度的增幅最大, 第3亞類突變體的節(jié)間數(shù)降幅最大(圖5和附表1)。

2.4 突變農(nóng)藝性狀間的相關(guān)分析

基于26個(gè)突變體及其誘變親本的株高等7個(gè)性狀的二元相關(guān)和偏相關(guān)分析表明, 株高與穗長(zhǎng)、小穗密度和平均節(jié)間長(zhǎng)等 4個(gè)性狀的二元相關(guān)系數(shù)達(dá)到了顯著或極顯著水平, 但只有平均節(jié)間長(zhǎng)和節(jié)間數(shù)與株高偏相關(guān); 穗長(zhǎng)與小穗數(shù)、小穗密度和平均節(jié)間長(zhǎng)的二元相關(guān)系數(shù)達(dá)到了顯著或極顯著水平, 但只有小穗密度和平均節(jié)間長(zhǎng)與穗長(zhǎng)存在負(fù)偏相關(guān); 小穗數(shù)與小穗密度和小花數(shù)的二元相關(guān)和偏相關(guān)系數(shù)均達(dá)到了極顯著水平; 小穗密度與小花數(shù)和節(jié)間數(shù)的二元相關(guān)系數(shù)達(dá)到了顯著或極顯著水平,但偏相關(guān)系數(shù)不顯著; 雖然平均節(jié)間長(zhǎng)與節(jié)間數(shù)的二元相關(guān)系數(shù)不顯著, 但偏相關(guān)系數(shù)達(dá)到了顯著水平(表4)。上述結(jié)果表明, 26個(gè)突變體的株高與平均節(jié)間長(zhǎng)和節(jié)間數(shù)關(guān)聯(lián)遺傳, 其余4個(gè)性狀與植株矮化沒有遺傳關(guān)聯(lián)性。

3 討論

通過誘變親本和候選突變體連續(xù) 2個(gè)年度的株高比對(duì)分析, 作者發(fā)現(xiàn)了 26個(gè)矮稈突變體?；谇叭藞?bào)道的矮稈基因的12個(gè)特異性標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果表明26個(gè)矮化材料至少攜帶有2個(gè)矮稈基因標(biāo)記位點(diǎn)。雖然mutant 1、mutant 3和mutant 13等7個(gè)候選突變體中也檢測(cè)到了矮稈基因突變, 但植株偏高, 為(33.76±10.16)～(63.99 ±2.51) cm, 且與誘變親本‘云麥53’的株高沒有顯著差異。筆者認(rèn)為這可能是2個(gè)年份間的株高波動(dòng)降低了“t”值所致。在33個(gè)候選突變體中, 26個(gè)材料明顯矮化、且攜帶不同的矮稈突變基因, 因此可判定為矮稈突變體。

除株高外, 26個(gè)矮稈突變體還攜帶穗長(zhǎng)縮短、小花密度增加和節(jié)間數(shù)減少等不同突變性狀。通過分子檢測(cè)本研究發(fā)現(xiàn)26個(gè)突變體均攜帶與‘云麥53’不同的矮稈基因組合, 如mutant 11攜帶Rht5和Rht 12矮稈基因(可能還攜帶其他未被檢測(cè)的矮稈基因), mutant 2攜帶Rht-D1b、Rht4、Rht5等9個(gè)矮稈基因。通過推廣品種株高與穗長(zhǎng)、小穗數(shù)和穗粒數(shù)的關(guān)聯(lián)分析, 陳亮等[8-12]發(fā)現(xiàn)矮稈突變基因Rht-D1b、Rht8和Rht9可增加穗粒數(shù); 王清海等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)Rht8、Rht10、Rht12、Rht14、Rht16、Rht18等矮稈基因的效應(yīng)不同,Rht10和Rht12的降稈效應(yīng)大于Rht8的[3,5]; Baloch等[16]發(fā)現(xiàn)Rht14、Rht16和Rht18可增加穗長(zhǎng),Rht5可減少每穗小穗數(shù)。前人研究結(jié)果表明小麥矮稈基因?qū)λ腴L(zhǎng)、小穗數(shù)和穗粒數(shù)等性狀可能具有多效性,但在不同遺傳背景中矮稈基因的遺傳效應(yīng)不同。因此作者認(rèn)為是矮稈基因與穗長(zhǎng)、小穗密度和小花數(shù)等性狀的突變基因及其組合不同導(dǎo)致了26個(gè)突變體的農(nóng)藝性狀差異。

表4 不同突變性狀的二元相關(guān)和偏相關(guān)系數(shù)及其顯著性Table 4 Binary correlation, partial correlation coefficients and significances among the different mutant traits

本研究發(fā)現(xiàn)株高與平均節(jié)間長(zhǎng)和節(jié)間數(shù)、以及穗長(zhǎng)與小穗數(shù)、小穗數(shù)與小穗密度、小穗與小花數(shù)等性狀關(guān)聯(lián)遺傳, 該結(jié)果與前人報(bào)道的基本一致[22-32]。雖然株高降低后mutant 7等 3個(gè)突變體的小穗數(shù)和小花數(shù)增多(均未達(dá)到顯著水平), 其余突變體的穗長(zhǎng)縮短、小穗數(shù)和小花數(shù)減少、小穗密度增加, 但株高與穗長(zhǎng)等4個(gè)性狀的偏相關(guān)系數(shù)均未達(dá)到顯著水平。作者認(rèn)為該結(jié)果可能與本文研究所用材料大多為相同親本誘導(dǎo)的矮稈突變體有關(guān), 可能是矮稈基因及其組合的多效性較低或者矮稈與其他性狀的突變基因位點(diǎn)的連鎖強(qiáng)度較低導(dǎo)致了株高與穗長(zhǎng)、小穗數(shù)和小穗密度等性狀不能關(guān)聯(lián)遺傳。通過進(jìn)一步自交繁育,可望從26份矮稈突變體中篩選到適合不同育種需求的矮稈親本。

通過聚類分析, 作者發(fā)現(xiàn) 26個(gè)矮稈突變體可分為農(nóng)藝特性不同的5個(gè)亞類, 不同亞類間株高、穗長(zhǎng)和小穗數(shù)等農(nóng)藝性狀存在差異, 其中第2亞類和第3亞類的mutant 5、mutant 23和mutant 25等5個(gè)突變體株高不到20 cm, 均低于陸燕等的報(bào)道[12,17,33-35]。雖然株高較低, 但mutant 11、mutant 27和mutant 28等突變體的穗長(zhǎng)、小穗數(shù)和小花數(shù)沒有變化, 且節(jié)間數(shù)只是導(dǎo)致部分突變體矮化的因素之一, 因此上述材料可用于小麥矮化育種。除此之外, 26個(gè)突變體攜帶的株高、穗長(zhǎng)和小穗密度等突變性狀基因及其組合類型不同, 如mutant 16攜帶株高較低(13.61 cm±0.11 cm),穗長(zhǎng)(3.72 cm±0.02 cm)和平均節(jié)間長(zhǎng)(4.88 cm±0.62 cm)較短, 小穗密度(5.37±0.24)較高的基因組合; mutant 18具有植株偏高(44.08 cm±1.73 cm), 穗長(zhǎng)偏長(zhǎng)(7.08 cm±0.48 cm)小花數(shù)較少(33.25±0.25)的基因組合?；谏鲜鐾蛔凅w, 可望解析小麥株高及其構(gòu)成因素、小穗密度和小花數(shù)等性狀的遺傳機(jī)制。

附表1 ‘云麥53’類群和5個(gè)矮稈突變體亞類的方差分析結(jié)果Table S1 ANOVA result of ‘Yunmai 53’ and 5 subclasses dwarf mutants