唐 鑫 李圓圓 陸俊杏 張 濤

重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 重慶 401331

油菜作為世界上重要的油料作物之一, 是食用油和生物燃料的重要來源[1]。為了滿足日益增長的需求, 提高油菜產(chǎn)量是育種工作急需解決的問題和長期目標(biāo)。雄性不育植物是雜交育種所必需的育種材料, 能利用雜種優(yōu)勢來提高作物產(chǎn)量, 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重要的經(jīng)濟(jì)價值[2-3]。

細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)和細(xì)胞核雄性不育(genic male sterility, GMS)已被廣泛應(yīng)用于油菜雜種優(yōu)勢的開發(fā)與利用, 其中, GMS類型主要分為受光周期影響的光敏型雄性不育(photoperiod-sensitive genic male sterility, PGMS)和受溫度控制的溫敏型雄性不育(thermo-sensitive genic male sterility, TGMS)[4-5]。由于大多數(shù) P/TGMS由隱形核基因控制, 雄性不育基因容易遺傳, 可以用作父本, 具有恢復(fù)源廣、細(xì)胞質(zhì)來源豐富等優(yōu)點, 被認(rèn)為是兩系雜交育種的高效系統(tǒng)[6]。目前, 已發(fā)現(xiàn)的甘藍(lán)型油菜PGMS類型主要有H90S、N196S和501-8S;TGMS類型主要有Xiangyou 91S、Xiangyou 402S、Huiyou 50S、373S、SP2S、104S、TE5A 等[7]。自首次報道水稻光敏不育系 58S, 并成功用于水稻兩系雜交育種以來[8],在禾本科[9-11]、豆科[12]和十字花科[13]等其他植物中也發(fā)現(xiàn)了光溫敏雄性不育系材料。近年來, 甘藍(lán)型油菜雄性不育材料花藥的細(xì)胞學(xué)特征顯微觀察已得到廣泛的關(guān)注。Sun等[7]研究發(fā)現(xiàn), 373S花粉敗育是由于小孢子在發(fā)育過程中出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)濃縮、胞外壁不規(guī)則、單核后期絨氈層降解異常引起的。李可琪等[14]和 Yan等[15]觀察TE5A的花藥切片發(fā)現(xiàn), 在減數(shù)分裂期花粉母細(xì)胞同源染色體不能配對、凝聚形成二分體和四分體, 導(dǎo)致小孢子發(fā)育受阻, 最終引起敗育。Yu等[16]對SP2S細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn), 絨氈層細(xì)胞在減數(shù)分裂早期高度空泡化變大, 小孢子無法從四分體釋放出來, 并伴隨胼胝質(zhì)降解異常, 最終導(dǎo)致敗育?？傊?植物雄性不育是一個極其復(fù)雜的過程, 敗育時期、方式多種多樣, 敗育特征和程度也各不相同。

前期研究表明[17], 160S育性受環(huán)境溫度影響, 20℃以下可育(160S-MF), 25℃以上不育(160S-MS); 溫度是影響育性的關(guān)鍵因素, 隨著溫度的升高, 花粉活力、角粒數(shù)和結(jié)角率隨之降低; 研究還表明, 160S具有恢復(fù)源廣泛、較強的一般配合力、雜種優(yōu)勢明顯等優(yōu)點, 可以應(yīng)用培育雜交油菜新品種。前人僅僅開展了溫度對不育系160S育性轉(zhuǎn)化和雜種優(yōu)勢等方面的研究, 但其敗育時期、原因和細(xì)胞學(xué)特征尚未報道。本研究通過觀察甘藍(lán)型油菜160S-MF和160S-MS形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)差異, 明確160S-MS敗育的時期和細(xì)胞學(xué)特征, 初步解析其敗育原因, 旨在為深入研究其雄性不育內(nèi)在分子調(diào)控機理以及在雜種優(yōu)勢的利用等方面奠定基礎(chǔ), 同時對甘藍(lán)型油菜兩系雜交育種具有指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

甘藍(lán)型油菜溫敏細(xì)胞核雄性不育系160S種子由重慶師范大學(xué)油用牡丹種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點實驗室保存。在室溫(20℃)條件下播種, 10 d后將長勢良好的幼苗移栽至直徑20 cm的花盆中, 一盆一株苗, 春化處理后, 分別放置在溫度為 15℃和 28℃的冷光源植物生長箱(賽福ZRX-1100E)中培養(yǎng), 光照16 h/黑暗8 h, 濕度50%。

1.2 取材與固定

在初花期, 取160S-MF、160S-MS不同大小花蕾的花藥壓片, 用 1%醋酸洋紅染色, 在熒光顯微鏡(SOPTOP RX50)下觀察小孢子發(fā)育時期。采樣后, 將樣品分組放入FAA固定液(50%酒精90 mL、冰醋酸5 mL、37%甲醛5 mL)中, 真空干燥箱(SKK ZK-50)抽真空, 直至花蕾完全沉入瓶底, 室溫固定24 h, 70%乙醇4℃冰箱存放備用。

1.3 花器形態(tài)特征觀察

分別采集160S-MF、160S-MS盛花期的30朵花朵, 用游標(biāo)卡尺測量花冠徑、花瓣長、花瓣寬、雌蕊長、四強雄蕊長、二弱雄蕊長、四強花藥長、花絲長和花柄長等花器性狀。采用Microsoft Excel 2007處理數(shù)據(jù), 用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0分析所測數(shù)據(jù)。體式顯微鏡(勵揚LY-WN-OPLENIC)觀察花朵形態(tài)并照相。

1.4 花藥石蠟切片觀察

采用常規(guī)石蠟切片方法, 用70%、85%、95%和100%梯度乙醇溶液脫水, 二甲苯透明, 石蠟浸蠟和包埋, 切片厚度6～8 μm, 郝伯特配方粘片劑粘片, 蘇木精-伊紅染色,中性樹膠封片, 待膠完全凝固后, 在熒光顯微鏡(SOPTOP RX50)下觀察并照相。

1.5 TUNEL染色

采用Dead End Fluorometric TUNEL System (Promega)試劑盒方法檢測細(xì)胞凋亡?；ㄋ幨炃衅枚妆矫撓?梯度乙醇脫水洗滌, PBS洗滌5 min, 4%多聚甲醛溶液固定15 min, 然后用20 μg mL-1蛋白酶K室溫孵育10 min,加rTdT孵育緩沖液(Equilibration Buffer, Nucleotide Mix,rTdT)對核 DNA片段進(jìn)行脫氧三磷酸尿苷缺口末端標(biāo)記,37℃避光孵育60 min。用碘化丙啶(PI, Sigma)復(fù)染。使用熒光顯微鏡(SOPTOP RX50)觀察。在(520 ± 20) nm處觀察熒光素的綠色熒光(TUNEL信號); 在＞620 nm處觀察碘化丙啶的紅色熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1 160S-MF和160S-MS花朵形態(tài)學(xué)分析

對比觀察160S-MF (15℃)、160S-MS (28℃)花朵的形態(tài)發(fā)現(xiàn), 兩者在外觀形態(tài)上有明顯差別, 160S-MF花朵較大(圖1-A), 雄蕊長度高于雌蕊(圖1-B), 花藥呈黃色, 形態(tài)飽滿, 能正常開裂, 釋放出有活性的花粉; 160S-MS能正常開花, 花朵呈淺黃色(圖1-D), 雄蕊 6枚, 四強二弱,但花朵整體偏小, 雄蕊長度不及雌蕊1/2 (圖1-E), 花藥褐黃色呈小三角形, 干癟萎縮, 無花粉。160S-MS的花器形態(tài)也發(fā)生顯著變化(表1)。在所測的花器特征參數(shù)中, 除雌蕊和萼片外其余花器官都達(dá)到極顯著水平。與160S-MF相比, 160S-MS花瓣長度、寬度顯著性變小、變窄(圖1-C, F), 雄蕊(四強雄蕊和二弱雄蕊)明顯退化, 花藥和花絲極顯著短于可育株的花絲和花藥。

表1 160S-MF和160S-MS的花器性狀比較Table 1 Comparison of the flower traits between 160S-MF and 160S-MS (mm)

2.2 160S-MF和160S-MS小孢子形態(tài)觀察分析

通過對 160S-MF、160S-MS不同發(fā)育階段小孢子發(fā)育的細(xì)胞學(xué)觀察, 研究了花藥敗育的特征, 如圖所示, 跟大多數(shù)植物一樣, 160S-MF花粉母細(xì)胞經(jīng)2次減數(shù)分裂后形成四分體結(jié)構(gòu)(圖2-A), 周圍有胼胝質(zhì); 隨著胼胝質(zhì)解體后, 進(jìn)入單核早期(圖2-B), 四分體慢慢釋放出圓形的單個小孢子, 形態(tài)較小, 未明顯觀察到細(xì)胞核; 單核靠邊期(圖2-C), 明顯能觀察到細(xì)胞核移向細(xì)胞一側(cè), 此時的細(xì)胞核形態(tài)清晰, 整個細(xì)胞呈三瓣狀; 之后, 隨著小孢子繼續(xù)發(fā)育, 細(xì)胞核經(jīng)一次有絲分裂(圖2-D), 形成一大一小2個細(xì)胞核, 這時進(jìn)入雙核期, 營養(yǎng)核較大位于細(xì)胞中央, 靠近細(xì)胞壁一側(cè)較小的細(xì)胞核為生殖核; 小孢子繼續(xù)發(fā)育至成熟期(圖2-E), 花粉粒染色后整體顏色較深, 細(xì)胞核不能明顯辨別, 形態(tài)飽滿接近圓形。對160S-MS花藥染色壓片, 并未觀察到小孢子或者花粉粒(圖2-F), 表明花藥很有可能在小孢子形成前就已敗育。

2.3 160S-MF和160S-MS花藥細(xì)胞學(xué)觀察

對 160S-MF花藥切片觀察發(fā)現(xiàn), 在造孢時期, 造孢母細(xì)胞緊密地排列在藥室中央, 細(xì)胞核清晰可見, 形態(tài)呈不規(guī)則多邊形(圖3-A); 隨著花藥的發(fā)育, 造孢母細(xì)胞間稍微分開, 此時花藥壁由表皮、藥室內(nèi)壁、中層組成, 絨氈層的發(fā)育不是很清楚(圖3-B); 進(jìn)入花粉母細(xì)胞時期,花粉母細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育, 體積變大, 形狀呈橢圓形, 絨氈層細(xì)胞整齊地排列在花藥壁最內(nèi)層, 呈長方形, 清晰可見(圖3-C); 減數(shù)分裂期(圖3-D), 有的花粉母細(xì)胞有兩團(tuán)染色質(zhì), 表明其在進(jìn)行核分裂, 此時, 絨氈層細(xì)胞處于雙核狀態(tài); 四分體時期(圖3-E), 小孢子呈四面體型, 絨氈層開始出現(xiàn)降解趨勢; 小孢子細(xì)胞核靠近細(xì)胞一側(cè), 此時進(jìn)入單核晚期, 小孢子的花粉壁開始增厚(圖3-F); 雙核期的小孢子細(xì)胞壁逐漸加厚且趨于圓球形, 絨氈層持續(xù)降解(圖3-G); 成熟花粉期, 絨氈層不復(fù)存在, 花粉粒呈橢圓形, 形態(tài)飽滿, 染色后變深(圖3-H), 4個花粉囊呈蝴蝶型, 花粉囊開裂, 釋放出花粉(圖3-I)。

對 160S-MS花藥切片觀察發(fā)現(xiàn), 花藥也能分化形成蝴蝶型排列的4個花粉囊(圖4-A)。160S-MS在造孢時期和花粉母細(xì)胞時期與160S-MF無明顯差異(圖4-B, C), 造孢細(xì)胞和花粉母細(xì)胞發(fā)育均正常, 此時組成花藥壁的各組織結(jié)構(gòu)在形態(tài)和發(fā)育也無異常。減數(shù)分裂期(圖4-D, E),160S-MS花藥絨氈層發(fā)育出現(xiàn)異常, 盡管絨氈層為雙核細(xì)胞, 但與同一時期的160S-MF花藥絨氈層相比形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化, 細(xì)胞排列不整齊, 空泡化, 出現(xiàn)解體, 花藥開始出現(xiàn)敗育現(xiàn)象。減數(shù)分裂期完成之前, 絨氈層全部解體(圖4-F), 花粉母細(xì)胞也逐漸解體, 最終剩下空花粉囊。

2.4 TUNEL染色分析

在植物花藥中, 絨氈層降解被認(rèn)為是細(xì)胞程序性死亡(programmed cell dead, PCD)的結(jié)果, 其特征是細(xì)胞核DNA的斷裂。為進(jìn)一步研究160S-MS花藥絨氈層發(fā)育的異?，F(xiàn)象, 本研究使用TUNEL法觀察絨氈層細(xì)胞凋亡情況(圖5)。對160S-MF、160S-MS不同發(fā)育階段的花藥切片進(jìn)行 TUNEL染色觀察分析表明, 在花粉母細(xì)胞時期,160S-MF、160S-MS花藥絨氈層細(xì)胞的細(xì)胞核均為TUNEL陰性(圖5-A, B), 表明該階段絨氈層細(xì)胞發(fā)育正常; 減數(shù)分裂期, 160S-MF并未檢測到絨氈層凋亡信號(圖5-C), 相比之下, 160S-MS花藥絨氈層細(xì)胞在減數(shù)分裂期檢測到綠色熒光信號(圖5-D), 表明其絨氈層核DNA斷裂, 細(xì)胞開始凋亡; 隨著花藥發(fā)育, 綠色熒光信號越強烈(圖5-E), 最終只剩下空的花粉囊。四分體時期(圖5-F),160S-MF花藥絨氈層細(xì)胞核才出現(xiàn)微弱綠色熒光信號,絨氈層開始降解, 分泌小孢子從四分體釋放出來所需的物質(zhì), 并且熒光信號持續(xù)到雙核期(圖5-G)。表明160S-MS花藥絨氈層細(xì)胞在減數(shù)分裂期提前凋亡。

3 討論

在本研究中, 160S-MS雄蕊明顯退化, 花絲變短, 這些形態(tài)特征與大多數(shù)溫敏甘藍(lán)型油菜雄性不育材料相同。對 160S-MS醋酸洋紅染色未觀察到小孢子或者花粉粒,說明 160S-MS敗育徹底, 由于雌蕊發(fā)育正常, 可以正常授粉。因此, 不育系 160S可以用于油菜兩系育種, 培育新型雜交油菜品種。

在花粉發(fā)育過程中, 任何階段的異常都會引起雄性不育, 敗育發(fā)生時期和方式是多樣的[18-19]。余鳳群等[20]根據(jù)甘藍(lán)型油菜雄性不育系花藥敗育時期和方式, 將其敗育分為無花粉囊型不育系、花粉母細(xì)胞敗育型不育系、單核敗育型不育系3類。本研究發(fā)現(xiàn), 不育系160S花藥在減數(shù)分裂時期出現(xiàn)異常, 屬于花粉母細(xì)胞敗育型不育系?；ǚ勰讣?xì)胞不能完成減數(shù)分裂, 無法形成正常的四分體結(jié)構(gòu), 這一敗育特征與 TE5A[14-15]敗育現(xiàn)象非常相似。160S-MS花藥絨氈層在減數(shù)分裂時期出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和形態(tài)出現(xiàn)異常, 細(xì)胞空泡化, 伴隨提前解體, 然而, 不育系TE5A絨氈層發(fā)育正常。從絨氈層發(fā)育層面看, 160S-MS與373S[7]、SP2S[16]和Huiyou 50S[21]都出現(xiàn)提前凋亡, 但這些不育系材料在發(fā)育過程中能形成正常的四分體結(jié)構(gòu),敗育發(fā)生在小孢子發(fā)育過程中, 而 160S-MS在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂未完成時, 就形成空的花粉囊, 未觀察到四分體結(jié)構(gòu)和小孢子?？傊?60S敗育時期和特點與目前報道的甘藍(lán)型溫敏核雄性不育材料存在差異。

植物花粉的生長發(fā)育需要絨氈層在適當(dāng)?shù)臅r期發(fā)生細(xì)胞程序性死亡[22]。 絨氈層位于花藥壁最內(nèi)層, 它與發(fā)育中的雄配子體直接接觸, 能向小孢子提供發(fā)育需要的營養(yǎng)物質(zhì), 如胼胝質(zhì)、孢粉素和蛋白質(zhì)等[23-26]。研究表明,絨氈層在花藥和花粉的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用, 過早或延遲凋亡會導(dǎo)致雄性不育[27-29]。目前已在小麥[27]、擬南芥[30-31]、水稻[32-33]、油菜[34]等植物中發(fā)現(xiàn)大量雄性不育材料是由絨氈層發(fā)育異常引起的。李六林[35]根據(jù)前人對絨氈層發(fā)育的研究, 按照不同的植物種類, 將絨氈層解體分為 2類: 一種是腺質(zhì)型類型, 在花粉發(fā)育過程中, 絨氈層細(xì)胞分泌花粉母細(xì)胞和小孢子發(fā)育所需的各種營養(yǎng)物質(zhì), 絨氈層細(xì)胞直到花粉成熟才完全消失; 另一種是變形絨氈層, 絨氈細(xì)胞以多核原生質(zhì)團(tuán)的形式填充于小孢子之間的空隙中, 供小孢子利用和吸收。腺質(zhì)型絨氈層多存在于被子植物中。在花藥發(fā)育早期, 160S-MS能形成正常的花粉母細(xì)胞, 絨氈層細(xì)胞整齊地排列在花藥壁最內(nèi)層, 與160S-MF無差異。然而, 在減數(shù)分裂期, 160S-MS花藥絨氈層細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常, 細(xì)胞空泡化并伴隨降解現(xiàn)象, 致使花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂受阻, 慢慢解體,無法形成四分體結(jié)構(gòu), 最終減數(shù)分裂完成前就只剩下空的花粉囊, 導(dǎo)致敗育。可能是絨氈層細(xì)胞提前凋亡而未向腺質(zhì)型轉(zhuǎn)化, 不能向花粉母細(xì)胞提供發(fā)育所需的營養(yǎng)成分, 進(jìn)而影響四分體小孢子的形成, 無成熟花粉粒產(chǎn)生,導(dǎo)致160S敗育。