黃巧 尹時(shí)華 侯濤 任毅 廖行偉 翟思佳 王曉榮

程序性壞死是由受體相互作用蛋白激酶介導(dǎo)的非依賴半胱天冬酶(caspase)的一種新型細(xì)胞死亡方式，在形態(tài)上與壞死非常相似，與傳統(tǒng)的細(xì)胞壞死不同，其可以受調(diào)控，且在凋亡介導(dǎo)的胱天蛋白酶被抑制情況下被激活。當(dāng)被病毒感染或caspase-8激活受抑制時(shí)，死亡配體[包括腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、Fas配體和TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)]依次進(jìn)行磷酸化和激活受體相互作用蛋白激酶-1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1)和受體相互作用蛋白激酶-3(receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3)，活化的RIPK3使混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)磷酸化，導(dǎo)致MLKL的構(gòu)象變化，磷酸化的MLKL形成寡聚體，并易位至生物膜上，從而通過(guò)形成孔道和破壞膜完整性而導(dǎo)致壞死[1～3]。因此，由RIPK1、RIPK3和MLKL組成的蛋白復(fù)合物稱為壞死體，是程序性壞死的關(guān)鍵調(diào)控分子[4]。一些研究表明RIPK3可能參與螺旋神經(jīng)節(jié)(SGN)的損傷，Wang等[5]利用哇巴因建立SGN損傷模型研究發(fā)現(xiàn)，RIPK3介導(dǎo)的程序性壞死參與SGN損傷。Choi等[6]在體外和體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，RIPK3介導(dǎo)的程序性壞死是順鉑誘導(dǎo)耳毒性的主要細(xì)胞死亡途徑。但水楊酸鈉耳毒性是否存在RIPK1/RIPK3/MLKL途徑參與的程序性壞死尚無(wú)研究報(bào)道。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸鈉通過(guò)激活caspase-3誘導(dǎo)豚鼠耳蝸SGN發(fā)生細(xì)胞凋亡，但經(jīng)特異性caspase-3抑制劑處理后凋亡細(xì)胞減少不明顯，其可能有不依賴caspase-3的凋亡途徑存在[7]，由此提出，水楊酸鈉可能損傷SGN,可能存在RIPK1/RIPK3/MLKL途徑參與的程序性壞死。程序性壞死特異性抑制劑necrostatin-1(Nec-1)，對(duì)RIPK1作用具有高度特異性，在超過(guò)400種人類激酶的篩選中，Nec-1對(duì)RIPK1的選擇性較其他激酶高出1 000倍以上，其能夠抑制RIPK1活性，阻斷程序性壞死的進(jìn)行，在損傷模型中起保護(hù)作用[8, 9]。因此，本研究采用Nec-1干預(yù)程序性壞死途徑，探討RIPK1/RIPK3/MLKL介導(dǎo)的程序性壞死在水楊酸鈉誘導(dǎo)大鼠SGN損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選擇耳廓反應(yīng)靈敏、鼓膜完整且未暴露于噪聲環(huán)境及無(wú)耳毒性藥物使用史的健康雄性成年SD大鼠，體重280～330 g，實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行ABR檢測(cè)，篩選ABR反應(yīng)閾小于40 dB SPL的48只合格大鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、人工外淋巴液(artificial perilymph,APL)組、水楊酸鈉(sodium salicylate,SS)組和Nec-1組,每組12只。

1.2主要試劑 人工外淋巴液(APL配制：NaCl 137 mM, KCl 5 mM, CaCl22 mM, NaH2PO41 mM, Glucose 10 mM, NaHCO312 mM, MgCl21 mM的溶液，pH 7.4±0.2)，水楊酸鈉購(gòu)于sigma公司，Nec-1(11658，Cayman Chemical，USA)，逆轉(zhuǎn)錄盒與熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于GeneCopoeia，RIPK1抗體(bs-5805R，bioss)，RIPK3抗體(BS7363，bioworld)，MLKL抗體(K004074P，solarbio)。引物利用Primer Premier設(shè)計(jì)，通過(guò)BLAST分析，挑選最佳序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，RIPK1引物序列為F:5′CCAGCCAGCCAAATCAAAGT3′；R: 5′TGGCTTACACTTGGCCCATA3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度198 bp。RIPK3引物序列為F:5′TAGTTTATGAAATGCTGGACCGC3′；R: 5′GCCAAGGTGTCAGATGATGTCC3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度145 bp。MLKL引物序列為F:5′TCTCCCAACATCCTGCGTAT3′；R: 5′TCCCGAGTGGTGTAACCTGTA3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度104 bp。選取GPHAD作為內(nèi)參對(duì)照，序列為F: 5′AGTGCCAGCCTCGTCTCATA3′；R:5′TGAACT TGCCGTGGGTAGAG3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度189 bp。

1.3聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)檢測(cè) 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前與動(dòng)物處死前(最后一次給藥12小時(shí)后)均進(jìn)行ABR檢測(cè)。采用Neuro-Audio.聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位儀，操作軟件為Neuro-Audio.v2010，麻醉滿意后將大鼠置于隔聲室，記錄電極置于額頂正中，參考電極置于同側(cè)耳廓，接地電極置于鼻尖。click短聲刺激，刺激率21次/秒，帶通濾波300～3 000 Hz，疊加次數(shù)1 024次，強(qiáng)度從90 dB SPL開(kāi)始并以10 dB或者5 dB遞減，以能引出明確重復(fù)的、可檢測(cè)到的波II的最小刺激強(qiáng)度為ABR反應(yīng)閾，并重復(fù)檢測(cè)2次。

1.4各組用藥及給藥方法 空白對(duì)照組：左耳經(jīng)圓窗注入人工外淋巴液，腹腔注射生理鹽水；APL組：左耳經(jīng)圓窗注入含Nec-1人工外淋巴液；SS組：左耳經(jīng)圓窗注入人工外淋巴液后腹腔注射水楊酸鈉350 mg·kg-1·d-1；Nec-1組：左耳經(jīng)圓窗注入Nec-1后經(jīng)腹腔注射水楊酸鈉350 mg·kg-1·d-1；圓窗給藥24小時(shí)后給予腹腔注射，各組連續(xù)給藥7天。圓窗給藥方法：10%水合氯醛全身麻醉滿意后將大鼠置于固定板上，左耳后常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，利多卡因局部浸潤(rùn)麻醉，于耳后溝后2 mm做弧形切口約1 cm長(zhǎng)，鈍性分離軟組織，暴露聽(tīng)泡，在解剖顯微鏡下于聽(tīng)泡后上方用鉆孔并暴露圓窗龕，以分別浸泡有人工外淋巴液、Nec-1的明膠海綿置于圓窗膜表面，Nec-1濃度(300 μM)和劑量(100 μL)根據(jù)以前的報(bào)道選擇[10]。關(guān)閉術(shù)腔，逐層縫合軟組織及皮膚，切口涂紅霉素軟膏，取左耳朝上側(cè)臥位，待自然清醒。

1.5耳蝸取材及切片制備 待各組動(dòng)物最后一次檢測(cè)ABR后，打開(kāi)胸腔，剪開(kāi)右心耳，以生理鹽水及4%多聚甲醛灌注心臟，待頭頸四肢僵硬快速斷頭，打開(kāi)聽(tīng)泡取出耳蝸，在解剖顯微鏡下打開(kāi)圓窗及前庭窗，于蝸尖處挑開(kāi)小孔，用1 ml注射器由蝸?lái)敼嘧?%多聚甲醛，再將標(biāo)本置于4%多聚甲醛4 ℃固定48 h。取出耳蝸置于10%EDTA溶液室溫脫鈣1個(gè)月，隔天更換一次脫鈣液。隨后經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后切片，片厚4 μm。

1.6HE染色 石蠟切片置于60 ℃烤箱3 h，將切片取出進(jìn)行二甲苯脫蠟和梯度酒精水化；蒸餾水沖洗，蘇木素染色5 min，水洗；蒸餾水浸泡1 min；1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水返藍(lán)30 min，伊紅染色2 min；梯度酒精脫水，二甲苯透明，晾干封片，鏡檢。為了進(jìn)行定量分析，在10×40視野下總共對(duì)SGN區(qū)的壞死細(xì)胞數(shù)進(jìn)行五次計(jì)數(shù)，計(jì)算出100個(gè)SGN細(xì)胞中已經(jīng)壞死的細(xì)胞數(shù)量。

1.7RNA提取和實(shí)時(shí)熒光適量PCR(qRT-PCR)法 待大鼠麻醉充分快速斷頭，迅速取出耳蝸置入無(wú)酶水配制的PBS溶液中，在解剖顯微鏡下剝離蝸殼，取出膜迷路組織并迅速放入含有TRIZOL的1.5 ml EP管中，用玻璃研磨棒將組織完全研磨碎，冰上放置10 min。12 000 g 4 ℃離心5 min，吸取上清液加入200 μl氯仿震蕩15 s，冰上靜置5 min。12 000 g 4 ℃離心15 min，吸取上層水相層，加入200 μl異丙醇與200 μl高鹽溶液(0.8 mol/L檸檬酸鈉與1.2 mol/L NaCl的混合液)，顛倒混勻后冰上靜置10 min。12 000 g 4 ℃離心10 min，棄上清保留沉淀并加入75%乙醇1 ml洗滌沉淀。12 000 g 4 ℃離心5 min，倒去乙醇，晾干沉淀，無(wú)酶水溶解RNA。測(cè)RNA濃度，并分裝保存于-80 ℃。取總RNA 1 μg，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，然后通過(guò)美國(guó)ABI公司的Stepone進(jìn)行qRT-PCR。以1 μl cDNA為反應(yīng)模板，按照熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書配置反應(yīng)20 μl體系進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)條件：95 ℃30 s，95 ℃10 s，60 ℃32 s，循環(huán)40次。選取GPHAD作為內(nèi)參對(duì)照，采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，檢測(cè)各組大鼠SGN RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA表達(dá)水平。

1.8免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片置于60 ℃烤箱3 h，將切片取出進(jìn)行二甲苯脫蠟和梯度酒精水化，蒸餾水沖洗；切片置于0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)放入高壓鍋高壓修復(fù)5 min，室溫冷卻后PBS浸洗；阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，PBS沖洗；滴加一抗(RIPK1∶PBS=1∶400,RIPK3∶PBS=1∶100,MLKL∶PBS=1∶200，陰性對(duì)照用0.01 MPBS代替一抗)，4 ℃濕敷過(guò)夜；室溫復(fù)溫1 h，PBS沖洗；滴加反應(yīng)增強(qiáng)液10 min，PBS沖洗；滴加增強(qiáng)酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物10 min，PBS沖洗；DAB溶液顯微鏡下顯色；蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水返藍(lán)30 min；脫水，透明，晾干，封片、鏡檢。細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性表達(dá)，無(wú)棕黃色顆粒者為陰性表達(dá)。在10×40視野下選取螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域，采用Image-pro plus6.0圖像分析軟件測(cè)定單位面積陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的平均光密度值(Average optical densities，AOD)，檢測(cè)各組大鼠SGN RIPK1、RIPK3、MLKI蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1各組用藥前后ABR反應(yīng)閾比較 給藥前各組大鼠雙耳ABR閾值均低于40 dB SPL。給藥后各組間ABR反應(yīng)閾差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=101.962，P<0.000 1)，經(jīng)兩兩比較，給藥后對(duì)照組和APL組ABR閾值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.149)。給藥后水楊酸鈉組ABR閾值較對(duì)照組和APL組升高(分別為P<0.000 1，P<0.000 1)。Nec-1組ABR閾值較水楊酸鈉組降低(P<0.000 1)，但較對(duì)照組和APL組仍有升高(P<0.000 1，P<0.000 1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Nec-1組經(jīng)抑制劑處理后ABR反應(yīng)閾較水楊酸鈉組降低(P<0.000 1)，但較對(duì)照組及APL組仍有升高(分別為P<0.000 1，P<0.000 1)(表1)。

表1 各組大鼠左耳給藥前后ABR閾值比較

2.2各組HE染色SGN細(xì)胞形態(tài)及壞死細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 對(duì)照組及APL組SGN細(xì)胞清晰(圖1a、b)，但仍存在少許壞死細(xì)胞。與對(duì)照組相比，水楊酸鈉組SGN的形態(tài)學(xué)變化明顯，具有細(xì)胞死亡特征，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，細(xì)胞質(zhì)腫脹，細(xì)胞界限不清(圖1c)；Nec-1組壞死細(xì)胞數(shù)量較水楊酸鈉組減少(圖1d)。對(duì)照組、APL組、水楊酸鈉組及Nec-1組SGN中壞死細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為11.6%±1.517%、12.8%±1.483%、47.8%±2.387%及30.6%±1.140%，各組間壞死細(xì)胞計(jì)數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=361.228，P<0.000 1)；與對(duì)照組相比，水楊酸鈉組SGN壞死細(xì)胞計(jì)數(shù)最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)；Nec-1組SGN壞死細(xì)胞計(jì)數(shù)較水楊酸鈉組少(P<0.000 1)，但較對(duì)照組仍有升高(P<0.000 1)；而對(duì)照組與APL組壞死細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.28)。

2.3qRT-PCR顯示各組大鼠SGN中RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA表達(dá)量 qRT-PCR結(jié)果顯示GPHAD、RIPK1、RIPK3和MLKL的擴(kuò)增曲線整齊均勻(圖2)，溶解曲線均呈特異性單峰(圖3)，表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好、無(wú)二聚體及非特異性擴(kuò)增。各組間RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA的表達(dá)量有明顯差異(P<0.000 1，P<0.000 1，P<0.000 1)，其中，對(duì)照組中表達(dá)水平表達(dá)均最低，水楊酸鈉組表達(dá)強(qiáng)烈增加，Nec-1組表達(dá)量均明顯低于水楊酸鈉組(表2)。

表2 各組大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL mRNA表達(dá)量

2.4免疫組化結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示RIPK1、RIPK3和MLKL主要表達(dá)在SGN的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜及部分細(xì)胞核處；對(duì)照組和APL組SGN區(qū)域幾乎無(wú)表達(dá)，水楊酸鈉組SGN中RIPK1、RIPK3和MLKL的表達(dá)明顯增加，Nec-1組RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白的表達(dá)量較低，但Nec-1組仍較對(duì)照組表達(dá)升高，該蛋白質(zhì)表達(dá)模式與mRNA表達(dá)模式一致，各組間RIPK1在SGN的表達(dá)量有明顯差異(F=274.607，P<0.001)。經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組和APL組相比，水楊酸鈉組的SGN中RIPK1表達(dá)強(qiáng)烈增加(分別為P<0.000 1，P<0.000 1)，Nec-1組SGN中RIPK1表達(dá)量較水楊酸鈉組明顯降低(P=0.001)，但Nec-1組與對(duì)照組、APL組比較，RIPK1表達(dá)水平仍有升高(分別為P<0.000 1，P<0.000 1)(圖4)。各組間RIPK3在SGN的表達(dá)量有明顯差異(F=292.711，P<0.000 1)，與RIPK1表達(dá)結(jié)果一致，與對(duì)照組和APL組相比，水楊酸鈉組的SGN中RIPK3表達(dá)強(qiáng)烈增加(分別為P<0.000 1，P<0.000 1)，Nec-1組SGN中RIPK3表達(dá)量顯著低于水楊酸鈉組(P<0.000 1)，但仍高于對(duì)照組和APL組(分別為P=0.002，P=0.004)(圖5)。各組間MLKL在SGN的表達(dá)量有明顯差異(F=89.591，P<0.000 1)，與RIPK3表達(dá)結(jié)果一致，與對(duì)照組和APL組相比，水楊酸鈉組的SGN中MLKL表達(dá)強(qiáng)烈增加(P<0.000 1，P<0.000 1)，Nec-1組SGN中MLKL表達(dá)量較水楊酸鈉組降低(P<0.000 1)，但仍高于對(duì)照組、APL組(分別為P=0.006，P=0.008)(圖6)。

3 討論

程序性壞死可能是SGN細(xì)胞死亡的基本和替代/補(bǔ)充機(jī)制，在阻斷細(xì)胞凋亡途徑后進(jìn)一步揭示，當(dāng)?shù)蛲鼋閷?dǎo)的胱天蛋白酶被抑制時(shí)，由RIPK1和RIPK3執(zhí)行程序性壞死。RIPK1和RIPK3參與炎癥和細(xì)胞死亡，MLKL被RIPK3磷酸化激活，形成壞死體而導(dǎo)致細(xì)胞程序性壞死[11, 12]。先前的研究不斷探索水楊酸鈉誘導(dǎo)耳鳴的分子機(jī)制，caspase3介導(dǎo)的凋亡通路已被證明是水楊酸鈉誘導(dǎo)SGN損傷中主要的死亡通路[13]。在體內(nèi)水楊酸鈉通過(guò)影響環(huán)氧合酶活性，阻斷花生四烯酸向前列腺素H2轉(zhuǎn)化，花生四烯酸濃度的增加會(huì)影響N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體，同時(shí)引起外周和中樞效應(yīng)，NMDA受體在內(nèi)部毛細(xì)胞和耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的突觸上表達(dá)[14]。在體外，水楊酸鈉增強(qiáng)了NMDA類在耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元上的谷氨酸能電流[15]，將NMDA拮抗劑直接應(yīng)用到耳蝸液中，可阻止水楊酸鈉誘導(dǎo)的耳鳴[16]，這些研究表明水楊酸鈉耳毒性機(jī)制非常復(fù)雜，涉及多條通路，然而程序性壞死是否也參與水楊酸鈉誘導(dǎo)的耳毒性尚無(wú)報(bào)道。

程序性壞死可被死亡配體[包括腫瘤壞死因子(TNF)，F(xiàn)as配體和TRAIL]誘導(dǎo)，Hwang等[17]觀察到在小鼠耳蝸中注射300 mg/kg水楊酸鈉可使腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor type 1,TNFR1)mRNA表達(dá)水平高于腫瘤壞死因子受體2(tumor necrosis factor receptor type 2,TNFR2)的mRNA表達(dá)水平。長(zhǎng)期施用水楊酸鈉后，TNFα基因的表達(dá)增加，然而在停止水楊酸鈉給藥后14天，TNFα mRNA的表達(dá)水平又回到了正?；€[18]。此外，Wei等[19]研究發(fā)現(xiàn)水楊酸鈉處理3小時(shí)后，Tnfsf10(TRAIL)、Lta(TNFSSF1)、Fas和Tnfrsf5 4個(gè)TNF家族的成員顯示上調(diào)，這些研究表明水楊酸鈉誘導(dǎo)的耳鳴可能與TNFα基因的過(guò)表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，水楊酸鈉誘導(dǎo)的耳毒性與SGN中RIPK1、RIPK3和MLKL，即壞死體的高表達(dá)水平顯著相關(guān)，反映了壞死性細(xì)胞死亡途徑，使用Nec-1處理時(shí)，RIPK1、RIPK3和MLKL表達(dá)降低，這表明在水楊酸鈉致SGN損傷中存在RIPK1/RIPK3/MLKL介導(dǎo)的程序性壞死，阻滯該途徑對(duì)于有效的神經(jīng)保護(hù)可能是必需的。但是，需要進(jìn)一步研究分別敲除小鼠RIPK1、RIPK3和MLKL基因在水楊酸鈉誘導(dǎo)的耳毒性中的作用。

Nec-1是程序性壞死特異性抑制劑，能夠抑制RIPK1活性，阻斷程序性壞死的進(jìn)行。Nec-1已廣泛用于實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯渴荏w相互作用蛋白激酶在程序性壞死中的作用。Zheng等[10]在噪聲性聽(tīng)力損失模型中研究發(fā)現(xiàn)，噪聲暴露一小時(shí)后，耳蝸基底部區(qū)域中的外毛細(xì)胞RIPK1和RIPK3蛋白水平增加，呈現(xiàn)凋亡和壞死特征，用Nec-1進(jìn)行治療可減少噪聲引起的RIPK1和RIPK3增加，并減少外毛細(xì)胞壞死。Wang等[5]也報(bào)道哇巴因引起的SGN損傷促進(jìn)RIPK3表達(dá)增加，但可通過(guò)應(yīng)用Nec-1來(lái)抑制。本研究Nec-1組SGN中RIPK1、RIPK3和MLKL表達(dá)降低，且SGN中細(xì)胞的壞死率減少，與上述研究結(jié)果一致；然而，Ruhl等[20]報(bào)道Nec-1的保護(hù)作用在順鉑誘導(dǎo)耳毒性的離體外毛細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中未得到反映。表明藥物誘導(dǎo)的耳毒性非常復(fù)雜，存在由胱天蛋白酶和RIP激酶相互調(diào)節(jié)，任一途徑的抑制可能導(dǎo)致死亡向另一途徑轉(zhuǎn)移，因此，Nec-1抑制程序性壞死可保護(hù)SGN細(xì)胞免受損傷。

SGN的損傷不僅可導(dǎo)致感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失，也可能是水楊酸鈉引起耳鳴的機(jī)制之一，本研究提示程序性壞死是一種SGN損傷的重要途徑，其重要性與細(xì)胞凋亡相似；抑制程序性壞死以保護(hù)SGN免受損傷，可能是治療耳鳴和SGN損傷相關(guān)性聽(tīng)力損失的一種方法。