劉燕敏，趙新程，李俊琴，張開明

(山西醫(yī)科大學(xué)附屬太原中心醫(yī)院 皮膚科 皮膚病學(xué)實(shí)驗室 免疫性皮膚病干細(xì)胞山西省重點(diǎn)實(shí)驗室，山西 太原 030009)

銀屑病(psoriasis)是一種復(fù)雜的、慢性的和反復(fù)發(fā)作的皮膚病，由于目前尚無特效療法，會嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量[1]?，F(xiàn)普遍認(rèn)為銀屑病具有家族遺傳史，到目前為止通過全基因組測序研究已經(jīng)確定了36個易感位點(diǎn)，但也存在如藥物、吸煙、精神壓力、皮膚損傷和激素變化等環(huán)境誘因[2-3]，所以遺傳易感性和環(huán)境因素都是該病病因?qū)W的重要因素。銀屑病是由表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、真皮血管細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互交叉介導(dǎo)，其中T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和NK細(xì)胞發(fā)揮著重要功能[4]。在研究中發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者的免疫功能，尤其是T細(xì)胞功能存在異常，采用免疫調(diào)節(jié)及抗炎治療可逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞功能及亞群的變化，并能很好地改善皮損嚴(yán)重程度。但關(guān)于白細(xì)胞和B細(xì)胞在銀屑病中的報道很少，為進(jìn)一步探討銀屑病的免疫功能以及提高臨床治療效果，本文除常規(guī)檢測患者的CD3+、CD4+、CD8+和CD4+CD8+外周血T淋巴細(xì)胞亞群，還對比進(jìn)行期、靜止期和退行期患者中NK細(xì)胞、白細(xì)胞和B細(xì)胞的差異。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象:77 例尋常型銀屑病(psoriasis vulgaris)患者來自2019年1月至2020年1月于太原中心醫(yī)院皮膚性病科門診就診的患者，均達(dá)到《中國臨床皮膚病學(xué)》診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：近3個月內(nèi)采取激素類藥物治療的患者；患有其他合并癥和免疫性疾病者；膿皰型、關(guān)節(jié)型和紅皮病型皮膚病變者。就診銀屑病患者全部為年齡在5～65歲的太原市定居的漢族人，其中女性占49.4%，共計38例，患者的平均年齡在(36.1±14.5)歲；男性39例，占50.6%，年齡在(38.5±15.7)歲；病程在0.5～22年，平均(5.9±4.6)年，其銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(psoriasis area and severlty index,PASI)評分為1.9～44.6，平均(22.46±13.57)分。

1.1.2 試劑和試劑盒：CD3、CD4、CD8、CD16、CD56、CD19、CD45和CD14抗體(Miltenyi Biotec公司)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 病理學(xué)觀察：采集患者銀屑病患者軀干或四肢近端皮損處約1 cm的皮膚，放入10%甲醛固定液中約24 h，后實(shí)施浸蠟包埋，切片，脫蠟等一系列處理。結(jié)束后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色處理，于光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.2.2 細(xì)胞免疫功能的檢測：采集空腹外周靜脈血3.0～4.0 mL于乙二胺四乙酸采血管中，混勻。對樣本以及流式管進(jìn)行編號，每個樣本準(zhǔn)備2個試管，每管依次加入20 μL的CD3+、CD4+、CD8+、CD16+、CD56+、CD19+、CD45+和CD14+抗體，再加入50 μL充分混勻的抗凝全血，蓋上管蓋并振蕩混勻，室溫避光孵育15 min。各管中加入450 μL的溶血素，再次振蕩混勻后室溫避光孵育15 min待檢。采用流式細(xì)胞儀及配套的試劑盒檢測CD3+、CD4+、CD8+、CD3-CD16+CD56+(NK細(xì)胞)、CD3-CD19+(白細(xì)胞)、以及CD45+CD14+(B細(xì)胞)比例，所有操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般資料

此次篩選患者均為太原市的常住居民，沒有地域差別，可以看到男女比例基本一致，94%患者在20～60歲范圍，根據(jù)患者的病情發(fā)展，將上述77例銀屑病患者按照進(jìn)行期、靜止期和退行期為3組，3組在年齡、性別和病程上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表 1)。

表1 三組的基本情況Table 1 Basic situation of three

2.2 HE染色評級各組患者的免疫水平

進(jìn)行期患者皮損組織病理可見皮膚增厚，棘層重度肥厚，表皮呈顯著的角化過度和角化不全，同時伴有新生血管增多，重度炎性細(xì)胞浸潤(圖1A)。而靜止期和退行期組表皮角化過度和角化不全癥狀減輕，棘層變薄，炎性細(xì)胞浸潤減少(圖1B,C)。

圖1 進(jìn)行期組織(A)、靜止期組織(B)、退行期組織(C)組織病理學(xué)變化 Fig 1 Histopathological changes of progressive tissue (A),stationary tissue (B) and regression tissue (C) (scale bar = 100 μm)

2.3 銀屑病患者外周血淋巴細(xì)胞亞群比例

與退行期相比，進(jìn)行期和靜止期患者的CD3+、CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞的百分率均顯著升高(P<0.01)。研究結(jié)果顯示，患者外周血淋巴細(xì)胞亞群中的CD4-CD8-按進(jìn)行期、靜止期和退行期逐漸降低(P<0.01)。NK細(xì)胞比例隨病情趨于退行期發(fā)展呈升高趨勢，白細(xì)胞的比例逐漸下降，CD19+B細(xì)胞比率與病情呈負(fù)相關(guān)(3組，P<0.05)(表2)。

表2 銀屑病患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)Table 2 Expression of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients with

3 討論

大量研究證實(shí)銀屑病與T淋巴細(xì)胞的表型、功能和分泌大量細(xì)胞因子相關(guān)聯(lián)[5]。本研究結(jié)果顯示，與退行期相比，進(jìn)行期和靜止期患者的CD3+、CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞的百分率均顯著升高，說明隨著病情發(fā)展患者的免疫力減弱。CD4+又稱輔助性T細(xì)胞，可分泌多種細(xì)胞因子和化學(xué)介質(zhì)，對角質(zhì)形成細(xì)胞增生和血管生成及最終導(dǎo)致角化過度和銀屑病斑塊的特征非常重要[6]。CD8+可抑制T細(xì)胞的活化，也可產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞因子Tc17、Tc22及Tc1與銀屑病的病理過程密切相關(guān)[7]。CD4+CD8+細(xì)胞具有抗原特異性和增殖活性，可以分泌Th1和Th2類細(xì)胞因子，CD4-CD8-細(xì)胞可抑制同系基因型CD4+或CD8+細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用[8]。

患者外周血淋巴細(xì)胞亞群中的CD4-CD8-按進(jìn)行期、靜止期和退行期表達(dá)逐漸降低，而CD4+CD8+

的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，推測CD4-CD8-可能與銀屑病的病情發(fā)展相關(guān)。NK細(xì)胞在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的確切作用仍存在爭議，但已有研究證明NK細(xì)胞會滲透到銀屑病組織中[9-10]。結(jié)果顯示CD3-CD16+CD56+比例隨病情穩(wěn)定逐漸升高，而白細(xì)胞的比例逐漸下降。研究發(fā)現(xiàn)激活白細(xì)胞可產(chǎn)生自由基，破壞機(jī)體氧化和抗氧化間的平衡，影響銀屑病的發(fā)展[11-12]。T細(xì)胞在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中占有很重要的地位，但已有證據(jù)表明B細(xì)胞也起著重要的作用，現(xiàn)已確定，B細(xì)胞在許多自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，但作用機(jī)制仍不清楚[13-14]。進(jìn)行期、靜止期和退行期組銀屑病患者的淋巴細(xì)胞亞群存在顯著的差異，進(jìn)一步支持銀屑病的免疫發(fā)病機(jī)制。相信隨著銀屑病免疫學(xué)研究逐步向精細(xì)和微觀方向的發(fā)展，更加高效、精準(zhǔn)的治療手段將陸續(xù)問世。