河鲀發(fā)酵魚醬游離氨基酸分析

錢小麗

(江蘇旅游職業(yè)學(xué)院 烹飪科技學(xué)院，江蘇 揚州 225127)

1 概述

水產(chǎn)品由于蛋白質(zhì)含量高，所以在研究水產(chǎn)品加工中，水產(chǎn)品蛋白質(zhì)的變化一直是人們研究的熱點。蛋白質(zhì)在發(fā)酵過程中會出現(xiàn)降解，生成多肽或者變?yōu)榘被岬萚1]。而在很多發(fā)酵制品中，如魚露、酸肉、火腿、香腸等，在其整個發(fā)酵過程中，基于微生物發(fā)酵劑的功能，制品的游離氨基酸含量或多或少呈現(xiàn)增加狀態(tài)，當(dāng)然不同的微生物發(fā)酵劑對制品的游離氨基酸含量的影響情況也不同[2-5]。

游離氨基酸(free amino acid，F(xiàn)AA)除了應(yīng)有的營養(yǎng)功能外，也作為呈味物質(zhì)的重要成分，每一種氨基酸都有其獨特的呈味特性，主要包括甜味、酸味、苦味、鮮味等。當(dāng)不同的氨基酸混合到一起時會產(chǎn)生復(fù)雜的味道并使產(chǎn)品產(chǎn)生特殊的風(fēng)味[6]。水產(chǎn)品中游離氨基酸含量豐富，Park等對7個國家多個魚露品種分析認(rèn)為魚露的主要氨基酸為天門冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、賴氨酸[7]。賴氨酸能夠改變產(chǎn)品的滋味，而鮮味的有效成分主要是谷氨酸、丙氨酸、蘇氨酸和纈氨酸[8]。

當(dāng)下國內(nèi)外研究人員對游離氨基酸的研究主要是針對火腿、香腸等肉制品和豆醬等豆制品，而在水產(chǎn)中主要集中在自然發(fā)酵的魚露，對于利用微生物發(fā)酵劑進行接種發(fā)酵對產(chǎn)品游離氨基酸影響的研究比較少，而以河鲀魚為原料，研究利用微生物發(fā)酵劑接種發(fā)酵魚醬的游離氨基酸的影響還未見報道。

本實驗以河鲀魚肉為原料，研究河鲀魚肉在接種不同微生物發(fā)酵劑后所形成的游離氨基酸變化趨勢，從而為開發(fā)并強化河鲀魚醬品質(zhì)提供了理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

河鲀魚肉、食鹽、混合香料、植物油、錫箔紙、封口

膜：市售；乳酸菌L003、葡萄球菌C07、酵母菌Y04：以上菌種均由本實驗室保存；試劑：磺基水楊酸、茚三酮、檸檬酸、檸檬酸鈉、蛋白氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸)。

2.2 主要儀器與設(shè)備

YXO.SGH280型高壓蒸汽滅菌鍋 上海醫(yī)用核子儀器廠；SW-CJ-1F型超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；TG16型高速冷凍離心機 湖南湘儀離心機廠；HG101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱 南京實驗儀器廠；HSX型控溫控濕培養(yǎng)箱 上海?，斣O(shè)備有限公司；FJ-200型高速均質(zhì)儀 上海標(biāo)本模型廠；L-8300型氨基酸自動分析儀 日本日立公司；BSA124S-CW型電子天平 賽多利斯(中國)有限公司；85-1A型磁力攪拌器 上海閔行虹浦儀器廠。

2.3 試驗方法

2.3.1 河鲀魚醬的加工

備選菌株在液體培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)12 h，離心(4 ℃，4000 r/min)10 min，去掉上清液，并用適當(dāng)體積的無菌生理鹽水稀釋菌體，按指定添加量添加。

基本配方：河鲀魚肉200 g、食鹽16 g、植物油10 g、香辛料1 g、水100 g。

制備流程：原料肉預(yù)處理→絞碎→拌料接種→發(fā)酵→調(diào)配→蒸制→裝袋→成品。

2.3.2 樣品制備

取樣品1 g，滴入8%的磺基水楊酸10 mL，用高速均質(zhì)機均質(zhì)后，4 ℃下以10000 r/min離心20 min，取上清液過濾，同溫度下以20000 r/min離心15 min，通過氨基酸自動分析儀檢測上清液。

2.3.3 測試條件

分離柱：Na+型離子交換柱(4.6 mm×60 mm)；柱溫：57 ℃；樹脂：日立8800；茚三酮流速：0.35 mL/min；緩沖液：檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；緩沖液流速：0.4 mL/min；蛋白氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：10 nmol；檢測波長：λ1=570 nm，λ2=440 nm；進樣量：20 μL；50 min程序上機定量分析。

2.3.4 數(shù)據(jù)處理

每個樣品進行3次試驗，計算其平均值。用SPSS 17.0和Excel 2003對試驗數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA)，當(dāng)P<0.05時表示差異性顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 河鲀發(fā)酵魚醬游離氨基酸的測定結(jié)果

由表1可知，共檢出了17種游離氨基酸，與對照組比較，各組游離氨基酸總量均有所增加，尤以三菌復(fù)合發(fā)酵組游離氨基酸總量最高，均超過了各單菌發(fā)酵組。

表1 不同處理游離氨基酸的含量(g/100 g干物質(zhì))Table 1 The content of free amino acids (g/100 g dry substance)by different treatments

3.2 不同處理對游離氨基酸的影響

由圖1可知，除苯丙氨酸、天門冬氨酸、精氨酸、脯氨酸外，乳酸菌發(fā)酵的河鲀魚醬與空白對照組相比，其他氨基酸的含量均有不同程度的提高，分別為蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸；從氨基酸含量分析，在L處理組中賴氨酸(0.042 g/100 g)、丙氨酸(0.024 g/100 g)、谷氨酸(0.017 g/100 g)的含量比較高；在L處理組中，出現(xiàn)了組氨酸，而空白處理組中未出現(xiàn)。

圖1 L處理組與空白對照組CK游離氨基酸含量比較

由圖2可知，葡萄球菌發(fā)酵的河鲀魚醬與空白對照組進行對比，除苯丙氨酸、賴氨酸、脯氨酸外，其他氨基酸的含量都或多或少有所提高，其提高的情況按序排列為：蘇氨酸>絲氨酸>谷氨酸>丙氨酸>纈氨酸>蛋氨酸>異亮氨酸>亮氨酸；從氨基酸含量來看，在C處理組中含量較高的是賴氨酸(0.028 g/100 g)、丙氨酸(0.022 g/100 g)。除此之外，在C處理組中產(chǎn)出了組氨酸，但沒有精氨酸產(chǎn)出。

圖2 C處理組與空白對照組CK游離氨基酸含量比較

由圖3可知，酵母菌發(fā)酵的河鲀魚醬與空白對照組對比，除絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、脯氨酸外，其他氨基酸的含量均有一定程度的提高，具體排序為：蘇氨酸>丙氨酸>纈氨酸>蛋氨酸>異亮氨酸>亮氨酸；從氨基酸含量來看，在C處理組中苯丙氨酸(0.022 g/100 g)、賴氨酸(0.021 g/100 g)的含量較高。與此同時，Y處理組中出現(xiàn)了組氨酸。

圖3 Y處理組與空白對照組CK游離氨基酸含量比較

由圖4可知，復(fù)合菌發(fā)酵的河鲀魚醬與空白對照組對比，除酪氨酸、精氨酸、脯氨酸外，其他氨基酸的含量均有一定的提高，依次為蘇氨酸>絲氨酸>谷氨酸>丙氨酸>纈氨酸>蛋氨酸>異亮氨酸>亮氨酸；從氨基酸含量來看，在C處理組中賴氨酸(0.052 g/100 g)、丙氨酸(0.023 g/100 g)含量較高。在S處理組中產(chǎn)生了組氨酸，但沒有出現(xiàn)胱氨酸。

圖4 S處理組與空白對照組CK游離氨基酸含量比較

由圖5可知，單菌發(fā)酵、復(fù)合菌發(fā)酵與空白對照組對比，不同處理組的游離氨基酸含量變化顯著。綜合分析，復(fù)合發(fā)酵組游離氨基酸好于單菌發(fā)酵組，接菌發(fā)酵好于空白對照組。

圖5 不同處理組游離氨基酸含量比較

3.3 河鲀發(fā)酵魚醬不同類型氨基酸的比較

游離氨基酸品種十分豐富，為了進一步探討接菌發(fā)酵與空白發(fā)酵之間游離氨基酸的不同，根據(jù)游離氨基酸的不同作用，將其分為必需氨基酸和非必需氨基酸兩種不同的種類，其中必需氨基酸包括Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys、His，非必需氨基酸包括Asp、Ser、Glu、Gly、Ala、Cys、Tyr、Arg、Pro；按照呈味不同可分為鮮味氨基酸(Asp、Glu)、甜味氨基酸(Ser、Ala、Thr、Pro、Gly)和苦味氨基酸(Val、Leu、Ile、Tyr、Lys、Arg、Phe)等[9]。

由圖6可知，除C處理組與Y處理組的苯丙氨酸、賴氨酸不如空白處理組外，其他各處理組的必需氨基酸含量均比空白處理組高；空白處理組中沒有組氨酸出現(xiàn)，在L組、C組、Y組與S組中，均出現(xiàn)了組氨酸，其含量為0.003 g/100 g。

圖6 不同處理組必需氨基酸含量比較

由圖7可知，各接菌發(fā)酵處理組的非必需氨基酸含量沒有顯著不同，但Glu的含量高于空白處理組，Cys在各處理組中都沒有發(fā)現(xiàn)。

圖7 不同處理組非必需氨基酸含量比較

由圖8可知，對于鮮味氨基酸來說，主要以谷氨酸為主，單菌發(fā)酵與復(fù)合菌發(fā)酵處理組的谷氨酸均比空白對照組高，具有顯著性差異。

圖8 不同處理組鮮味氨基酸含量比較

由圖9可知，不同處理組對河鲀發(fā)酵魚醬的甜味氨基酸含量作用不一致。對甜味貢獻較大的主要是甘氨酸與脯氨酸。

圖9 不同處理組甜味氨基酸含量比較

由圖10可知，不同處理組對河鲀發(fā)酵魚醬的苦味氨基酸含量影響不一致。對苦味作用較大的主要是賴氨酸、苯丙氨酸。

圖10 不同處理組苦味氨基酸含量比較

由圖11可知，接菌發(fā)酵組的必需氨基酸、鮮味氨基酸、甜味氨基酸、非必需氨基酸的含量總體上都要高于空白處理組，而對于苦味氨基酸來說，除了S復(fù)合發(fā)酵組外，其他各發(fā)酵組均低于空白發(fā)酵組。綜合分析，接菌發(fā)酵的河鲀發(fā)酵魚醬比空白發(fā)酵組好。

圖11 河鲀發(fā)酵魚醬中不同類型氨基酸的比較

各接菌發(fā)酵組中必需氨基酸含量比CK組高，必需氨基酸含量由高到低依次為S組>C處理組>L處理組>Y處理組>CK處理組。

河鲀發(fā)酵魚醬中S組、C處理組、Y處理組的非必需氨基酸含量比CK組高，非必需氨基酸含量由高到低依次為Y處理組>S處理組>C處理組>CK處理組>L處理組。

各接菌發(fā)酵組中產(chǎn)鮮味氨基酸含量比CK組高；處理組的甜味氨基酸含量比其他組高；苦味氨基酸含量除S處理組外，接菌發(fā)酵組小于空白對照組。

4 討論

4.1 微生物發(fā)酵劑對河鲀發(fā)酵魚醬FAA含量的影響

游離氨基酸尤其是必需氨基酸對人體健康有著重要的作用。必需脂肪酸含量的多少將會影響產(chǎn)品品質(zhì)的優(yōu)劣。肌肉組織中的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的多肽類物質(zhì)進一步被分解成小分子肽和氨基酸，通常認(rèn)為其原因是微生物酶和組織內(nèi)源酶的共同作用。河鲀發(fā)酵魚醬中必需氨基酸含量都不同，CK組中必需氨基酸含量小于各接菌發(fā)酵組。進而可以猜測是發(fā)酵劑對河鲀發(fā)酵魚醬產(chǎn)生了作用，而許多學(xué)者也認(rèn)為發(fā)酵劑的蛋白酶等酶系能對蛋白質(zhì)產(chǎn)生作用，比如乳桿菌分泌的蛋白酶能對肌肉中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生一定作用[10]。

根據(jù)不同發(fā)酵處理組的必需氨基酸來研究，S復(fù)合發(fā)酵組、C處理組、L處理組和Y處理組發(fā)酵的河鲀魚醬含量不一致，這說明不同的微生物發(fā)酵劑對游離氨基酸含量的影響也是不同的，這可能與微生物本身的酶活能力有關(guān)。李平蘭認(rèn)為木糖葡萄球菌比戊糖乳桿菌具有更強的解離蛋白質(zhì)產(chǎn)生游離氨基酸的能力[11]。Montel等研究發(fā)現(xiàn)葡萄球菌在發(fā)酵和成熟過程中能產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶降解蛋白質(zhì)和脂肪，使其分解為小分子物質(zhì)，對產(chǎn)品的風(fēng)味具有重要作用[12]。

河鲀發(fā)酵魚醬必需氨基酸含量由高到低依次為S組>C處理組>L處理組>Y處理組>CK處理組，各處理組的FAA總量和必需氨基酸含量低于復(fù)合菌株發(fā)酵組S組，且差異明顯(P<0.05)。這一情況可能是因為不同菌群之間出現(xiàn)的新陳代謝作用引發(fā)了復(fù)合發(fā)酵的效果比單菌發(fā)酵好。

4.2 發(fā)酵對河鲀發(fā)酵魚醬FAA種類及含量的影響

本次所測的18種氨基酸中，除胱氨酸在各處理組中均未檢出，其余17種氨基酸基本上都在各處理組中出現(xiàn)，這與鄧捷春等研究分析暗紋東方鲀與紅鰭東方鲀背肉游離氨基酸組成的結(jié)果基本一致[13]。

微生物的代謝活動不僅促進了游離氨基酸的數(shù)量增長，同時也改變了游離氨基酸種類的構(gòu)成，在S復(fù)合發(fā)酵組、C處理組、L處理組和Y處理組中均出現(xiàn)了組氨酸，而在CK空白處理組并未出現(xiàn)。在L處理組中酪氨酸并未檢出；精氨酸在C處理組和L處理組中均未檢出，而在CK組中含量最高。

在所檢測的游離氨基酸中，賴氨酸的數(shù)量最高，含量由高到低依次為S組>L處理組>CK處理組>C處理組>Y處理組；其次含量較高的主要有丙氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸等，這些氨基酸作為魚醬鮮味的有效成分，對魚醬的風(fēng)味有重要的影響。

5 總結(jié)

從游離氨基酸的含量和種類來分析，接菌發(fā)酵的河鲀發(fā)酵魚醬要優(yōu)于空白發(fā)酵的河鲀魚醬；單一菌種發(fā)酵的河鲀魚醬不如復(fù)合發(fā)酵。

谷氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸等作為河鲀發(fā)酵魚醬呈鮮成分的主要氨基酸，而賴氨酸對魚醬的鮮味也有很大貢獻。