曹蘇珊，薛 靜，王倩楠，張秀海，安賢惠

(1.江蘇海洋大學 海洋生命與水產學院，江蘇省海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，江蘇 連云港 222005；2.北京市農林科學院，北京農業(yè)生物技術研究中心，北京 100097)

小球藻(Chlorella)是一種單細胞真核藻類，屬綠藻門、綠藻綱、綠球藻目、小球藻科、小球藻屬[1]。作為最早開發(fā)的真核微藻之一，具有高營養(yǎng)價值、生長快速、結構簡單、易工業(yè)化集成等顯著優(yōu)點。其細胞形態(tài)為球形或橢圓形，直徑3～12 μm，呈單生或聚集成群狀生長[2]，分布廣泛，多見于淡水、咸水和土壤中。作為地球上最早的生命之一，小球藻基因比較穩(wěn)定，至今未見有關其基因自發(fā)突變的報道。因其富含蛋白質、脂質、維生素、活性代謝產物等多種營養(yǎng)物質而被公認為具有高附加值和醫(yī)療保健作用，已經被廣泛應用于保健食品[3]、水產養(yǎng)殖[4]、生物能源[5]等方面，關于小球藻生物技術的研究主要集中在基因組學[6]、分子遺傳學[7]、代謝機理[8]、大規(guī)模培養(yǎng)[9]等方向。

小球藻具有通過基因工程表達外源基因進而規(guī)?；a外源蛋白的潛在特質，而且具有低成本、環(huán)境友好等優(yōu)勢，用于真核生物基因表達前景廣闊[10-12]。我國常見培養(yǎng)的小球藻種類有蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)、橢圓小球藻(C.ellipsoidea)和普通小球藻(C.vulgaris)[13]，都可作為優(yōu)質的蛋白來源，同時也是進行生物技術研究的良好材料。截至目前，據不完全統(tǒng)計，有超過12種小球藻實現了遺傳轉化[14]。

1 小球藻遺傳轉化影響因素

1.1 轉化受體的預處理

小球藻的細胞壁主要是由微纖維和基質構成，主要成分是蛋白質、纖維素、葡糖胺以及脂質等。研究者在電鏡下觀察到小球藻表面由直徑為3～5 nm的微纖維不規(guī)則地交織在連續(xù)網絡狀的細胞壁上，將整個基質包圍。微纖交織維貫穿于整個細胞壁，并沿兩個不同的方向延伸，夾角近似為直角。基質外表面為顆粒狀，電鏡檢測和酶處理顯示，這些顆粒主要分布在細胞壁外表面和細胞壁內表面[15]。這一方面為細胞提供了強大的防御能力，另一方面也導致小球藻細胞壁較厚且硬、成分復雜、難以輕易去除，在一部分轉化方法中需要先通過弱化細胞壁形成原生質體從而提高遺傳轉化效率[16-17]。小球藻原生質體主要通過物理方法如研磨法、超聲波法或者生物方法如酶解法來制備[15]。研磨法和超聲波法因為需要通過物理因素來施加外力，導致小球藻死亡率升高，不利于后續(xù)對小球藻的進一步利用；而酶解法通過利用溫和的生物方法更有利于制備原生質體，以獲得高活力與高收獲率的原生質體為前提，結合不同的轉化方法使轉化效率得到提升。

目前小球藻原生質體的制備并未達到成熟階段[18]。由于小球藻細胞壁成分復雜多樣，利用單一種類的酶對細胞壁進行酶解并不能達到理想效果，研究者開始利用不同種類的酶以不同比例混合對小球藻細胞進行酶解，以期達到良好的原生質體獲取率。早在1982年，Yamada等[19]已經成功制備出小球藻原生質體，并發(fā)現不同藻株之間細胞壁結構可能存在差異；Hatano等[20]以酶液混合物獲得橢圓小球藻的原生質體；Cho等[21]用纖維素酶對小球藻進行酶解處理，也可以有效去除細胞壁；Kumar等[22]先對小球藻酶解后再進行電擊轉化，成功將青色熒光蛋白(CFP)基因和綠色熒光(GFP)基因在其中進行整合表達。也有研究者通過在培養(yǎng)基中添加2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)增加細胞通透性，以此更高效制備原生質體。謝偉民等[23]發(fā)現，經過2-DG預培養(yǎng)的小球藻酶解處理獲得的原生質體轉化效率明顯高于未經2-DG預培養(yǎng)的小球藻原生質體。陳波[24]將普通小球藻在酶解前用2-DG預處理，得到了37%的原生質體形成率。

1.2 選擇標記的篩選

在小球藻基因轉化系統(tǒng)中，選擇合適的選擇標記基因十分關鍵。目前的選擇標記基因缺乏多樣性，通常使用抗生素進行標記篩選，利用對受體細胞致死的抗生素培養(yǎng)基來選擇含有抗生素抗性基因的質粒穩(wěn)定轉染細胞。小球藻中常用的選擇標記基因主要包括nptⅡ(產生G418、卡那霉素、新霉素抗性)[25]、ble(產生博來霉素抗性)[17]、hpt(產生潮霉素抗性)[26]和cat基因(產生氯霉素抗性)[27]。部分常用抗生素對不同小球藻最佳作用質量濃度見表1。

在小球藻的篩選中要本著篩選標記對小球藻的作用劑量小、除菌效果良好且對小球藻生長不產生影響的原則，以提高篩選效果[35]。綜合目前研究可見，試驗中常用的篩選標記是G418和潮霉素，但不同種類并不完全一致(表1)。

表1 部分抗生素對不同種類小球藻最佳作用質量濃度Tab.1 The optimal concentration of some antibiotics for different species of green alga Chlorella

1.3 轉化方法的選擇

Jarvis等[37]于1991年首次利用聚乙二醇(PEG)融合法在橢圓小球藻中成功表達出熒光素酶。Dawson等[38]于1997年在硝酸還原酶基因缺失的小球藻(C.sorokiniana)突變藻株中利用粒子轟擊的方法將硝酸還原酶基因導入宿主并且表達，得到了可以在硝酸鹽環(huán)境中生長的轉化株。當前研究對小球藻經常使用的轉化方法主要為農桿菌(Agrobacterium)介導法[32]、電擊法[26]、粒子轟擊法[39]以及PEG融合法[37]。分別簡要闡述4種轉化方法及其優(yōu)缺點，同時分析并展望新型轉化方法。

1.3.1 農桿菌介導法

農桿菌介導的遺傳轉化已經在部分微藻中成功應用，是一種可行的小球藻轉化方法。這種方法通常在植物中表現為低基因拷貝數的高比例轉化[40]。作為一種自然界中天然存在的轉化方法，農桿菌介導法對設備要求低、轉化效率高、外源基因易整合，但轉化過程中操作步驟復雜、轉化后小球藻需要進行除菌處理。

Cha等[32]等使用含有綠色熒光蛋白基因∶β-葡萄糖苷酸酶基因(GFP∶GUS)的融合報道基因和花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子驅動的潮霉素磷酸轉移酶的二元載體pCAMBIA1304通過農桿菌在小球藻中進行表達，在確定乙酰丁香酮含量、農桿菌與藻細胞共培養(yǎng)時間、溫度等條件后，得到25%GUS陽性藻細胞。在Ma等[25]的研究中，透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)也通過農桿菌介導的方法被轉入小球藻中，明顯改善了小球藻的細胞生長和葉黃素產量。Lou等[16]將β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtRB)和玉米黃素剪切雙加氧酶基因(ZCD1)利用農桿菌在小球藻中表達，使其可以產生藏花酸。目前農桿菌介導的轉化體系的影響因素主要包括：小球藻預培養(yǎng)時間、農桿菌狀態(tài)和含量以及共培養(yǎng)的條件等，可以通過優(yōu)化以上參數提高轉化效率[32]。

1.3.2 電擊法

電擊法是小球藻轉化系統(tǒng)中較為常用的轉化方法。此方法是利用外界的物理力量，在適當的條件和含量下通過對細胞施加短時間的高強度電場而打開短時間的微孔，從而達到將外源基因運送到細胞中并且進行基因整合的目的。電擊轉化過程中緩沖液濃度、藻細胞培養(yǎng)周期、DNA濃度等因素均對轉化效率有重要的影響[41]。

牟云等[42]通過構建電擊轉化體系在沙漠小球藻中成功表達人乳鐵蛋白。Zhang等[43]通過電穿孔的方法將來自大豆的轉錄因子GmDof4基因轉化到小球藻中，脂質含量顯著提高46.4%～52.9%。另外，在一些研究中，為了防止可能出現因小球藻細胞壁較厚而導致轉化效率偏低的情況，制備原生質體再進行電穿孔也是一種可行的方法[22]。電擊法操作相對簡單、轉化效率高且具有可重復性。雖然電擊法因其高強度的電場可以瞬間將外源基因導入細胞中，但一些情況下因其電場強度過高也可能出現細胞轉化偶然性、細胞死亡率升高的情況。因此，電場強度的控制十分重要。

1.3.3 聚乙二醇融合法

聚乙二醇融合法是一種簡單有效的轉化方法。主要是將包括外源DNA、小球藻原生質體、聚乙二醇和玻璃珠混合在一起進行攪拌。借助聚乙二醇將原生質體暴露于外源DNA中，促進DNA滲入細胞中。該方法與電擊法相比轉化效率相對較低[44]，但因其操作簡單、成本低廉且不需要專門的設備，仍具有一定優(yōu)勢。

在一些小球藻中，已經利用該方法進行轉化表達。Yang等[45]通過表達增強型綠色熒光蛋白(EGFP)成功構建聚乙二醇介導的小球藻轉化體系。Hawkins等[46]曾采用聚乙二醇轉化法將人生長激素基因(hGH)在小球藻中進行了瞬時表達，并檢測到hGH表達量有所提高。

1.3.4 基因槍法

基因槍法是一種廣泛使用和有效簡單的可重復的轉換方法。這種方法幾乎適用于所有類型，包括細胞壁堅硬的小球藻。該方法將外源DNA包裹在微米級的鎢粉或金粉中，然后在真空狀態(tài)下通過粒子轟擊槍加速對受體細胞進行轟擊，實現外源基因的轉化[38]。一些研究證明粒子轟擊對小球藻的轉化有效，El-Sheekh等[47-48]分別在小球藻(C.kessleri)和橢圓小球藻中成功表達GUS基因。

基因槍法主要受轟擊壓力、轟擊距離、載體情況及DNA含量等因素影響[47]。這種方法操作簡單、試驗周期短，但其局限性在于使用儀器昂貴、轉化效率偏低，而且考慮到小球藻的直徑為3～12 μm，需要使用較小尺寸的微粒使其更容易進入小球藻細胞內。

1.3.5 納米磁珠轉化法

隨著生物技術與物理技術迅速交叉發(fā)展，納米技術在生物領域的應用越來越廣泛，具有基因運載功能的納米載體已經成功運用到動物細胞、醫(yī)學等領域。納米磁珠傳遞法作為一種新型轉化方法，主要表現為納米磁性顆粒攜帶核酸在磁力作用下進行磁力傳遞，在短時間內將目的基因遞送至靶細胞，目前納米載體表現出轉染效率高、操作方便等優(yōu)點[49]。美國愛荷華州立大學的科學家首次報道利用納米二氧化硅多孔顆粒裝載基因及表達調控物質，成功轉化植物細胞，并獲得轉基因植株[50]。我國研究者通過納米磁珠介導法成功將外源基因在棉花[49]、牡丹[51]等植物中轉化表達。本實驗室開展了利用不同粒徑的納米磁珠對小球藻進行遺傳轉化的研究，得到了外源基因成功表達的陽性藻株(待發(fā)表)，同時為小球藻的轉基因方法提供了一個新的思路。

1.4 基因表達元件

小球藻遺傳轉化研究中通常使用的外源性啟動子有花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子[25,52-53]。玉米多聚泛素蛋白Ubiquitin和水稻肌動蛋白Actin也逐漸應用于促進外源基因在小球藻中的表達[17,43,54]。誘導型啟動子也在不斷地用于小球藻轉化表達的試驗中，Niu等[27]鑒定了來自三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)的編碼硝酸還原酶(NR)基因的啟動子，其可以在作為唯一氮源的硝態(tài)氮存在下驅動轉化的cat報告基因在小球藻中的誘導型表達。劉曉鵬[55]在吲哚乙酸(IAA)誘導條件下，利用應答植物生長素信號的DR5啟動子驅動GFP在小球藻內實現表達。

小球藻自身的內源性啟動子同樣具有驅動小球藻轉化表達的功能。Liu等[56]證明，小球藻八氫番茄紅素去飽和酶(PDS)基因啟動子、硝酸還原酶(NIT)基因啟動子和來源于核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基(RBCS)基因啟動子均能成功驅動PDS基因在小球藻表達。小球藻病毒啟動子也能夠驅動外源基因在小球藻中表達[57]。因此可以不斷開發(fā)小球藻病毒作為高效啟動子的重要來源來進行關于小球藻轉化的深入研究。

增強子可以激活靶啟動子的轉錄，和啟動子共同作用強化外源基因表達。Chen等[58]研究了5種不同啟動子對GUS基因轉化小球藻的影響，發(fā)現與來自煙草花葉病毒的Ω增強子串聯的Ubiquitin啟動子驅動GUS基因在小球藻中的表達效率高于其他啟動子，證明增強子可以增強小球藻的外源基因表達。一部分內含子也可能起到增強表達的功能，Liu等[56]在提高小球藻表達蝦青素含量的研究中發(fā)現，保留PDS基因的第一個內含子可以提高91%的表達效率。

隨著對小球藻研究的不斷深入，發(fā)現除了高效的轉化方法、轉化載體，外源基因插入后小球藻對外源基因的整合、轉錄等表達調控過程同樣對轉化結果產生影響[43]。由于小球藻基因工程起步晚，當前對小球藻中基因表達調控的機理尚未完全清楚，因此外源基因插入的機制、遺傳表達的修飾等問題是當前值得探討研究的重要方向。

2 外源蛋白表達

當前利用小球藻作為生物反應器使外源蛋白進行高效表達并未達到產業(yè)化生產規(guī)模，主要原因是外源蛋白表達不穩(wěn)定、表達產量不夠高甚至是微量的。因此目前的研究主要集中在利用不同方法轉化的外源基因表達量及其生物活性分析[59-60]。一些不同外源蛋白在小球藻中表達含量的差異見表2。

表2 不同外源蛋白在小球藻中表達量Tab.2 Expression of different exogenous proteins in green alga Chlorella

當前已經有越來越多不同種類外源蛋白成功在小球藻中進行表達，并呈現出一定活性(表2)，這證明小球藻在不同領域均具有巨大的潛力，同時提高外源基因在小球藻中的表達活力也成為一項必不可少的工作。

3 展 望

作為一種應用前景廣泛的工業(yè)藻種，近年來關于外源基因在小球藻中轉化表達的研究不斷更新，豐富了小球藻生產有價值化合物的可能性。目前小球藻遺傳轉化工作還存在以下瓶頸有待解決：(1)小球藻遺傳信息與種質信息不夠清晰；(2)轉化體系和方法有待進一步優(yōu)化；(3)外源基因插入的表達調控機制對外源蛋白表達的影響。

對于外源基因在小球藻中高效表達體系的完善，可以從不同方面進行：(1)研究小球藻物種的遺傳信息、對小球藻自身功能性基因的克隆與分析，并將小球藻自身的一部分基因應用于其他高等植物或者微藻中的研究，有利于推進小球藻遺傳轉化的進程[62]。同時擴大當前已有的小球藻種類信息，獲得優(yōu)質小球藻藻種，并從中發(fā)現更具應用價值的物種，同樣可以加快小球藻生物技術的研究速度。(2)通過優(yōu)化現有轉化體系參數及開發(fā)新型小球藻轉化方法改善外源基因在小球藻中的表達效果。在轉化過程中開發(fā)利用新型高效啟動子、增強子等相關元件，制備高活力原生質體，對轉化方法中的關鍵步驟進行工藝改善，以及對轉化成功的藻種發(fā)酵條件優(yōu)化等小球藻轉化體系上游和下游工作的改進對于外源基因在小球藻中表達效率的提高十分關鍵。同時在優(yōu)化現有轉化體系參數的基礎上，不斷研發(fā)安全高效的新型轉化方法，可以從不同途徑改善小球藻轉化過程中存在的不足。將新型納米載體技術應用于小球藻轉化研究中，不但可以簡化傳統(tǒng)轉化方法的操作步驟，同時在提高轉化效率方面存在優(yōu)勢。(3)外源基因插入后的轉錄、翻譯、翻譯后修飾機制，外源蛋白是否被水解對高效表達產生重要影響。外源基因未表達的情況可能是由于存在多基因整合以及轉錄基因沉默(TGC)或轉錄后基因沉默(PTGC)機制，這種機制在其他植物中出現，推測可能在小球藻中也會發(fā)生類似情況。外源重組蛋白通常被宿主細胞識別為外來細胞，相比于內源蛋白有可能更快地發(fā)生降解[63]，推測小球藻外源基因轉化產物產量不高，可能部分是由此造成的。因此，深入探究小球藻轉化過程的分子機制有助于清晰外源基因在小球藻中的表達修飾等情況。

小球藻作為外源基因轉化宿主具有眾多優(yōu)點，在培養(yǎng)方面，可以在可控制的條件下高密度生長，短時間內積累大量生物活性物質；在應用方面，可以作為健康無毒害的功能食品直接使用，用作表達系統(tǒng)時可以對蛋白進行高水平的翻譯后修飾，而且翻譯后修飾機制與哺乳動物接近，因此可以用于生產如重組疫苗、抗體等有用物質，應用于水產、醫(yī)療等行業(yè)，這些使其相比于其他植物具有巨大的競爭優(yōu)勢。因此在優(yōu)化小球藻轉化系統(tǒng)和發(fā)展小球藻轉化方法等方向不斷努力取得良好進展，使其在產業(yè)化開發(fā)生產上不斷推進，在生物技術方面應用更加廣泛。