(廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣州 510110)

多肽在化妝品中的使用已有20 多年，僅2017年國(guó)內(nèi)與多肽相關(guān)的化妝品行業(yè)市場(chǎng)規(guī)模已經(jīng)達(dá)到34.02億元，產(chǎn)量約81.5 t[1-4]。生物活性多肽來源于皮膚中主要胞外蛋白的酶解，可調(diào)節(jié)膠原蛋白、彈性蛋白和黑色素的合成，有廣譜的抗微生物活性，被應(yīng)用于應(yīng)對(duì)皮膚老化和光老化、傷口愈合等問題。在生物活性多肽中引入酯基團(tuán)可極大地增進(jìn)其透膚性[5-7]。來源于細(xì)胞因子的棕櫚酰三肽-1、棕櫚酰五肽-3、棕櫚酰四肽-7和棕櫚酰六肽-12均被證明具有促進(jìn)膠原蛋白合成，改善皮膚老化的效果[6-11]。棕櫚酰五肽-3、棕櫚酰三肽-5 是合成信號(hào)多肽，可激活組織生長(zhǎng)因子(TGF-β)，促進(jìn)膠原蛋白合成[6，12-13]。因此，棕櫚酰多肽作為護(hù)膚類化妝品的功效原料被使用。

生物活性多肽的測(cè)定方法多為質(zhì)譜法。文獻(xiàn)[14]建立了雞湯中的肌肽和鵝肌肽測(cè)定方法，方法采用反相吸附劑材料去除雞湯中的鹽，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定目標(biāo)物。文獻(xiàn)[15]建立了化妝品中多肽的測(cè)定方法，樣品加入氯化鈉和乙酸后，用甲醇提取，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定目標(biāo)物。文獻(xiàn)[16]建立了化妝品中寡肽-20 和寡肽-24 的測(cè)定方法，樣品經(jīng)乙腈-甲酸銨緩沖鹽溶液提取后用液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定目標(biāo)物。文獻(xiàn)[17]建立了測(cè)定化妝品中六肽的基質(zhì)輔助激光解吸-質(zhì)譜法。

本工作采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定護(hù)膚類化妝品中棕櫚酰五肽-3、棕櫚酰四肽-7、棕櫚酰三肽-1、棕櫚酰三肽-5、棕櫚酰六肽-12等5種棕櫚酰多肽的含量，方法的建立對(duì)化妝品質(zhì)量監(jiān)管具有重要意義。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000-TSQ Quantiva 型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀；Minishaker MS3 digital型渦旋混合儀；SK 8200H 型超聲波清洗儀；Mill-Q 型超純水儀。

棕櫚酰五肽-3、棕櫚酰四肽-7和棕櫚酰三肽-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1.00 g·L－1，分別稱取適量的棕櫚酰五肽-3、棕櫚酰四肽-7和棕櫚酰三肽-1的標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用80%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇溶液定容，搖勻，于4 ℃存放。

棕櫚酰三肽-5和棕櫚酰六肽-12的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1.00 g·L－1，分別稱取適量的棕櫚酰三肽-5和棕櫚酰六肽-12的標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 容量瓶中，用乙醇定容，搖勻，于4 ℃存放。

5種棕櫚酰多肽的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:20.0 mg·L－1，分別移取適量的5 種棕櫚酰多肽的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于10 mL容量瓶中，用90%甲醇溶液定容，搖勻，于4 ℃存放。

提取劑:含0.1 mol·L－1乙酸銨的95%甲醇溶液。

棕櫚酰五肽-3標(biāo)準(zhǔn)品和棕櫚酰四肽-7 標(biāo)準(zhǔn)品的純度均為94%，棕櫚酰三肽-1和棕櫚酰三肽-5標(biāo)準(zhǔn)品的純度均為93%，棕櫚酰六肽-12標(biāo)準(zhǔn)品的純度為91%。

甲醇、乙醇、乙腈、乙酸均為色譜純；乙酸銨為分析純；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 LIChrospher?60RP-select B色譜柱(4.6 mm×150 mm，5μm)；流量1.0 mL·min－1；進(jìn)樣體積5μL。流動(dòng)相:A 為含0.3%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙酸的50 mmol·L－1乙酸銨溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序:0～6 min時(shí)，B 由50%升至65%；6～7 min時(shí)，B由65%升至95%，保持3 min；10～11 min時(shí)，B由95%降至50%，保持5 min。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式和正離子模式；噴霧電壓3 000 V；氣化器溫度320℃，傳輸管溫度325℃；選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式。其余質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

對(duì)于乳液樣品和膏霜樣品，稱取約0.2 g樣品于刻度管中，用提取劑定容至10.0 mL，渦旋0.5 min，超聲提取20 min，取出冷卻至室溫。提取液經(jīng)濾膜過濾后，取濾液按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

對(duì)于水劑樣品，稱取約0.2 g樣品，用提取劑定容至5.0 mL，渦旋混勻。提取液經(jīng)濾膜過濾后，取濾液按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 結(jié)果計(jì)算

樣品中目標(biāo)物含量按公式(1)計(jì)算:

式中:w為目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg·kg－1；ρ為樣品分析結(jié)束后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的目標(biāo)物的質(zhì)量濃度，μg·L－1；V為定容體積，m L；m為稱樣量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按儀器工作條件對(duì)200.0μg·L－1的5種棕櫚酰多肽的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，5種棕櫚酰多肽混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1。

2.2 儀器工作條件的選擇

因?yàn)樽貦磅６嚯木哂幸欢ǖ碾x子性，所以棕櫚酰多肽尤其是棕櫚酰五肽-3、棕櫚酰三肽-1、棕櫚酰三肽-5在常規(guī)的C18色譜柱中有拖尾效應(yīng)，即使采用50 mmol·L－1乙酸銨溶液作為流動(dòng)相的水相，拖尾效應(yīng)仍較嚴(yán)重。耗材調(diào)研發(fā)現(xiàn):LIChrospher?60RP-select B 堿性化合物分析專用色譜柱的鍵合相為改性C8疏水基團(tuán)，孔徑6 nm，可以大大降低表面硅醇基團(tuán)暴露在流動(dòng)相中的幾率，改善堿性化合物的拖尾效應(yīng)。試驗(yàn)選用LIChrospher?60RP-select B色譜柱。

試驗(yàn)考察了流動(dòng)相的水相依次為0，10，20，50，100 mmol·L－1乙酸銨溶液時(shí)對(duì)5種棕櫚酰多肽測(cè)定的影響。結(jié)果表明:乙酸銨的濃度為50，100 mmol·L－1時(shí)，5 種棕櫚酰多肽的拖尾效應(yīng)很弱，但是乙酸銨溶液濃度為100 mmol·L－1時(shí)，5種棕櫚酰多肽的響應(yīng)顯著降低。試驗(yàn)選擇乙酸銨的濃度為50 mmol·L－1。試驗(yàn)還考察了50 mmol·L－1乙酸銨溶液中乙酸的體積分?jǐn)?shù)依次為0，0.1%，0.2%，0.3%時(shí)對(duì)5種棕櫚酰多肽測(cè)定的影響。結(jié)果表明:乙酸的體積分?jǐn)?shù)為0.3%時(shí)，5種棕櫚酰多肽的響應(yīng)最大，且信噪比得到了很大的改善。試驗(yàn)選擇乙酸的體積分?jǐn)?shù)為0.3%。試驗(yàn)選擇流動(dòng)相的水相為含0.3%乙酸的50 mmol·L－1乙酸銨溶液。

圖1 5種棕櫚酰多肽混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution of 5 palmitoyl polypeptides

對(duì)流動(dòng)相的梯度洗脫程序進(jìn)行了適度優(yōu)化后，試驗(yàn)選擇的梯度洗脫程序見1.2節(jié)。在此梯度洗脫程序下，5 種棕櫚酰多肽的峰形尖銳，峰寬約0.2 min。

化合物母離子的離子源條件通過TSQ Quantiva 2.0 Tune軟件人工優(yōu)化得到，子離子選擇和碰撞電壓通過TSQ Quantiva 2.0 Tune軟件自動(dòng)優(yōu)化得到，試驗(yàn)選擇的質(zhì)譜條件見1.2節(jié)。

2.3 提取劑的選擇

棕櫚酰多肽在高含量的甲醇溶液中有較高的溶解度，且高含量的甲醇溶液可以將膏霜樣品和乳液樣品中常含有的黃原膠等膠質(zhì)沉淀下來，避免膠質(zhì)堵塞濾膜或色譜柱。在提取劑中加入乙酸銨可以更好地促進(jìn)棕櫚酰多肽的溶解，避免濾膜和儀器管路阻隔造成的吸附損失。試驗(yàn)采用的提取劑(含0.1 mol·L－1乙酸銨的95%甲醇溶液)既含有乙酸銨又含有高含量的甲醇。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

分別采用提取劑和空白基質(zhì)(乳液、膏霜)配制20.0μg·L－1的5種棕櫚酰多肽的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。用空白基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中化合物的響應(yīng)與提取劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)化合物的響應(yīng)的比值表示基質(zhì)效應(yīng)，5種棕櫚酰多肽的基質(zhì)效應(yīng)見表2。

表2 5種棕櫚酰多肽的基質(zhì)效應(yīng)Tab.2 Matrix effect of 5 palmitoyl polypeptides

由表2可知:基質(zhì)效應(yīng)可以忽略。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定下限

移取適量的5種棕櫚酰多肽的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用提取劑稀釋，配制成0，2.0，4.0，10.0，20.0，40.0，100.0，200.0μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按儀器工作條件對(duì)上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:5種棕櫚酰多肽的質(zhì)量濃度均在2.0～200.0μg·L－1內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。

根據(jù)10倍信噪比計(jì)算方法的測(cè)定下限(10S/N)，結(jié)果為2.0μg·L－1。

表3 線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab.3 Linear regression equations and correlation coefficients

2.6 準(zhǔn)確度和精密度

按試驗(yàn)方法對(duì)水劑、乳液、膏霜等3種空白護(hù)膚類化妝品樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表4。

由表4可知:回收率為89.4%～111%，RSD 為1.1%～10%，方法的準(zhǔn)確度和精密度較好。

加標(biāo)空白膏霜樣品的色譜圖見圖2。

2.7 樣品分析

按試驗(yàn)方法對(duì)7批廣州某品牌護(hù)膚類化妝品樣品進(jìn)行分析，樣品中均未檢出5種棕櫚酰多肽。

表4 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.4 Results of tests for accuracy and precision(n＝6)

本工作建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定護(hù)膚類化妝品中5種棕櫚酰多肽的分析方法。方法操作簡(jiǎn)便，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于護(hù)膚類化妝品中5種棕櫚酰多肽含量的測(cè)定。本方法可為國(guó)內(nèi)化妝品行業(yè)的產(chǎn)品研發(fā)和產(chǎn)品質(zhì)量控制提供重要技術(shù)支撐，對(duì)護(hù)膚類化妝品中其他棕櫚酰多肽產(chǎn)品的分析有一定的參考意義，具有較好的應(yīng)用前景。

圖2 加標(biāo)空白膏霜樣品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank cream sample mixed with standards