張正英，張漢青，劉海珍，郝云晴，趙維章，黃文穎，林元清，沈得貴，都占林，李 靜，蔡金山

（青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，青海 西寧 810001）

動(dòng)物體內(nèi)的鈣、磷均靠飼料供給，在體內(nèi)不能合成，也不能由其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來。鈣和磷占動(dòng)物機(jī)體總灰分的70 % 以上，動(dòng)物體總鈣量的99 % 以上和總磷量80 %～85 % 存在于骨骼和牙齒中[1]，以維持骨骼和牙齒的正常硬度。其余的鈣主要分布在細(xì)胞外液（血漿和組織間液）中，動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)鈣的含量很少[2]。其余的磷則在細(xì)胞外液中和細(xì)胞內(nèi)分布，當(dāng)血液中鈣磷代謝發(fā)生紊亂，會(huì)促使骨骼脫鈣，使血液中鈣、磷含量正常或升高，此時(shí)檢測血液中鈣、磷含量正?；蛏?，但骨骼已處于營養(yǎng)不良狀態(tài)，導(dǎo)致骨骼的正常結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，硬度、密度、韌性、負(fù)重能力都降低，使骨骼脆弱、變形、腫大，骨骺表面粗糙不平，容易骨折[3-4]。

在當(dāng)?shù)卣畢f(xié)調(diào)下，青海省動(dòng)物疫控中心組織了24名技術(shù)人員對發(fā)病區(qū)蒙古村、東衛(wèi)村、黑科村、哈乙亥村等4個(gè)村17 282（頭只）牛羊發(fā)病情況開展了流行病學(xué)調(diào)查，并對發(fā)病羊進(jìn)行標(biāo)記，采集血液，先期對可能導(dǎo)致牙齒異常脫落疾病因子含量的排它性實(shí)驗(yàn)室檢測，因此做好血清鈣、磷的檢測對疾病的診斷、防范，及治療有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品 在青海省共和縣倒淌河鎮(zhèn)地區(qū)，結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，選擇與發(fā)病區(qū)地理?xiàng)l件相似、未發(fā)病地區(qū)的臨床健康羊30只為對照組A，選擇發(fā)病區(qū)臨床癥狀較輕和癥狀不明顯的羊30只為輕癥組B，選擇發(fā)病區(qū)臨床癥狀嚴(yán)重的羊30只為重癥組C，采集3個(gè)組羊全血樣本90份，3 500 r/min離心10 min，取上清液分裝，置于-20 ℃ 冰箱保存，進(jìn)行總鈣、磷含量檢測。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 原子吸收分光光度計(jì)PE700（美國珀金埃爾默公司），紫外可見分光光度計(jì)752N（北京普析通用），鈣元素空心陰極燈，德國超純水機(jī)（德國密尼博純水機(jī)）。

1.1.3 化學(xué)試劑 高純氧化鑭，鹽酸優(yōu)級純，硫酸優(yōu)級純，磷酸二氫鉀優(yōu)級純，三氯醋酸優(yōu)級純，鉬酸銨分析純，硫酸亞鐵分析純，鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液1 000 μg/ml國家標(biāo)物中心。

1.2 方法

1.2.1 血清中鈣的測定 用火焰原子吸收分光光度法。（1）儀器工作條件：波長422.8 nm，燈電流3 mA，狹縫0.7 L，空氣流量120 ml/min，乙炔流量120 ml/min。（2）鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度：鈣標(biāo)準(zhǔn)溶 液度 梯度為 0.05 μg/ml，1.0 μg/ml，2.0 μg/ml，3.0 μg/ml，5.0 μg/ml。（3）測定方法：取血清0.1 ml，加無鹽氧化鑭溶液3.9 ml，混勻，同時(shí)做試劑空白對照，將鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品處理液導(dǎo)入火焰，上機(jī)測試，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 血清中磷的測定 用還原鉬藍(lán)測定法。（1）測定方法：取血清0.4 ml，緩慢加入0.6 mol/L三氯醋酸溶液7.6 ml，邊加邊搖，充分混勻，放置10 min，3 000 r/min離心5 min，取上清液，按表1順序依次加入相應(yīng)試劑，混勻，放置10 min，用波長620 nm進(jìn)行比色，空白管調(diào)零，讀取各管吸光度。（2）結(jié)果計(jì)算：血清磷濃度（mmol/L）=實(shí)測值/標(biāo)準(zhǔn)值×0.129×5。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 檢測結(jié)果用Excel表格創(chuàng)建數(shù)據(jù)庫，輸入SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 磷測定試劑加入順序表

2 結(jié)果與分析

2.1 血清鈣含量

對照組血清鈣含量范圍為 123.28～228.60 mg/kg，平均值為176.10 mg/kg；輕癥組99.35～ 192.85 mg/kg，平均值為162.11 mg/kg，重癥組含量范圍為120.31～230.92 mg/kg，平均值為151.84 mg/kg；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析血清鈣含量對照組與重癥組差異極顯著（P＜0.01）；對照組與輕癥組差異顯著（P＜0.05）；重癥組與輕癥組差異不顯著（P＞0.05），結(jié)果見表2。

表2 血清鈣測定結(jié)果

2.2 血清鈣加標(biāo)回收結(jié)果

每一組檢測樣品，平行制備6份血清檢測溶液，其中3份加入待測元素鈣，上機(jī)檢測，通過計(jì)算并求其平均值，回收率分別為對照組99.25 %，輕癥組97.34 %，重癥組97.88 %。

2.3 血清磷檢測結(jié)果

對照組血清磷含量范圍為0.49～3.64 mmol/L，平均值為 1.64 mmol/L；輕癥組 0.94～2.84 mmol/L，平均值為1.85 mmol/L，重癥組含量范圍為 0.89～3.29 mmol/L，平均值為1.96 mmol/L。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析血清磷含量對照組與重癥組差異極顯著（P＜0.01）；對照組與輕癥組差異顯著（P＜0.05）；重癥組與輕癥組差異不顯著（P＞0.05）。

表3 血清磷測定結(jié)果

4 討論

（1）通過本實(shí)驗(yàn)測定，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得出血清鈣含量對照組與重癥組差異極顯著（P＜0.01）；對照組與輕癥組差異顯著（P＜0.05），血清磷含量對照組與重癥組差異極顯著（P＜0.01）；對照組與輕癥組差異顯著（P＜0.05）。（2）與發(fā)病區(qū)地理?xiàng)l件相似，未發(fā)病區(qū)內(nèi)健康羊血清鈣含量明顯高于病區(qū)的羊，未發(fā)病區(qū)內(nèi)健康羊血清磷含量明顯低于發(fā)病區(qū)的羊。動(dòng)物體內(nèi)99 % 的鈣和85 % 的磷都沉積在骨骼和牙齒中[5]，飼料中的鈣磷主要在小腸被吸收，經(jīng)血液循環(huán)運(yùn)行到骨骼和全身其他組織以保證骨骼中鈣磷的需求平衡，同時(shí)骨骼中的鈣磷也不斷進(jìn)行分解更新，釋放出鈣磷進(jìn)入血液，共同調(diào)節(jié)血鈣、血磷的動(dòng)態(tài)平衡[6]，由于機(jī)體鈣磷代謝發(fā)生紊亂，導(dǎo)致血液中鈣含量下降，間接的刺激甲狀旁腺激素的分泌，導(dǎo)致骨骼中的鈣鹽被溶解以維持血鈣的正常水平，從而使骨骼發(fā)生明顯的脫鈣[7]，導(dǎo)致骨骼的正常結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，硬度、密度、韌性、負(fù)重能力都降低，使骨骼脆弱、變形、腫大，骨骺表面粗糙不平，容易骨折。（3）血清樣品組成非常復(fù)雜，對其中無機(jī)元素的測定要扣除元素之間的干擾，本研究在測定血清鈣時(shí)采用無鹽氧化鑭溶液作為測試介質(zhì)，有利于測試液形成穩(wěn)定均一的體系，直接用血清稀釋上機(jī)測試[8]，避免了消解過程中帶來的誤差，因此本方法測定簡單、快速、安全、準(zhǔn)確，取少量血清樣品即測試分析，完全能滿足實(shí)驗(yàn)室檢測的需要。（4）還原鉬藍(lán)法測定血清磷呈色反應(yīng)穩(wěn)定，特異性較高，操作簡便，線性范圍較廣，完全滿足實(shí)驗(yàn)室檢測工作需要。