張國淼 蘇成宇 俞潔 謝雨欣 張美琪 官杰

【摘要】 目的：探討槐白皮提取物對口腔潰瘍大鼠的治療效果及作用機制。方法：雄性SD大鼠54只，適應性飼養(yǎng)7 d后隨機抽取9只作為正常組，其余大鼠制作口腔潰瘍模型后隨機分為模型組、槐白皮提取物低、中、高濃度組和左旋咪唑組。正常組、模型組給予生理鹽水，槐白皮提取物低、中、高濃度組分別給予槐白皮提取物（20、35、50 mg/mL），左旋咪唑組給予左旋咪唑（2 mg/mL），連續(xù)灌胃給藥7 d，1次/d，2 mL/次。分別在給藥第1、3、7天記錄各組大鼠口腔潰瘍充血程度、感染程度和最大橫徑、最大縱徑，計算潰瘍面積;實驗結束后每組各取一只大鼠黏膜組織HE染色觀察組織形態(tài)學變化;ELISA法檢測大鼠血清中IL-17、IL-18、IL-35、IL-37水平并測量大鼠脾系數(shù)。結果：給藥第1、3、5、7天，其余造模各組口腔潰瘍面積與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;給藥第7天，槐白皮提取物高濃度組口腔潰瘍面積與給藥第1天比減?。≒<0.05）;給藥第7天，與模型組比較，左旋咪唑組潰瘍表面感染程度減輕、槐白皮提取物低濃度組潰瘍充血程度減輕（P<0.05）;模型組病理切片可見大量炎細胞浸潤，槐白皮提取物低、中、高濃度組、左旋咪唑組均出現(xiàn)不同程度修復;與模型組比較，槐白皮提取物中、高濃度組大鼠血清IL-17、IL-18水平均降低，槐白皮提取物低、中、高濃度組IL-35水平均升高（P<0.05）;各組IL-37水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論：槐白皮提取物可減輕大鼠口腔潰瘍充血程度，加速愈合，對大鼠口腔潰瘍有治療效果，機制可能與降低炎癥反應中的IL-17、IL-18水平，提高IL-35水平，調節(jié)大鼠免疫功能有關。

【關鍵詞】 槐白皮提取物 口腔潰瘍 大鼠 IL-17 IL-18 IL-35 IL-37

Effect of Sophora Japonica Water Extract in the Treatment of Rats with Oral Ulcers and Its Influence on Inflammatory Factors/ZHANG Guomiao， SU Chengyu， YU Jie， XIE Yuxin， ZHANG Meiqi， GUAN Jie. //Medical Innovation of China， 2021， 18（34）： 0-019

[Abstract] Objective： To investigate the therapeutic effect and mechanism of Sophora Japonica Water Extract on rats with oral ulcers. Method： After 7 d of adaptive-feeding， nine of fifty-four male SD rats were randomly selected as the normal group， the other rats were randomly divided into the model group， low， medium and the high concentration of Sophora Japonica Water groups and Levamisole group after making oral ulcer model. The normal and model groups were given normal saline， while the low， medium and high concentration of Sophora Japonica Water groups were given 20， 35， 50 mg/mL of Sophora Japonica Water Extract respectively， the Levamisole group was given 2 mg/mL of Levamisole， intragastric administration continued with 2 mL per day for 7 d. The degree of oral ulcer congestion， infection and the maximum transverse and maximum longitudinal diameters of rats in each group were recorded on the 1st， 3rd and 7th day， respectively to calculate the ulcer area. Histomorphological changes were observed by HE staining of mucosal tissue obtained from one rat in each group at the end of the experiment. The levels of serum IL-17， IL-18， IL-35， and IL-37 were measured by ELISA and the rat spleen coefficient was measured. Result： On the 1st， 3rd， 5th and 7th day of administration， there were no significant differences in the area of oral ulcers in the remaining groups with ulcers compared to the model group （P>0.05）. On the 7th day of administration， the oral ulcer area was reduced in the high concentration of Sophora Japonica Water Extract group compared to the 1st day of administration （P<0.05）. At the same time compared with the model group， the extent of ulcer surface infection was reduced in the Levamisole group， the extent of ulcer congestion was reduced in the low concentration of Sophora Japonica Water Extract group （P<0.05）. The pathological sections of the model group showed a large number of inflammatory cell infiltration， which was restored to different degrees in the low， medium and high concentration of Sophora Japonica Water Extract groups and the Levamisole group. Compared with the model group， the levels of IL-17 and IL-18 in the serum of rats in the middle and high concentration of Sophora Japonica Water Extract groups decreased， while the levels of IL-35 in the low， middle and high concentration of Sophora Japonica Water Extract groups increased （P<0.05）. There was no significant difference in IL-37 levels among the groups （P>0.05）. Conclusion： Sophora Japonica Water Extract can reduce the area， decrease the extent of congestion， and accelerate healing of oral ulcers in rats， and the mechanism may be related to reducing the levels of IL-17 and IL-18 in inflammatory response， increasing the levels of IL-35， and regulating the immune function of rats.

[Key words] Sophora Japonica Water Extract Oral ulcer Rats IL-17 IL-18 IL-35 IL-37

First-author’s address： School of Stomatology， Qiqihar Medical University， Qiqihar 161000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.34.004

口腔潰瘍是一種常見的潰瘍性損傷疾病，主要臨床表現(xiàn)為周期復發(fā)性口腔黏膜潰瘍，可有明顯疼痛、燒灼感及口干，直接影響患者日常活動[1]。研究表明，口腔潰瘍的發(fā)生與自身免疫相關，血清細胞因子及免疫系統(tǒng)在口腔潰瘍中的作用及機制目前尚在探索[2-3]?？谇粷兡壳爸饕韵∫颉⒃鰪婓w質、對癥治療為主，臨床中有較多利用中草藥治療口腔黏膜疾病的范例[4]。中醫(yī)古籍《圣惠方》曾記載槐白皮治療熱病口瘡，相關文獻表明槐白皮水提物可以促進家兔口腔創(chuàng)傷愈合、提高免疫抑制小鼠的免疫功能，提示其適用于口腔潰瘍的治療[5]。本項研究建立動物口腔潰瘍模型，通過實驗探究槐白皮對口腔潰瘍大鼠炎癥細胞因子的作用機制，為槐白皮臨床應用及口腔潰瘍治療提供實驗依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠54只，220～260 g，購自遼寧長生生物技術有限公司，合格證號SCXK（遼）2020-0001，實驗操作符合醫(yī)學院動物倫理委員會要求。

1.2 藥品和試劑 槐白皮原料200 g，購自山皇草集神農(nóng)架山區(qū);冰醋酸（天津市凱通化學試劑有限公司20190712）、水合氯醛（天津市凱通化學試劑有限公司20190326）均購自龍沙區(qū)貝迪科教實驗用品經(jīng)銷處;ELISA試劑盒：白細胞介素-17（IL-17）（批號：20201223225）、白細胞介素-18（IL-18）（批號：20201223185）、白細胞介素-35（IL-35）（批號：20201223136）、白細胞介素-37（IL-37）（批號：20201223521）均購自廈門慧嘉生物科技有限公司。

1.3 儀器 酶標儀（Labsystems Multiskan MS 352型，芬蘭）、洗板機（Thermo Labsystems AC8，芬蘭熱電）、微量高速離心機（湘儀集團TG16W，中國）、隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏GNP-9080型，中國）。

1.4 藥物制備

1.4.1 槐白皮提取物的制備 200 g槐白皮加1.4 L水，90 min后濃縮至800 mL，1.05 L水倒入鍋中繼續(xù)濃縮90 min至600 mL，最后再加入800 mL，濃縮至1 L，即可得到200 mg/mL的槐白皮提取物，-20 ℃保存[5]。200 mg/mL的槐白皮提取物分別稀釋至20、35、50 mg/mL的溶液，4 ℃冷藏，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4.2 左旋咪唑的配置 左旋咪唑片用雙蒸餾水稀釋2 mg/mL的左旋咪唑溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配[6]。

1.5 動物模型制備 54只雄性SD大鼠，隨機數(shù)字表法抽取9只作為正常組，不做處理，其余大鼠以10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉。大鼠麻醉后，將3 mm×3 mm正方形濾紙片置于50%濃度冰醋酸5 s后，放置于大鼠下切牙唇側黏膜30 s，24 h后觀察大鼠口腔黏膜形成潰瘍，與正常組比較各組口腔潰瘍創(chuàng)面明顯，即模型建立成功[7]。

1.6 動物分組及給藥 造模成功后45只大鼠隨機數(shù)表法分為模型組、槐白皮提取物低、中、高濃度組、左旋咪唑組。各組連續(xù)給藥：正常組、模型組分別給予0.9%氯化鈉注射液2 mL灌胃，1次/d;槐白皮提取物低、中、高濃度組分別給予20、35、50 mg/mL槐白皮水提物共2 mL灌胃，1次/d;左旋咪唑組給予2 mg/mL左旋咪唑溶液2 mL灌胃，1次/d。連續(xù)給藥7 d后，禁食不禁水12 h，10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后固定于操作臺上，腹主動脈取血，在4 ℃下2 500 r/min離心15 min，取上層血清，于-80 ℃貯存、待用。

1.7 觀察指標與判定標準

1.7.1 潰瘍情況 （1）潰瘍面積測定：在24 h建模成功后分別在給藥第1、3和7天進行大體觀察，用游標卡尺測量潰瘍最大橫徑（D1）、最大縱徑（D2），計算潰瘍面積=0.25×π×D1×D2，π=3.14[8]。（2）潰瘍表面感染情況：Ⅰ度為表面無明顯假膜;Ⅱ度為潰瘍表面有薄層黃白色假膜，周圍無水腫;Ⅲ度為潰瘍表面假膜較厚，且周圍伴有炎性水腫[9]。（3）潰瘍周圍充血程度：Ⅰ度為充血直徑<1 mm，Ⅱ度為充血直徑1～2 mm，Ⅲ度為充血直徑>2 mm但不超過4 mm，Ⅳ度為充血直徑>4 mm。

1.7.2 組織病理學 實驗結束，取每組一只大鼠右側頰部潰瘍處黏膜組織，于4%甲醛中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察其組織病理學變化。

1.7.3 細胞因子及免疫器官指數(shù) 采用ELISA法測定大鼠血清中IL-17、IL-18、IL-35、IL-37含量，嚴格按照試劑盒說明書操作;處死大鼠，打開腹腔取出脾臟，去除血液并用濾紙拭干，稱重并記錄。脾系數(shù)=脾臟質量（mg）/體質量（g）。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組方差齊時，用最小顯著法檢驗進行多組均數(shù)間兩兩比較;非正態(tài)分布計量資料用M（P25，P75）表示，使用非參數(shù)檢驗進行分析，使用Kruskal-Wallis檢驗進行多組間兩兩比較，使用兩配對樣本的Wilcoxon符號秩檢驗進行各組自身前后對照;等級資料采用Ridit檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 槐白皮提取物對口腔潰瘍大鼠口腔潰瘍指標的影響

2.1.1 槐白皮提取物對大鼠口腔潰瘍面積的影

響 給藥第1天，與正常組相比，其他組大鼠口腔潰瘍面積增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;但給藥第3、7天，槐白皮提取物高濃度組口腔潰瘍面積與正常組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;給藥第1、3、5、7天，模型組、槐白皮提取物低、中、高濃度組及左旋咪唑組兩兩口腔潰瘍面積比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;槐白皮提取物低濃度組給藥第3天口腔潰瘍面積大于給藥第1天，槐白皮提取物高濃度組給藥第7天口腔潰瘍面積小于給藥第1天，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.1.2 槐白皮提取物對冰醋酸口腔潰瘍感染程度的影響 采用Ridit檢驗，五組給藥第1、3、5天口腔潰瘍表面感染情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;五組給藥第7天口腔潰瘍表面感染情況比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），左旋咪唑組口腔潰瘍表面感染程度輕于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.1.3 槐白皮提取物對冰醋酸口腔潰瘍充血程度的影響 采用Ridit檢驗，五組給藥第1、3、5天口腔潰瘍充血程度比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;五組給藥第7天口腔潰瘍充血程度比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），槐白皮提取物低濃度組潰瘍充血程度輕于模型組（P<0.05）。見表3。

2.2 槐白皮提取物對口腔潰瘍大鼠組織病理形態(tài)學的影響 給藥7 d后將大鼠處死，取各組大鼠潰瘍的黏膜組織顯微鏡下觀察其病理變化。正常組：可以見到大鼠口腔黏膜組織層結構完整清晰，無炎細胞浸潤（圖1a）;模型組：可見大鼠口腔黏膜破壞，鱗狀上皮脫落，細胞排列紊亂，出現(xiàn)大量炎癥細胞（圖1b）;槐白皮提取物低濃度組：可見大鼠口腔黏膜上皮組織愈合，可見大部分組織被肉芽組織代替（圖1c）;槐白皮提取物中濃度組：可見大鼠口腔黏膜上皮組織愈合良好，部分組織被新生的膠原纖維覆蓋（圖1d）;槐白皮提取物高濃度組：可見大鼠口腔黏膜上皮基本愈合，黏膜下層有膠原纖維組織包裹，并有少量瘢痕組織形成，有少量中性粒細胞浸潤（圖1e）;左旋咪唑組：可見大鼠口腔黏膜上皮基本愈合，黏膜下層有瘢痕組織包裹，有少量中性粒細胞浸潤（圖1f）。

2.3 槐白皮提取物對口腔潰瘍大鼠血清中細胞因子及脾系數(shù)的影響 與正常組比較，模型組血清IL-17、IL-18水平均升高，IL-35水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，槐白皮提取物低濃度組血清IL-17、IL-18水平均降低、IL-35水平上升，槐白皮提取物中濃度組IL-35水平上升，槐白皮提取物高濃度組IL-17水平降低、IL-35水平上升，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與槐白皮提取物低濃度組比較，槐白皮提取物中、高濃度組和左旋咪唑組血清IL-18水平均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;六組血清IL-37水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;與模型組相比，槐白皮提取物低、中、高濃度組和左旋咪唑組脾系數(shù)均增大，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

作為常見、多發(fā)的口腔黏膜疾病，口腔潰瘍成因復雜，病因尚不明確[10]。在口腔潰瘍發(fā)病因素中，免疫因素占有重要地位，一般認為免疫功能紊亂使促炎因子與抑炎因子分泌失衡導致了炎癥反應的發(fā)生[11]?；卑灼は刀箍浦参?，含有山槐素、氧化苦參堿等活性成分，具有降壓抗菌、調節(jié)免疫等作用[12]。

本實驗建立口腔潰瘍模型，觀察發(fā)現(xiàn)槐白皮提取物對口腔潰瘍大鼠的臨床癥狀、口腔黏膜病理損傷具有改善作用，但不同濃度的槐白皮提取物對口腔潰瘍大鼠臨床癥狀改善情況不同。本實驗沒有充分證據(jù)說明槐白皮提取物對口腔潰瘍面積減小的作用，可能與面積數(shù)據(jù)測量難度有關，也可能與潰瘍愈合的過程有關，槐白皮提取物對口腔潰瘍面積具體作用有待進一步研究;槐白皮提取物對大鼠口腔感染程度未見明顯改善，對槐白皮提取物的抑菌作用有待進一步實驗探究;低濃度的槐白皮提取物能改善大鼠口腔的充血情況;槐白皮提取物也有利于潰瘍組織的修復和愈合，具體機制有待進一步研究。

IL-17和IL-18均為促炎細胞因子。IL-17是新發(fā)現(xiàn)的主要由Th17細胞、單核細胞等分泌的一種促炎癥細胞因子[13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，IL-17可通過IL-17RA或IL-17RE受體刺激口腔角質細胞，在復發(fā)性阿弗他潰瘍中產(chǎn)生促炎作用[14]。IL-18主要介導細胞免疫反應，顯著增加Th1型免疫反應[15]。IL-18在口腔疾病中可出現(xiàn)異常表達，可能與口腔相關炎癥性疾病的發(fā)病密切相關[16]。本實驗結果顯示，低濃度槐白皮提取物可顯著降低大鼠血清中IL-17、IL-18水平，高濃度槐白皮提取物可顯著降低大鼠血清中IL-17水平，提示槐白皮提取物可能通過降低血清促炎因子水平抑制口腔潰瘍炎癥反應，加速愈合?；卑灼ぬ崛∥锔邼舛冉M血清IL-17水平同樣顯著降低，但不如槐白皮提取物低濃度組降低的程度明顯，提示槐白皮提取物對IL-17、IL-18的作用可能與劑量有關。

IL-35被譽為最強抗炎因子，現(xiàn)有研究表明IL-35信號通路相關因子可能在口腔扁平苔癬、牙周炎的免疫發(fā)病機制中起一定作用，但在口腔潰瘍中的作用尚不明確[17-19]。本實驗低、中、高濃度槐白皮提取物均顯著提高IL-35水平，提示槐白皮可以通過提高抗炎細胞因子水平以達到抑制炎癥的作用。有研究報道，IL-37在慢性牙周炎患者牙周基礎治療后的齦溝液中濃度明顯提高，提示IL-37在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程中起一定作用[20]。但本實驗結果顯示，各組血清IL-37水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。提示血清IL-37水平在口腔潰瘍的炎癥反應中可能無直接意義。脾臟作為淋巴細胞接受抗原刺激并產(chǎn)生免疫反應的中心，脾系數(shù)能夠很好地反映免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)[21]。本實驗中槐白皮低、中、高濃度組和左旋咪唑組的脾系數(shù)均增高，提示低、中、高三種濃度的槐白皮提取物均可通過影響免疫器官和免疫細胞來提高機體免疫功能。

綜上所述，免疫功能紊亂與口腔潰瘍的形成密切相關，槐白皮提取物可顯著降低口腔潰瘍模型大鼠的潰瘍充血程度，加速潰瘍面愈合，是一種有效的治療口腔潰瘍的藥物，其機制可能與降低炎癥反應中的促炎因子IL-17、IL-18水平，提高抑炎因子IL-35水平、調節(jié)口腔潰瘍大鼠的免疫功能有關。

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（收稿日期：2021-09-03）

基金項目：黑龍江省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（202011230030）

①齊齊哈爾醫(yī)學院口腔醫(yī)學院 黑龍江 齊齊哈爾 161000

②齊齊哈爾醫(yī)學院精神衛(wèi)生學院

③齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)學技術學院

通信作者：官杰